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1、生物基因工程的基本操作程序第1页，共31页，编辑于2022年，星期一基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定第2页，共31页，编辑于2022年，星期一一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增
2、技术扩增（3 3）人工合成）人工合成第3页，共31页，编辑于2022年，星期一(1)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？什么是部分基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？因？第4页，共31页，编辑于2022年，星期一基因组文基因组文库与部分库与部分基因文库基因文库的关系的关系第5页，共31页，编辑于2022年，星期一（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应是一项生物是一项生物体外复制体外复制特
3、定特定DNA片段片段的核酸合成的核酸合成技术技术。通过此技术，可获取。通过此技术，可获取大量的目的基因。大量的目的基因。第6页，共31页，编辑于2022年，星期一PCR技术技术原理：原理：前提：前提：原料原料方式方式PCR扩增仪扩增仪DNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列：以：以_方式扩增，方式扩增，即即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）指数指数2 2n n模板模板DNA；DNA引物；四种脱氧核引物；四种脱氧核苷酸；热稳定苷酸；热稳定DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶酶第7页，共31页，编辑于2022年，星期一2、具体过程、具体过程第8页，共31页，编辑
4、于2022年，星期一n 过程变性、退火、延伸三步曲变性：变性：加热至加热至9095双双链链DNADNA解链成为单链解链成为单链DNADNA退火：退火：冷却至冷却至5560部部分引物与模板的单链分引物与模板的单链DNADNA的特的特定互补部位相配对和结合定互补部位相配对和结合延伸：延伸：加热至加热至7075以以目的基因为模板，合成互目的基因为模板，合成互补的新补的新DNADNA链链变性变性退火退火延伸延伸第9页，共31页，编辑于2022年，星期一（3）人工合成人工合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的
5、核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成第10页，共31页，编辑于2022年，星期一1、构建基因组、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的文库时，首先应分离细胞的A、染色体、染色体DNAB、线粒体、线粒体DNAC、总、总mRNAD、tRNA2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生片段，导入某个生物物体内，则这个
6、生物就是一个基因文库体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库文库AC第11页，共31页，编辑于2022年，星期一二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心（1 1）用一定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。（2 2）用）用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处，再加
7、入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程:第12页，共31页，编辑于2022年，星期一质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同种同种1.1.过程过程:第13页，共31页，编辑于2022年，星期一2、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代、使目
8、的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因启动子、终止子和标记基因等等第14页，共31页，编辑于2022年，星期一3.3.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启
9、动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的首端位于基因的首端,是是mRNA结合位点结合位点位于基因的末端位于基因的末端,终止终止转录转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞第15页，共31页，编辑于2022年，星期一常用的受体细胞：常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞第16页，共31页，编辑于202
10、2年，星期一1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对单子对单子叶植物无感染能力叶植物无感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细胞并可转移至受体细胞并整合到其染色体上整合到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌第17页，共31页，编辑于2022年，星期一（2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金基因枪
11、法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。单子叶植物常用，但成本较高。的方法。单子叶植物常用，但成本较高。第18页，共31页，编辑于2022年，星期一（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加然后，滴加DNA（含目的基因
12、），使目的基因借助花粉管通道进入受（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。体细胞。第19页，共31页，编辑于2022年，星期一2、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基因提纯含目的基因表达载体表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物第20页，共31页，编辑于2022年，星期一3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：Ca2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快繁殖快、多为单细
13、胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理处理大大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNA第21页，共31页，编辑于2022年，星期一1、基因工程常用的受体细胞有、基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌枯草杆菌支原体支原体动植物细胞动植物细胞ABCDD2.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是下列属于基因工程中导入目的基因方法的是农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管道法花粉管道法显微注射法显微注射法胚胎移植胚胎移植DNA分子杂交法分子杂交法ABCDC第22页，共31页，编辑
14、于2022年，星期一(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定第23页，共31页，编辑于2022年，星期一知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA
15、小片段用同位素、荧光分子或化学发光小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。第24页，共31页，编辑于2022年，星期一A2、应应用用基基因因工工程程技技术术诊诊断断疾疾病病的的过过程程中中必必须须使使用用基基因因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A用于检测疾病的医疗器械用于检测疾病的医疗器械B用放射性同位素或荧光分子等标记的用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子分子C合成
16、合成-珠蛋白的珠蛋白的DNAD合成苯丙羟化酶的合成苯丙羟化酶的DNA片段片段B1、基因工程是在、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因人工合成基因 B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C第25页，共31页，编辑于2022年，星期一4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （）A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因
17、时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A第26页，共31页，编辑于2022年，星期一原核细胞的基因结构
18、原核细胞的基因结构(补充内容）补充内容）非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子第27页，共31页，编辑于2022年，星期一真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶
19、结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核细真核细胞的胞的 基因结基因结构构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用,上游有启动子，下游有上游有启动子，下游有终止子终止子非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子第28页，共31页，编辑于2022年，星期一原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋
20、白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码第29页，共31页，编辑于2022年，星期一思考与探究：思考与探究：2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单要选择合适的农杆菌菌株，因
21、为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱区（诱导）的基因，使导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要
22、生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。中生产这种糖蛋白是不可能的。第30页，共31页，编辑于2022年，星期一4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常
23、时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？应如何进行设计？（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA)cDNA)。（2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取取-珠蛋白。珠蛋白。第31页，共31页，编辑于2022年，星期一