细胞与免疫学技术与原理.ppt

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1、关于细胞与免疫学技术与原理现在学习的是第1页，共187页 细胞工程是指应用细胞生物学和细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞水平上，按照人们的意愿来改变细胞的遗传特性和生物学特性，以获得的遗传特性和生物学特性，以获得新新型生物型生物或特种或特种细胞产品细胞产品的一门综合性科的一门综合性科学技术学技术。现在学习的是第2页，共187页第一节第一节 细胞融合技术细胞融合技术现在学习的是第3页，共187页动物方面动物方面组装鼠组装鼠 美国耶鲁大学教授马格

2、特美国耶鲁大学教授马格特和彼德斯利用黑毛鼠，白毛鼠，黄毛和彼德斯利用黑毛鼠，白毛鼠，黄毛鼠三种颜色的老鼠的受精卵组装成披鼠三种颜色的老鼠的受精卵组装成披着黄百黑三种颜色的老鼠。着黄百黑三种颜色的老鼠。绵山羊绵山羊 英国和美国还组装成功了绵英国和美国还组装成功了绵羊和山羊的嵌合体，培育出具有绵羊的羊和山羊的嵌合体，培育出具有绵羊的卷曲浓密的长毛，山羊式的仰角的绵山卷曲浓密的长毛，山羊式的仰角的绵山羊，毛肉兼用。羊，毛肉兼用。现在学习的是第4页，共187页植物方面植物方面薯番茄和番茄薯薯番茄和番茄薯人们用马铃薯和人们用马铃薯和番茄通过细胞融合获得杂种薯番番茄通过细胞融合获得杂种薯番茄和番茄薯茄和番

3、茄薯甘蓝型欧洲油菜甘蓝型欧洲油菜用甘蓝和白菜的用甘蓝和白菜的细胞融合使两个物种的染色体组细胞融合使两个物种的染色体组相加，人工合成了甘蓝型欧洲油相加，人工合成了甘蓝型欧洲油菜。菜。现在学习的是第5页，共187页微生物方面微生物方面苏云金杆菌能杀玉米螟，灭苏云金杆菌能杀玉米螟，灭蚊球孢菌有杀蚊子的效能，科学蚊球孢菌有杀蚊子的效能，科学家们将这两种菌的原生质体融合家们将这两种菌的原生质体融合获得了既获得了既能灭蚊又能杀螟的新菌能灭蚊又能杀螟的新菌株。株。现在学习的是第6页，共187页这些都是自然进化所不能出这些都是自然进化所不能出现的新品种，他主要是通过细胞现的新品种，他主要是通过细胞融合技术来实

4、现的。融合技术来实现的。细胞融合是细胞工程最基本的细胞融合是细胞工程最基本的核心技术。核心技术。现在学习的是第7页，共187页细胞融合（又称体细胞杂交）：细胞融合（又称体细胞杂交）：是指是指用自然或人工方法使两用自然或人工方法使两个或更多个不同的细胞融合成一个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。个细胞的过程。并使之分化再生、并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。形成新物种或新品种的技术。现在学习的是第8页，共187页融合材料融合材料 植物或微生物原生质体植物或微生物原生质体 动物单个细胞动物单个细胞现在学习的是第9页，共187页现在学习的是第10页，共187页生物法生物法仙台病毒法仙台

5、病毒法 19581958年年 日本日本 冈田善雄冈田善雄 紫外光灭活的紫外光灭活的仙台病毒仙台病毒可以诱发艾氏腹可以诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合；也可使两种不同的动物水瘤细胞相互融合；也可使两种不同的动物细胞之间发生凝集，进而融合成一体。细胞之间发生凝集，进而融合成一体。动物细胞融合中，仙台病毒为产生细动物细胞融合中，仙台病毒为产生细胞杂种的标准融合剂。胞杂种的标准融合剂。现在学习的是第11页，共187页病毒诱导的细胞融合的过程病毒诱导的细胞融合的过程首先是细胞表面吸附许多病毒粒子。首先是细胞表面吸附许多病毒粒子。接着是细胞发生凝集。接着是细胞发生凝集。几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞几分钟至

6、几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失。表面消失。最后就在这个部位邻接细胞的细胞最后就在这个部位邻接细胞的细胞膜融合，胞浆得以相互交流，最后形成膜融合，胞浆得以相互交流，最后形成融合细胞。融合细胞。现在学习的是第12页，共187页病病毒毒诱诱导导的的动动物物细细胞胞融融合合现在学习的是第13页，共187页病毒诱导的细胞融合的病毒诱导的细胞融合的缺点缺点制备困难；制备困难；每批病毒融合效价差别比较大，实验的每批病毒融合效价差别比较大，实验的重复性差重复性差；灭活不完全时，有病毒感染的灭活不完全时，有病毒感染的危险危险。融合率较低融合率较低现在学习的是第14页，共187页化学法化学法PEGPEG 优点

7、优点：聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）来源方便，使用简便）来源方便，使用简便活性稳定活性稳定诱导细胞融合的频率较仙台病毒高达数百倍诱导细胞融合的频率较仙台病毒高达数百倍诱导植物和动物细胞融合诱导植物和动物细胞融合现在学习的是第15页，共187页聚乙二醇的作用机理聚乙二醇的作用机理 PEG PEG的水溶性极强，在液相介质中，的水溶性极强，在液相介质中，它的许多醚键带有微弱负电荷；在它的许多醚键带有微弱负电荷；在CaCa2+2+参与下，参与下，PEGPEG将带正电荷的表面蛋白或带将带正电荷的表面蛋白或带负电荷的糖蛋白，通过负电荷的糖蛋白，通过CaCa2+2+桥连在桥连在起，起，使细胞发生聚集、融

8、合。使细胞发生聚集、融合。现在学习的是第16页，共187页 PEG PEG的作用与细胞表面结构间形的作用与细胞表面结构间形成离子键有关。成离子键有关。PEG PEG可与水分子借氢键结合，在可与水分子借氢键结合，在高浓度高浓度(50(50)的的PEGPEG溶液中自由水消失，溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变导致细胞脱水而发生质膜结构的变化化，由此引起细胞融合。，由此引起细胞融合。现在学习的是第17页，共187页化学诱导法的特点化学诱导法的特点优点：优点：具有细胞融合的通用性；与病毒比较，具有细胞融合的通用性；与病毒比较，容易制备和控制；活性稳定；使用方便。容易制备和控制；活性稳定；

9、使用方便。缺点：缺点：对细胞毒性很大；诱导产生杂交细对细胞毒性很大；诱导产生杂交细胞的频率仍在很低水平；不能在显微镜胞的频率仍在很低水平；不能在显微镜下观察细胞的融合过程。下观察细胞的融合过程。现在学习的是第18页，共187页物理法物理法电融合诱导法电融合诱导法概述：概述：在直流电脉冲的诱导下，原生质体质在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的膜表面的电荷和氧化还原电位电荷和氧化还原电位发生改变，发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭合成完裂，进而质膜开始连接，直到闭合成完整的膜形成融合体。整的膜形成融合体。现在学习的是第19

10、页，共187页细 胞细胞膜变薄细胞膜出现微孔细胞膜重新闭合细胞膜不能闭合电脉冲电脉冲电势不断上升电势不断上升达到临界膜电势达到临界膜电势微孔不大微孔不大微孔太大微孔太大现在学习的是第20页，共187页细胞电穿孔细胞电穿孔现在学习的是第21页，共187页细胞电融合细胞电融合现在学习的是第22页，共187页电场诱导的细胞融合电场诱导的细胞融合主要优点：主要优点：融合率高，融合率是融合率高，融合率是PEGPEG的的l00l00倍，对细胞伤害小。倍，对细胞伤害小。操作简便、快速，装操作简便、快速，装置精巧，方便简单，诱导过程可控制性强，置精巧，方便简单，诱导过程可控制性强，重复性强。重复性强。因为是物

11、理刺激，无残余毒性，因为是物理刺激，无残余毒性，可免去洗涤过程。可免去洗涤过程。具有普遍性，可用于动具有普遍性，可用于动物、植物和微生物等各类细胞。物、植物和微生物等各类细胞。可用显微可用显微镜或录像观察融合过程，探讨融合机理。镜或录像观察融合过程，探讨融合机理。现在学习的是第23页，共187页缺点：缺点：目前电融合技术存在的目前电融合技术存在的主要问题是融合细胞存活率主要问题是融合细胞存活率低。低。现在学习的是第24页，共187页1 1、利用基因定位绘制人类基因图、利用基因定位绘制人类基因图细胞融合技术的应用细胞融合技术的应用现在学习的是第25页，共187页(1)(1)小鼠小鼠人杂交细胞人杂

12、交细胞，人染色体，人染色体优先丢失，而只留下一条或少数几优先丢失，而只留下一条或少数几条人的染色体；条人的染色体；(2)(2)染色体分带技术染色体分带技术可以把人与鼠的可以把人与鼠的染色体区分开，而且能区别每一根人染色体区分开，而且能区别每一根人的染色体；的染色体；(3)(3)电泳技术电泳技术可以鉴别不同种动物的可以鉴别不同种动物的蛋白和酶。蛋白和酶。现在学习的是第26页，共187页2 2、利用杂交细胞生产活性物质、利用杂交细胞生产活性物质 单克隆抗体工业的兴起就是利单克隆抗体工业的兴起就是利用用B B淋巴细胞被特异的抗原刺激后淋巴细胞被特异的抗原刺激后能应答而分泌特异的抗体的特点同能应答而分

13、泌特异的抗体的特点同骨髓瘤细胞的长命不死的特点两者骨髓瘤细胞的长命不死的特点两者融而为一。融而为一。现在学习的是第27页，共187页推论：推论：可能利用胰脏细胞生产胰岛素，可能利用胰脏细胞生产胰岛素，利用甲状腺细胞生产甲状腺素，利用利用甲状腺细胞生产甲状腺素，利用垂体细胞生产生长激素、各种促性腺垂体细胞生产生长激素、各种促性腺激素、催乳素以及各种神经激素等。激素、催乳素以及各种神经激素等。还可以利用麝香腺细胞生产麝香。还可以利用麝香腺细胞生产麝香。现在学习的是第28页，共187页3 3、生产实践方面的应用、生产实践方面的应用（1 1）在生物医药上的应用）在生物医药上的应用 如：单克隆抗体的生产

14、如：单克隆抗体的生产（2 2）在微生物构建新菌株方面的应用）在微生物构建新菌株方面的应用 现在学习的是第29页，共187页 原生质体融合也成了微生物育种的重要手段。原生质体融合也成了微生物育种的重要手段。乳糖发酵短杆菌和黄色短杆菌是两种重要的氨基乳糖发酵短杆菌和黄色短杆菌是两种重要的氨基酸生产菌，酸生产菌，黄色短杆菌是赖氨酸高产菌株，但黄色短杆菌是赖氨酸高产菌株，但生长缓慢，发酵周期长，生产中易染菌生长缓慢，发酵周期长，生产中易染菌，将它，将它与与生长快的乳糖发酵短杆菌生长快的乳糖发酵短杆菌融合，得到了新的融合，得到了新的赖氨酸生产菌，提高了对葡萄糖的转化率，赖氨酸生产菌，提高了对葡萄糖的转化

15、率，发酵周期缩短发酵周期缩短4%4%。现在学习的是第30页，共187页对酱油酿制来说，曲霉的对酱油酿制来说，曲霉的蛋白酶蛋白酶对对谷氨谷氨酸酸（味鲜）的产量有很大的影响。过去在（味鲜）的产量有很大的影响。过去在改良和培育酱油曲霉菌种时，其主要目的改良和培育酱油曲霉菌种时，其主要目的是增加产酶能力，但由于是增加产酶能力，但由于产蛋白酶高的菌产蛋白酶高的菌株产谷酰胺酶的能力低，而产谷酰胺酶高的株产谷酰胺酶的能力低，而产谷酰胺酶高的菌株产蛋白酶的能力低。菌株产蛋白酶的能力低。人们把高产谷酰胺人们把高产谷酰胺酶和蛋白酶的两株菌原生质体融合，获得双酶和蛋白酶的两株菌原生质体融合，获得双高产的优良菌种。高

16、产的优良菌种。现在学习的是第31页，共187页（3 3）在水产动物遗传育种上的应用）在水产动物遗传育种上的应用 科学家把大鳞副泥鳅同鳗尾泥鳅杂交科学家把大鳞副泥鳅同鳗尾泥鳅杂交培育了融合鱼。培育了融合鱼。将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合，培育将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合，培育了融合鱼苗。这些融合鱼各具两对触须，形了融合鱼苗。这些融合鱼各具两对触须，形态类似鲤鱼。态类似鲤鱼。现在学习的是第32页，共187页（4 4）在植物新品种育种上的应用）在植物新品种育种上的应用 萝卜和甘蓝、粉蓝烟草和郎氏烟草、萝卜和甘蓝、粉蓝烟草和郎氏烟草、番茄和马铃薯、烟草和大豆、甘蔗和高粱、番茄和马铃薯、烟草和大豆、甘蔗和

17、高粱、芥菜和紫芸苦等，这些杂种植物采用有性芥菜和紫芸苦等，这些杂种植物采用有性杂交的方法是难以得到的。杂交的方法是难以得到的。我国科学家已培育出普通烟草与黄花我国科学家已培育出普通烟草与黄花烟草、普通烟草与粉蓝烟草、烟草与矮牵烟草、普通烟草与粉蓝烟草、烟草与矮牵牛、烟草与天仙子等种间和属间体细胞杂牛、烟草与天仙子等种间和属间体细胞杂种植株。种植株。现在学习的是第33页，共187页（5 5）在发酵工程中的应用）在发酵工程中的应用 日本科学家把两个不同种类的酵母强日本科学家把两个不同种类的酵母强行融合起来，并使融合成的细胞繁殖，制行融合起来，并使融合成的细胞繁殖，制成新的酵母。这一技术为今后改良酵

18、母开成新的酵母。这一技术为今后改良酵母开辟了新途径，把最尖端的生物工程中的细辟了新途径，把最尖端的生物工程中的细胞融合办法应用到传统的酿酒技术中，成胞融合办法应用到传统的酿酒技术中，成为守旧的酿造技术体系革新的一个起点。为守旧的酿造技术体系革新的一个起点。现在学习的是第34页，共187页 体细胞融合的技术，如体细胞融合的技术，如今已在动物间实现了小鼠和今已在动物间实现了小鼠和田鼠，小鼠和田鼠，小鼠和 小鸡，甚至于小鸡，甚至于小鼠和人等许多远小鼠和人等许多远 缘和超远缘和超远缘的体细胞杂交。缘的体细胞杂交。现在学习的是第35页，共187页利用细胞杂交技术来制备工程细胞生利用细胞杂交技术来制备工程

19、细胞生产活性物质的优点：产活性物质的优点：（1 1）细胞融合率比较高；）细胞融合率比较高；（2 2）操作也比基因工程简单；）操作也比基因工程简单；（3 3 3 3）所产生的蛋白都是已糖基化了的天然蛋白；）所产生的蛋白都是已糖基化了的天然蛋白；）所产生的蛋白都是已糖基化了的天然蛋白；）所产生的蛋白都是已糖基化了的天然蛋白；（4 4 4 4）动物细胞大批量生产技术的发展和改进与细胞内）动物细胞大批量生产技术的发展和改进与细胞内）动物细胞大批量生产技术的发展和改进与细胞内）动物细胞大批量生产技术的发展和改进与细胞内高效表达体系的建立，为动物细胞工程的蛋白生产开辟高效表达体系的建立，为动物细胞工程的蛋

20、白生产开辟高效表达体系的建立，为动物细胞工程的蛋白生产开辟高效表达体系的建立，为动物细胞工程的蛋白生产开辟新途径。新途径。新途径。新途径。现在学习的是第36页，共187页第二节第二节动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术 现在学习的是第37页，共187页 指人工培养条件下，在动物指人工培养条件下，在动物细胞生物反应器中高密度大量地细胞生物反应器中高密度大量地培养培养有用动物细胞有用动物细胞以生产珍贵以生产珍贵生物制品生物制品的技术。的技术。现在学习的是第38页，共187页 体外大规模培养真核细胞要比原体外大规模培养真核细胞要比原核细胞核细胞困难困难得多。得多。无细胞壁，不耐受搅拌，易破无

21、细胞壁，不耐受搅拌，易破碎，营养要求高，生长条件不易控碎，营养要求高，生长条件不易控制，增殖周期长，产品的产量低。制，增殖周期长，产品的产量低。现在学习的是第39页，共187页 原核细胞原核细胞经基因工程技术所合成经基因工程技术所合成的生物制品，不是分泌型的而是同的生物制品，不是分泌型的而是同细胞相结合的，需要破碎细胞，释细胞相结合的，需要破碎细胞，释出产物，再经浓缩、纯化；因后加出产物，再经浓缩、纯化；因后加工过程工过程复杂复杂，而使产品的得率受到，而使产品的得率受到损失损失。现在学习的是第40页，共187页 真核细胞真核细胞能对其分泌产物能对其分泌产物进行进行修饰修饰，例如二硫键的形成、，

22、例如二硫键的形成、糖甲酰化等，使产物具有完整糖甲酰化等，使产物具有完整的的生物学功能生物学功能。现在学习的是第41页，共187页 真核细胞真核细胞可以不断合成和分泌，可以不断合成和分泌，不断收获，后加工过程也相对不断收获，后加工过程也相对简简单单，细胞可以重复利用。因此，细胞可以重复利用。因此，利用培养的动物细胞生产的生物利用培养的动物细胞生产的生物制品，具有很高的市场制品，具有很高的市场价值价值。现在学习的是第42页，共187页 目目前前利利用用动动物物细细胞胞大大规规模模培培养养技技术术可可以以生生产产许许多多有有价价值值的的生生物物制制品品，包包括括重重要要的的疫疫苗苗、高高效效的的治治

23、疗疗药药物物和和灵灵敏敏的的诊诊断断试剂试剂等。等。现在学习的是第43页，共187页1 1、病毒疫苗：、病毒疫苗：乙肝疫苗（乙肝疫苗（HbsAgHbsAg）、）、脊脊椎灰质炎疫苗（椎灰质炎疫苗（PolioPolio）、）、狂犬疫苗狂犬疫苗（RabiesRabies）等。等。2 2、非抗体疫苗调节剂：、非抗体疫苗调节剂：干扰素干扰素（IFNIFN）、）、白细胞介素（白细胞介素（ILIL）、）、B B细胞生细胞生长因子（长因子（BCGFBCGF）、）、巨噬细胞激活因子巨噬细胞激活因子（MANMAN）、）、T T细胞替代因子（细胞替代因子（TRFTRF）等。等。现在学习的是第44页，共187页3 3

24、、多肽生长因子：、多肽生长因子：神经生长因子神经生长因子（NGFNGF）、）、成纤维细胞生长因子（成纤维细胞生长因子（FGFFGF）、）、表皮生长因子（表皮生长因子（EGFEGF）、）、血清生长因子血清生长因子（SFSF）等。等。4 4、酶类：、酶类：组织血纤维溶酶原激活剂组织血纤维溶酶原激活剂 （t-PAt-PA）等。等。现在学习的是第45页，共187页5 5、激素：、激素：红细胞生成素（红细胞生成素（EPOEPO）、）、促促黄体黄体 生成素（生成素（LHLH）、）、促滤胞素促滤胞素（FSHFSH）等。等。6 6、肿瘤特异性抗原：、肿瘤特异性抗原：癌胚抗原癌胚抗原（CEACEA）等。等。7

25、7、单克隆抗体、单克隆抗体（MCABMCAB）。）。8 8、病毒杀虫剂：、病毒杀虫剂：杆状病毒等。杆状病毒等。现在学习的是第46页，共187页全球销售额最高的全球销售额最高的6 6大类生物技术药物：大类生物技术药物：1 1、肿瘤治疗药物、肿瘤治疗药物2 2、胰岛素、胰岛素3 3、anti-TNF-anti-TNF-药物药物4 4、促红细胞生成素（、促红细胞生成素（EPOEPO）5 5、-干扰素干扰素6 6、凝血因子、凝血因子 这这6 6大类中有大类中有5 5类都是经哺乳动物细胞表达类都是经哺乳动物细胞表达生产的，只有生产的，只有-干扰素是大肠杆菌和酵母表干扰素是大肠杆菌和酵母表达的。达的。现在

26、学习的是第47页，共187页 动物细胞大规模培养和表达，对于生产动物细胞大规模培养和表达，对于生产抗抗体类蛋白质药物体类蛋白质药物具有具有明显优势明显优势：1 1、活性高、稳定性好，占生物技术药物生、活性高、稳定性好，占生物技术药物生产方式的产方式的70%70%以上，能够保证产品中二硫键多以上，能够保证产品中二硫键多等复杂结构蛋白的活性；等复杂结构蛋白的活性；2 2、效率高、成本低，能够提升生物技术药、效率高、成本低，能够提升生物技术药物的创新能力和竞争力。物的创新能力和竞争力。动物细胞大规模培养是当今生物技术动物细胞大规模培养是当今生物技术药物生产的主流方式。药物生产的主流方式。现在学习的是

27、第48页，共187页 目前通过动物细胞培养获得生物制品目前通过动物细胞培养获得生物制品的研制，必须依赖的研制，必须依赖3 3个关键技术个关键技术的发展：的发展：（1 1）基因工程和细胞工程的发展；）基因工程和细胞工程的发展；（2 2）大规模动物细胞培养技术和生物反应）大规模动物细胞培养技术和生物反应器开发；器开发；（3 3）产品的分离浓缩和提纯技术的提高。）产品的分离浓缩和提纯技术的提高。现在学习的是第49页，共187页大规模动物细胞培养的大规模动物细胞培养的生物反应器生物反应器 现在学习的是第50页，共187页1 1、滚、滚 瓶瓶 系系 统统 现在学习的是第51页，共187页现在学习的是第5

28、2页，共187页现在学习的是第53页，共187页现在学习的是第54页，共187页现在学习的是第55页，共187页现在学习的是第56页，共187页优点：优点：结构简单、投资少、技术成结构简单、投资少、技术成熟、重演性好，放大只是简单地熟、重演性好，放大只是简单地增加滚瓶数。增加滚瓶数。现在学习的是第57页，共187页缺点缺点：滚瓶系统劳动强度大，单位体积滚瓶系统劳动强度大，单位体积提供细胞生长的表面积小，占用空间提供细胞生长的表面积小，占用空间大，按体积计算细胞产率低，监测和大，按体积计算细胞产率低，监测和控制环境条件受到限制。控制环境条件受到限制。现在学习的是第58页，共187页2 2、中空纤

29、维管生物反应器、中空纤维管生物反应器 现在学习的是第59页，共187页中空纤维管生物反应器用途较广，既可培养悬浮生长中空纤维管生物反应器用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞密度最高可的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞密度最高可达达1010/mlmlmlml数量级。数量级。中空纤维反应器示意图中空纤维反应器示意图p-p-灌注液灌注液灌注液灌注液h-h-h-h-收获液收获液收获液收获液i-i-管内管内管内管内e-e-管外管外 现在学习的是第60页，共187页中空纤维培养示意图中空纤维培养示意图现在学习的是第61页，共187页 中中中中空空空空纤纤纤纤维维维维管管管管生生

30、生生物物物物反反反反应应应应器器器器已已已已进进进进入入入入工工工工业业业业生生生生产产产产，主主主主要要要要用用用用于于于于培培培培养养养养杂杂杂杂交交交交瘤细胞产生单克隆抗体。瘤细胞产生单克隆抗体。瘤细胞产生单克隆抗体。瘤细胞产生单克隆抗体。现在学习的是第62页，共187页中空纤维用聚砜或丙烯的聚合物制成。中空纤维用聚砜或丙烯的聚合物制成。管管壁壁的的厚厚约约50507575mm，海海绵绵状状，富富含含毛毛细管。细管。管径管径200200mm。管管壁壁是是极极薄薄的的半半透透膜膜。它它能能截截留留住住分分子子量量分分别为别为1101104 4、5105104 4 4 4、101010104

31、 4道尔顿三种。道尔顿三种。现在学习的是第63页，共187页一个培养筒由数千根中空纤维所组成一个培养筒由数千根中空纤维所组成内室：内室：每根纤维的管内成为每根纤维的管内成为“内室内室”；外室：外室：管与管之间的间隙，可灌流无血管与管之间的间隙，可灌流无血清培养液供细胞生长，成为清培养液供细胞生长，成为“外室外室”。现在学习的是第64页，共187页接种的细胞贴附接种的细胞贴附“外室外室”的管壁上，并的管壁上，并吸取从吸取从“内室内室”渗透出来养分，迅速生渗透出来养分，迅速生长繁殖。长繁殖。培养液中的血清输入到培养液中的血清输入到“外室外室”，由于，由于血清和细胞分泌产物（如单克隆抗体）血清和细胞

32、分泌产物（如单克隆抗体）的分子量大而无法穿透到的分子量大而无法穿透到“内室内室”去，去，只能留在只能留在“外室外室”并且不断被浓缩。并且不断被浓缩。现在学习的是第65页，共187页细细胞胞生生长长繁繁殖殖过过程程中中的的代代谢谢废废物物都都属属小小分子物质，可从管壁渗进分子物质，可从管壁渗进“内室内室”。一一般般细细胞胞在在接接种种1 13 3周周后后，就就可可以以完完全全充充满满管管壁壁的的空空隙隙。细细胞胞停停止止增增殖殖后后，仍仍可可以以维维持持其其高高水水平平代代谢谢和和分分泌泌功功能能，长长达几个星期甚至几个月。达几个星期甚至几个月。现在学习的是第66页，共187页优点：优点：（1

33、1）培养器体积小，细胞高密度生长；）培养器体积小，细胞高密度生长；（2 2）浓缩产品的功能；）浓缩产品的功能；（3 3）产物纯度高；）产物纯度高；（4 4）自动化程度高，细胞生长周期长。）自动化程度高，细胞生长周期长。（5 5）如果控制系统不受污染，能长期运转。）如果控制系统不受污染，能长期运转。现在学习的是第67页，共187页缺点：缺点：由于中空纤维每次生产的消由于中空纤维每次生产的消耗器价格尚贵，如果使用不当会耗器价格尚贵，如果使用不当会增加生产成本。增加生产成本。现在学习的是第68页，共187页3 3、细胞培养专用微载体、细胞培养专用微载体 现在学习的是第69页，共187页微载体含义微载

34、体含义:微载体指直径在微载体指直径在6060250250mm、能够适用于贴壁细胞生长的微珠。能够适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。合成的聚合物组成。现在学习的是第70页，共187页现在学习的是第71页，共187页微载体培养的优点：微载体培养的优点：1.1.表面积表面积/体积（体积（S/VS/V）大。大。2.2.兼有悬浮培养和贴壁培养两种方法优兼有悬浮培养和贴壁培养两种方法优点。点。3.3.简便的显微镜观察。简便的显微镜观察。能监测出细胞在微能监测出细胞在微珠生长情况。珠生长情况。4.4.培养基利用率高。培养基利用率高。现在学习的是第

35、72页，共187页5.5.收获细胞过程不复杂。收获细胞过程不复杂。6.6.放大容易。放大容易。7.7.劳动强度小。劳动强度小。8.8.培养系统占有空间小。培养系统占有空间小。微载体培养细胞是目前公认的最有微载体培养细胞是目前公认的最有发展前途的一种培养模式。发展前途的一种培养模式。现在学习的是第73页，共187页二、动物细胞在微载体上二、动物细胞在微载体上贴壁生长机理贴壁生长机理 贴壁依赖动物细胞在微载体表面上增贴壁依赖动物细胞在微载体表面上增殖，可分为殖，可分为贴壁、生长和扩展贴壁、生长和扩展成单层三个成单层三个阶段。阶段。现在学习的是第74页，共187页细胞能否在微载体表面贴附，细胞能否在

36、微载体表面贴附，取决于：取决于：1 1、细胞与微载体、细胞与微载体接触的机率接触的机率 2 2、细胞与微载体的、细胞与微载体的相融性相融性 现在学习的是第75页，共187页一般操作方式一般操作方式 贴壁期采用低搅拌转速，时搅时贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停，经数小数后，一旦细胞附着于微停，经数小数后，一旦细胞附着于微载体表面，则维持设定的低转速，进载体表面，则维持设定的低转速，进入培养阶段。入培养阶段。现在学习的是第76页，共187页 微载体表面的理化性质微载体表面的理化性质 动物细胞带动物细胞带负电荷负电荷。微载体表。微载体表面带的是正电荷，由于静电相吸作面带的是正电荷，由于静电相吸作用，使

37、细胞容易贴在微载体表面上。用，使细胞容易贴在微载体表面上。表面光滑的微载体，细胞扩展表面光滑的微载体，细胞扩展成单层的速度快。成单层的速度快。现在学习的是第77页，共187页优良微载体具备特性：优良微载体具备特性：1.1.不含有能毒害细胞的成分。不含有能毒害细胞的成分。2.2.与细胞有良好的相容性，使细胞容易与细胞有良好的相容性，使细胞容易 贴贴壁。壁。3.3.密度应略大于培养基，一般要求在密度应略大于培养基，一般要求在1.031.031.051.05之间，最大不宜超过之间，最大不宜超过1.11.1。为什么？为什么？现在学习的是第78页，共187页4.4.粒径在粒径在4040120120mm（

38、干态）范围，经干态）范围，经生理盐水溶胀后增大到生理盐水溶胀后增大到6060250250mm，粒粒度分布要均匀，表面光滑以利于细胞铺展。度分布要均匀，表面光滑以利于细胞铺展。5.5.具有良好的光学透明性，便于显微镜观察具有良好的光学透明性，便于显微镜观察细胞生长情况。细胞生长情况。6.6.能在能在PBSPBS中耐中耐120120125125、20203030minmin热热压灭菌。压灭菌。现在学习的是第79页，共187页7.7.基质应是非刚性材料，避免在培养过程基质应是非刚性材料，避免在培养过程中相互碰撞而损伤细胞。中相互碰撞而损伤细胞。8.8.不吸收培养基中的营养成分，特别是血清。不吸收培养

39、基中的营养成分，特别是血清。9.9.收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白制品分离纯化。白制品分离纯化。10.10.价廉，能重复使用。价廉，能重复使用。现在学习的是第80页，共187页4 4、动物细胞的微囊化、动物细胞的微囊化培养技术培养技术现在学习的是第81页，共187页动物细胞的微囊化动物细胞的微囊化 微囊化是固定化技术中的一种，它是用微囊化是固定化技术中的一种，它是用一层一层 亲水性的半透膜将酶、辅酶、蛋白亲水性的半透膜将酶、辅酶、蛋白质等生物大分子或动植物细胞包围在珠状质等生物大分子或动植物细胞包围在珠状的微囊里，从而使得酶等生物大分子和细的微囊里，从而使得

40、酶等生物大分子和细胞不能从微囊里逸出，而小分子的物质、胞不能从微囊里逸出，而小分子的物质、培养基的营养物质可自由出入半透膜，达培养基的营养物质可自由出入半透膜，达到催化或培养的目的。到催化或培养的目的。现在学习的是第82页，共187页 微囊化细胞的模式图微囊化细胞的模式图现在学习的是第83页，共187页 优点：优点：降低剪切力，形成小环境。降低剪切力，形成小环境。动物细胞微囊化后，与游离细胞比动物细胞微囊化后，与游离细胞比较，降低了培养时对细胞的剪切力，微较，降低了培养时对细胞的剪切力，微囊里实际上是一种微小的培养环境，与囊里实际上是一种微小的培养环境，与液体培养差不多，能使细胞生长良好。液体

41、培养差不多，能使细胞生长良好。现在学习的是第84页，共187页 提高细胞密度、增加产物浓度和纯提高细胞密度、增加产物浓度和纯度。培养过程中，微囊化能提供很高度。培养过程中，微囊化能提供很高的细胞密度，使得产物浓度增加，纯的细胞密度，使得产物浓度增加，纯度提高。度提高。动物细胞微囊化克服了大规模细动物细胞微囊化克服了大规模细胞培养的一些缺点。胞培养的一些缺点。现在学习的是第85页，共187页包埋生物大分子及细胞必备条件：包埋生物大分子及细胞必备条件：1.1.不伤细胞。不伤细胞。微囊化的过程温和，快微囊化的过程温和，快速，不损伤细胞，尽可能在液体状速，不损伤细胞，尽可能在液体状态和生理条件下制备；

42、态和生理条件下制备；2.2.无毒。无毒。微囊化所用的试剂和膜材料微囊化所用的试剂和膜材料必须对细胞无毒害作用；必须对细胞无毒害作用；现在学习的是第86页，共187页3.3.保证物质交流。保证物质交流。微囊化所形成的膜必须微囊化所形成的膜必须能使营养物和代谢产物自由通过，膜能使营养物和代谢产物自由通过，膜的孔径可以控制；的孔径可以控制；4.4.足够强度。足够强度。膜应具有足够的机械强度以膜应具有足够的机械强度以抵抗培养过程中的搅拌，不至使微囊破抵抗培养过程中的搅拌，不至使微囊破裂。裂。目前的方法用得最多的是聚赖氨酸目前的方法用得最多的是聚赖氨酸/海藻酸（海藻酸（PLL/ALGPLL/ALG）法。

43、法。现在学习的是第87页，共187页聚赖氨酸聚赖氨酸/海藻酸（海藻酸（PLL/ALGPLL/ALG）微囊化微囊化 原理：原理：海藻酸是以海藻酸是以1 1，4 4键连接的聚醛酸，其主要成键连接的聚醛酸，其主要成份是份是甘露糖醛酸甘露糖醛酸和和古罗糖醛酸古罗糖醛酸。当它的水溶液以。当它的水溶液以钙盐的形式存在时，则成钙盐的形式存在时，则成凝胶状态凝胶状态；而用螯合剂；而用螯合剂将钙离子去除后，则海藻酸又回复到将钙离子去除后，则海藻酸又回复到溶液状态溶液状态；当海藻酸钙凝胶用聚赖氨酸处理后，其接触部当海藻酸钙凝胶用聚赖氨酸处理后，其接触部分不再被螯合剂去钙而溶解。分不再被螯合剂去钙而溶解。现在学习的

44、是第88页，共187页微囊化装置及步骤微囊化装置及步骤 ：微囊发生器微囊发生器微囊发生器微囊发生器 为得到一定为得到一定大小、非常均大小、非常均一的微囊，制一的微囊，制备微囊需要微备微囊需要微囊发生器来完囊发生器来完成。成。现在学习的是第89页，共187页制备微囊化动物的步骤：制备微囊化动物的步骤：无菌收集动物细胞，离心后用生理盐水洗涤无菌收集动物细胞，离心后用生理盐水洗涤离心收集细胞，加海藻酸钠溶液混合均离心收集细胞，加海藻酸钠溶液混合均匀，成悬浮液；匀，成悬浮液；将悬浮液装入微囊发生器，制成微滴将悬浮液装入微囊发生器，制成微滴现在学习的是第90页，共187页凝胶珠悬浮于聚赖氨酸溶液中，凝胶

45、珠悬浮于聚赖氨酸溶液中，凝胶珠悬浮于聚赖氨酸溶液中，凝胶珠悬浮于聚赖氨酸溶液中，使之形成膜；使之形成膜；使之形成膜；使之形成膜；微滴加到微滴加到CaClCaCl2 2溶液中形成凝胶珠溶液中形成凝胶珠凝胶珠用生理盐水洗去残留的凝胶珠用生理盐水洗去残留的CaClCaCl2 2生理盐水洗涤生理盐水洗涤现在学习的是第91页，共187页得到动物细胞微囊得到动物细胞微囊凝胶珠加凝胶珠加0.050.05mol/Lmol/L柠檬酸溶液处理柠檬酸溶液处理使半透膜的使半透膜的ALGALG成液态成液态生理盐水洗涤生理盐水洗涤悬浮于培养基中培养悬浮于培养基中培养现在学习的是第92页，共187页微囊半透膜的孔径决定因素

46、：微囊半透膜的孔径决定因素：主要由主要由聚赖氨酸的分子量决定聚赖氨酸的分子量决定，一，一般来说用高分子量的聚赖氨酸（般来说用高分子量的聚赖氨酸（PLLPLL）覆膜孔径大，覆膜孔径大，PLLPLL分子量低则孔径小，通分子量低则孔径小，通常使用常使用40000400008000080000分子量的分子量的PLLPLL。PLL PLL溶液的浓度及处理时间、溶液溶液的浓度及处理时间、溶液的的pHpH值及使用温度也会影响膜的孔径。值及使用温度也会影响膜的孔径。现在学习的是第93页，共187页微囊机械性能影响因素：微囊机械性能影响因素：海藻酸的海藻酸的纯度高、粘度高容易成囊纯度高、粘度高容易成囊；甘露糖醛

47、酸和古罗糖醛酸的比例会影响甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的比例会影响微囊的形成及机械性能。微囊的形成及机械性能。含含古罗糖醛酸多古罗糖醛酸多的海藻酸容易成囊，机的海藻酸容易成囊，机械性能好，不易破碎。械性能好，不易破碎。现在学习的是第94页，共187页 微囊化动物细胞的应用微囊化动物细胞的应用 1 1、生产药物、生产药物（1 1）单克隆抗体的生产）单克隆抗体的生产 微囊化哺乳动物细胞的主要应用微囊化哺乳动物细胞的主要应用是单克隆抗体的生产。微囊工艺已生是单克隆抗体的生产。微囊工艺已生产以克计的单克隆抗体。微囊膜的孔产以克计的单克隆抗体。微囊膜的孔径可以控制在能截留径可以控制在能截留1010万以上分子量

48、万以上分子量的蛋白质的水平上，能截留单克隆抗的蛋白质的水平上，能截留单克隆抗体在微囊中。体在微囊中。现在学习的是第95页，共187页悬浮培养与微囊培养比较悬浮培养与微囊培养比较 现在学习的是第96页，共187页 优点：优点：微囊系统更有利于单克隆抗体的生产，微囊系统更有利于单克隆抗体的生产，而且单克隆抗体截留在微囊中，而且单克隆抗体截留在微囊中，培培养获得的产物浓度和纯度均更高养获得的产物浓度和纯度均更高。培养基中血清尤其是那些培养基中血清尤其是那些-蛋白能蛋白能被半透膜排阻在微囊外，被半透膜排阻在微囊外，使纯化更简使纯化更简单。单。现在学习的是第97页，共187页（2 2）高值生化药物的生产

49、）高值生化药物的生产 高表达有工业价值的蛋白质的重组高表达有工业价值的蛋白质的重组细胞更多的用微囊化培养。细胞更多的用微囊化培养。例：例：一种在黑色素瘤细胞中表达的分子量为一种在黑色素瘤细胞中表达的分子量为6500065000的重组蛋白用微囊化培养，纯化更简的重组蛋白用微囊化培养，纯化更简便。便。现在学习的是第98页，共187页（3 3）干扰素的生产）干扰素的生产 通过试剂和病毒方法诱导微囊化通过试剂和病毒方法诱导微囊化FS-1FS-1和和NamalwaNamalwa细胞生产干扰素。细胞生产干扰素。这两种细胞在微囊中生产比悬浮单层培这两种细胞在微囊中生产比悬浮单层培养或单层培养旺盛养或单层培养

50、旺盛 现在学习的是第99页，共187页2 2、在治疗及药物筛选上的应用、在治疗及药物筛选上的应用（1 1）人工器官）人工器官 微囊化动物细胞在排除免疫反应上可微囊化动物细胞在排除免疫反应上可能有普遍的意义。人们已将某些器官的细能有普遍的意义。人们已将某些器官的细胞微囊化并植入体内以期望能代替这些器胞微囊化并植入体内以期望能代替这些器官的功能。官的功能。现在学习的是第100页，共187页 人工胰是研究得最多的一种，人工胰是研究得最多的一种，微微囊化肝细胞也被用来研究人工肝。囊化肝细胞也被用来研究人工肝。例：微囊化大鼠兰氏胰岛细胞注入大鼠腹腔内，例：微囊化大鼠兰氏胰岛细胞注入大鼠腹腔内，可用于治疗