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1、第五章 常用生物化学检验技术临床生化检验常用的分析技术有光谱分析技术、电化学分析技术、电泳分析技术、层析和离心分析技术及自动化分析技术。其中光谱分析技术是最基本和最常用的技术，它具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛应用。第一节 光光谱分析技术术光谱技术是根据据物质吸收或或发射辐射能能而建立起来来的一类分析析方法，因不不同分子的原原子团和原子子，其发射光光谱和吸收光光谱不同，而而相同的物质质在一定条件件下，其发射射光谱和吸收收光谱的强度度与该物质的的含量成正比比关系。因此此可对物质进进行定性和定定量分析，此此类技术称为为光谱技术。是是一种最常用用的生化检验验测定技术，它它主要包括吸
2、吸收光谱（可可见紫外、红红外原子吸收收光谱法）、发发射光谱（荧荧光法、火焰焰发射光谱法法）和散射光光谱（比浊法法）。光是一一种高速传播播的电磁辐射射，具有波、粒粒二象性，光光的波长（）的常用单单位纳米（nnm），可见见光波长40007600nm，4400nm称称为紫外光，760nmm称为红外光光，波长愈短短，能量愈大大。可见，紫外吸收收光谱是由于于多原子分子子的价电子在在电磁辐射的的作用下，由由基态跃迁到到激发态，这这种因物质分分子对辐射的的选择性吸收收而得到的光光谱称为吸收收光谱。处于高能态的分分子（激发态态分子）是不不稳定的，当当返回基态时时，便发射出出相应的光谱谱，称为发射射光谱。可见，
3、紫外吸收收光谱用于定定量分析的依依据是光的吸吸收定律，即即Lambeert-Beeer是律，它它是吸收光谱谱法的基本定定律。一、分光光度法法的基本原理理（一）吸光度与与透光度当光线通过均匀匀、透明的溶溶液时，一部部分光被散射射，一部分光光被吸收，另另一部分光透透过溶液。设设入射光强度度为Io，透透射光强度为为It，Itt与Io之比比称为透光度度（T），即即T常用百分数表表示（T%），也也称为百分透透光度。透光度的负对数数称为吸光度度（A），又又称为消光度度（E），光光密度（ODD），即吸光度与透光度度的换算：如透光度=100时A = lg1100lgg10 = 21 = 1透光度=20时A =
4、 lg1100lgg20 = 21.33 = 0.7（二）Lambbert-BBeer定律律1. Lambbert定律律 当一束强度度为Io的单单色光透过某某种吸光溶液液后，由于溶溶液吸收了一一部分光，则则透过的光线线为It。当当溶液浓度不不变时，透过过的液层愈厚厚，则光线强强度的减弱愈愈显著。吸光度随液层厚厚度增加而增增加，其关系系是吸光度（AA）与液层厚厚度成正比，即即将上述比例式写写成等式，则则引入比例常常数，即吸光光系数（K），得得A = KKL当溶液浓度不变变时，吸光度度与液层厚度度成正比，这这就是Lammbert定定律。2. Beenn定律 当一束强度度为Io的单单色光透过某某种吸
5、光溶液液后，若液层层厚度不变，而而浓度不同时时，溶液的浓浓度愈大，则则透过光的强强度愈弱，其其定量关系是是：当液层厚度不变变时，吸光度度与溶液浓度度成正比，这这就是Beeer定律。合并Lambeert定律和和Beer定定律即Lamberrt-Beeer定律 是说明吸光光物质对单色色光吸收的强强度与该物质质的浓度和液液层厚度成正正比。溶液的吸光强度度与浓度的关关系，如用坐坐标表示，即即A-C曲线 呈正比 易制图，使使用方便（三）吸光系数数吸光系数K的物物理意义是吸吸光物质在单单位浓度及单单位厚度时的的吸光度，在在给定条件下下（波长、溶溶液性质、浓浓度）吸光系系数是物质的的特征常数，KK值愈大，能
6、能测定的浓度度C愈小，则则灵敏度愈高高。吸光系数的表示示方法mol1cm1. 摩尔吸光光系数 用用 表示，其意意义是浓度为为1mol的的溶液在厚度度为1cm时的吸吸光度。2. 百分吸光光系数 或或称比吸光系系数，用表示示，是指浓度度为1（WW/V）的溶溶液在厚度为为1cm时的吸吸光度。换算关系：二、分光光度计计的基本结构构分光光度计由光光源、单色光光器、比色杯杯、光电管、运运算放大器和和显示器等部部分组成。1.光源 22.单色光器器 3.试试样室 44.光电管 5.运算算放大器 6.显示器器图5-1 分分光光度计结结构示意图（一）光源可见光分光光度度计常用光源源是钨灯，能能发射出3550nm2
7、2500nmm波长范围的的连续光谱，适适用范围是3360nm1000nnm。现常用用的是卤钨灯灯，发光效率率提高，使用用寿命延长。紫外分光光度计计常用光源是是氢灯，其发发射波长范围围为150nnm4000nm。（二）单色光器器将光源的复合光光分散为单色色光的装置称称为单色光器器。常用的单单色光器有滤滤光片、棱镜镜和光栅。（三）比色杯盛放比色溶液的的装置。用无无色透明、耐耐腐蚀、耐酸酸碱的玻璃或或石英材料做做成。光径有有0.555cm，比色色杯间的透光光度误差应小小于0.5%。（四）检测器由光电管和运算算放大器组成成，是将光信信号转换成电电信号，并将将电信号放大大的装置。（五）显示器是将检测器所
8、检检测的电流通通过仪表显示示出来的装置置。常用的有有检流计和数数字显示器。检检流计可显示示透光度（TT%）和吸光光度（A），数数字显示器可可显示T%、AA和C（浓度度）。三、分光光度法法的定量方法法1. 对比法 又称标准准对照法，通通常在测定未未知浓度样品品的同时，测测定一已知浓浓度的标准液液作比较，然然后分别测定定两者的吸光光度。 因测定成分相同同，故a值相相同，比色时时用同样规格格的比色皿故故bS=bR，所以比色色分析中测定定标准液与未未知液吸光度度的比值也就就等于其浓度度的比值，即即 若标准液与样品品用量不等时时，则再乘上上。用对比法进行定定量时，为了了减少误差，选选用标准液浓浓度应尽可
9、能能接近待测样样品浓度。2. 标准曲线线法 配制制一系列浓度度不同的标准准液，按一定定操作方法显显色后，用选选定的波长分分别测定它们们的吸光度，然然后以吸光度度为纵坐标，标标准液浓度为为横坐标，在在坐标纸上标标出各坐标点点，通过原点点连接各点应应成一直线，即即A-C曲线线。注意事项项：（1）应设置556个浓度度。（2）设置的浓浓度范围应足足够大，直至至观察到“拐点”（即不呈直直线的浓度值值），或到能能满足临床应应用的浓度为为止，以便能能准确地划出出线性范围。（3）每一种浓浓度最好是做做三个平行测测定，并要求求3支平行管管吸光度的最最大值与最小小值之差应小小于0.055，然后求平平均值。（4）校
10、正 有时制备的的标准曲线CC与A相交的的点不一定完完全在一条直直线上，定线线时若采用目目测法校正，如如校正不当，反反面会造成更更大的误差，科科学的方法采采用直线回归归方程来确定定直线的位置置，其计算方方式是 yy = a + bx四、其它光谱分分析技术（一）火焰光度度法是一种发射光谱谱分析法，是是利用火焰使使金属元素激激发后，能发发射出特征性性谱线的特点点进行测定的的一种方法1. 基本原理理 某些金金属元素的基基态原子受到到火焰的激发发后，其外层层电子获得能能量而从基态态跃迁到激发发态，接着它它们又以发射射光谱的形式式释放出所获获得的能量，而而返回基态，在在相同条件下下，同一元素素所释放的单单
11、位能量相同同，故能形成成固定光谱。而而不同的元素素受激发后所所发射光谱不不同。如钠发射光谱波波长589nnm，钾发射射光谱波长7767nm由于火焰供给的的能量不强，只只能激发碱金金属和碱土金金属元素，生生化检验中常常用于钾、钠钠的测定。元素的发射谱线线强度与该元元素浓度的关关系可表示为为：I = accba是与试样组成成、及其蒸发发和激发过程程有关的常数数，b为自吸吸收系数，在在浓度很低时时，b1，所以上上式可写成II = ac，即发射射谱线强度与与待测元素浓浓度成正比。2. 火焰光度度计的基本构构造 基本本结构主要分分三个部分：激发光源系系统、光学系系统、检测显显示系统（二）荧光分析析法暗利
12、用某些物质质受紫外光照照射后发出特特有的荧光，籍籍此对物质进进行定性，定定量分析的方方法。1. 基本原理理 某些物物质的分子吸吸收了光能，从从基态跃迁至至某一电子激激发态中的某某一振动能级级，处于激发发态较高振动动能级中的分分子通过运动动或与其他分分子的碰撞而而将过多的能能量转给其他他分子，并返返回到第一激激发态的最低低振动能级，然然后发生自发发辐射，跃迁迁到基态，发发射一定波长长的辐射能，此此能量即荧光光，荧光多为为可见光，在在一定浓度范范围内，其荧荧光强度与溶溶液浓度呈线线性关系，是是量关系式可可表示为：F=f Ioobc = KcK为常数，它与与物质的性质质，激发光强强度、波长、液液层厚
13、度等条条件有关。此此公式是荧光光分析的定量量基础，但它它只适合于稀稀溶液，即bc项不大大于0.055，因此线性性范围的最大大浓度为Cmmax =。当当溶液浓度超超过Cmaxx时，荧光强强度与浓度不不呈线性的。2. 影响荧光光强度的因素素（1）温度、ppH T，分子碰撞撞频率，因此荧光光强度随温度度升高而减弱弱。pH可影影响化合物电电离或使荧光光物质水解，如如苯胺在pHH712溶溶液中主要的的分子形式存存在，产生蓝蓝色荧光，而而在Ph22或13的的溶液中以离离子形式存在在，不能产生生荧光。（2）激发光和和发射光 在定量测定定时，一般应应选择荧光物物质的最大激激发波长（ex）和最最大荧光波长长（e
14、m），但但有些荧光物物质化学性质质不稳定，受受激发光照射射后易分解，缩缩短样品照射射时间，改变变激发光波长长。（3）物质浓度度的影响 荧光分析只只适合稀溶液液，因荧光物物质浓度高，分分子间碰撞增增加，使荧光光强度减弱，这这种现象称为为自熄灭，自自熄灭现象随随浓度增加而而增强。3. 仪器与测测定方法 作为荧光分分析的仪器有有光电荧光计计和荧光分光光光度计。光电荧光计的结结构与光电比比色计很相似似，不同之处处是检测器与与光线成直角角，并多一块块滤光片。如将滤光片改为为棱镜或光栅栅作单色器，就就和可见紫外外分光光度计计相似而成荧荧光分光光度度计。四类仪器的组成成部件的比较较光 源源单色器测定池光敏元
15、件检测器光电比色计钨 灯滤光片玻 璃（二面透光）光电池光电管检流计光电荧光计卤钨灯（300-7000nm）两 块滤光片玻 璃（四面透光）光电管检流计可见、紫外分光光度计钨灯（400-760nmm）氢灯（200-400nmm）光 栅或棱镜玻 璃石 英光电管光电倍增管自 动记录仪荧光分光光度计氙弧灯（200-7000nm）光 栅或棱镜玻 璃石 英光电倍增管自 动记录仪氙弧灯发射的强强烈紫外线对对人眼有害。荧荧光分析优点点：（1）灵敏度高高 比可见见紫外吸收光光谱高1033104倍。（2）特异性强强 通过选选择合适的激激发光波长和和荧光波长可可避开其它物物质干扰。（3）操作简便便、快速、重重现性好。
16、（4）样品用量量少不足之处：（1）应用范围围有一定局限限性，因许多多物质不能产产生荧光。（2）对测定条条件要求严格格，如试剂、溶溶剂不应含有有荧光杂质。（3）仪器价格格较贵荧光分析法在医医学检验中可可用于测定类类固醇激素（肾肾上腺皮质激激素、性激素素）及代谢产产物，单胺类类神经递质（几几茶酚胺，55-HT），某某些维生素（VVitA、BB族）。（三）原子吸收收分光光度分分析 属吸吸收光谱分析析1. 基本原理理：待测元素素经原子蒸气气发生器转化化成气态原子子（处于基态态），由空心心阴报灯提供供的待测元素素的其振线经经过待测元素素的蒸气，共共振辐时强度度被蒸气中待待测元素的基基态原子吸收收而减弱，
17、其其吸收规律遵遵循Beerr定律，即在在一定条件下下，原子吸收收与该物质浓浓度成正比。共振线：电子从从基态跃迁至至第一电子激激发态的最低低振动能级所所吸收的谱线线的为共振吸吸收线。简称称为共振线。2. 组成 由光源、原原子化器、分分光系统和检检测系统组成成。（1）光源 有空心阴极极灯、无极放放电灯和蒸气气放电灯。（2）原子化器器 将待测测元素转化为为基态原子。（3）分光系统统 将待测测元素的特征征谱线与其它它谱线分开。由由透光狭缝、色色散元件和准准直镜组成。（4）检测系统统 将光信信号转化为电电信号并进行行放大处理，确确定待测元素素的含量。由由检测器和放放大器组成。3. 应用：在在医学检验中中
18、主要用于体体液、毛发、指指甲等组织钙钙、镁、铁、钠钠、锌、铝、汞汞、铅、砷等等多种元素的的测定。优点点：（1）选择性好好，受干扰少少，原子吸收收是光的窄带带吸收，仅00.0010.01nnm，而分子子对光的吸收收是宽带吸收收，达几个nnm。（2）灵敏度较较大火焰光度度分析高12个数量级级（3）测定快速速、简便（4）应用范围围广，可测多多种元素，但但需更换不同同空心阴报灯灯，仪器昂贵贵。第二节 电电化学分析电化学分析是一一种以溶液电电化学性质为为基础测定物物质含量的分分析方法。按按测定量的电电化学参数的的不同，可分分为电位法、电电导法、库仑仑法、极谱法法和伏安法等等，下面主要要介绍电位法法中的离
19、子选选择电极法。离子选择电极（iion seelectiive ellectroode，ISSE）是一种种电化学敏感感器，它的电电势与溶液中中给定离子的的活度的对数数成线性关系系，故可以通通过简单的电电位测量，直直接测定溶液液中离子活度度。离子浓度与离子子活度的关系系 a = f.c 在稀溶液液中（104mol/L以下）活活度系数接近近1。ISE分析法的的优点：1. 是一种直直接的非破坏坏性分析方法法，可反复进进行，不受样样品溶液颜色色、浑浊等因因素的干扰。2. 分析速度度快，单次分分析通常只112mivv3. 测量范围围宽，455个数量级4. 操作简便便5. 测量的是是离子活度，对对临床医学
20、和和基础医学更更有实用意义义。一、ISE分析析法的基本原原理ISE大都属于于膜电极，膜膜中含有与待待测离子相同同的离子。膜膜的内表面与与具有相同离离子的固定浓浓度溶液接触触，其中插入入一内参比电电网极，膜的的外表面与待待测离子溶液液接触。由于于电极膜材料料、制备方法法不同，使电电极的稳定性性、选择性和和灵敏度也不不同。膜电位的产生：当电极置于于待测离子溶溶液中时，由由于离子的交交换和扩散作作用，改变了了两相中原有有的电荷分布布，因而存在在一定的电位位差，因为内内充溶液中有有关离子的浓浓度恒定，内内参比电极的的电位固定，所所以ISE的的电位（E）只只随离子活度度不同而改变变，其电位可可用Nern
21、nst方程式式表示。ISE的E值不不能直接测定定，必须将IISE与参比比电极浸入被被测溶液中组组成原电池，然然后通过电动动势来测定EE值。参比电极：是指指在温度、压压力恒定的条条件下，当被被测溶液离子子浓度有所改改变时，电极极电位保持不不变的电板。二、ISE的分分类均相膜电极非均相膜电极晶体膜电极刚性基质电极流动载体电极基本电极非晶体膜电极离子选择电极气敏电极敏化电极酶电极（一）晶体膜电电极 其敏敏感膜为金属属微溶盐，经经加压成片，制制成单晶、多多晶或混晶电电极敏感膜，如如氟电极，其其敏感膜为LLaF3单晶片。（二）非晶体膜膜电极1. 刚性基质质电极 其其敏感膜为薄薄玻璃，故称称为玻璃电极极。
22、成分一般般为Na2O-AI2O3-SiO2改变这三种种成分的配合合比可分别制制出对Li+、Na+、K+、Ag+的离子选择择电极。如：Na2OAI2O3SiO2 27% 4% 669% K+10.4% 22.6% 67% Naa+2. 流动载体体电极 其其敏感膜是由由溶解在与水水不相混溶的的有机溶剂中中的离子缔合合剂或络合剂剂作为离子交交换体，再将将此溶液渗透透在具有惰性性，多孔性和和疏水性的塑塑料薄膜内。（三）气敏电极极 是基于于界面化学反反应对气体敏敏感的电极，它它是在一般的的离子选择电电极的基础上上，再覆盖一一层疏水的透透气膜（如聚聚四氟乙烯），如如CO2、NH3电极。（四）酶电极 它由离
23、子子敏感膜和覆覆盖在表面含含有酶的酶涂涂层所组成，敏敏感膜对待测测物的酶促反反应有选择性性的响应，如如尿素酶电极极。三、ISE的性性能1. 响应范围围及检测下限限 响应范范围是指电极极对待测离子子的响应符合合Nernsst公式的线线性区，此范范围越宽越好好，一般在447个数量量级之间，检检测下限是指指能够检测被被检离子的最最低浓度，一一般在105107mol/L。2. 选择性 是指电极极对待测离子子和共存干扰扰离子的响应应程度的差异异。常用选择择性系数或选选择比来描述述，选择性系系数越小，表表示电极选择择性越强。3. 响应斜率率和转换系数数 ISSE在Nerrnst响应应范围内被测测离子活度变
24、变化10倍所所引起的电极极电位变化的的数值，即响响应斜率（SS），从理论论上说，斜率率为：但对某一ISEE来说，实际际S值与理论论S值并不完完全相符，其其偏差用转换换系数表示，一一般转换系数数达到理论值值90以上上的电极性能能较好。4. 电报寿命命 取决于于电极制作材材料，结构和和使用保管情情况。四、ISE分析析定量方法1. 标准曲线线法 配制制一系列不同同浓度标准溶溶液，测定其其电位值Ess，绘制Ess-lgc标标准曲线，在在相同条件下下测定样品溶溶液电位值EEx。2. 电极校正正法 用标标准溶液校正正ISE，制制成直读式仪仪表。五、ISE分析析方法的误差差1. 电动势测测量，对于一一价离子
25、的响响应，电势测测量每差1mmV引起浓度度的相对误差差为4，对对于二价离子子则为8，因因此对于测量量电势的仪表表精度要求达达到0.1mmV。2. 温度 Nernsst公式中的的斜率，内参参比电极的电电位，以及离离子活度等都都与温度有关关，因此在整整个测量过程程中应保持温温度恒定。3. pH 溶液pH值值可影响被测测离子在溶液液中的存在形形式，从而影影响相应离子子的活度，如如LaF3电极测定FF如pH55，F则会生成HHF，使结果果偏低。4. 滞后效应应 使用IISE若先测测浓溶液后，再再测稀溶液时时电位平衡缓缓慢并出现误误差，这一现现象称为“滞后效应”。第三节 电泳泳技术一、电泳的基本本原理（
26、一）电泳的概概念溶液中带电颗粒粒在直流电场场中向电荷相相反方向移动动的现象称为为电泳。利用用电泳现象对对物质进行分分离的技术叫叫电泳技术。电泳技术的应用用始于19337年，瑞典典Tisellius利用用界面电泳将将血清蛋白质质分离成五种种成分。1948年Wiielandd发明纸电泳泳，使电泳技技术大为简化化。此后，电电泳技术发展展迅速，特别别是电泳技术术与层析法，免免疫学方法的的结合，使其其分辨率达到到 mg/mml水平，成成为医学检验验的一种重要要分析技术。（二）蛋白质的的两性电离和和等电点蛋白质分子中有有电离带正电电荷的氨基，也也有电离带负负电荷的羧基基，故蛋白质质是一种两性性电解质。在酸
27、性条件下，羧羧基电离受抑抑制，NHH2NH3带正电。在碱性条件下，羧羧基电离受增增强，COOOHCOO带负电。在某一pH溶液液中，蛋白质质分子中氨基基与羧基电离离趋势相等（或或正负离子相相等），静电电荷为零，此此时溶液的ppH称为该蛋蛋白质的等电电点（pI）。（三）电泳迁移移率指带电粒子在单单位电场强度度作用下的电电泳速度，通通常用表示 =V/EV为粒子移动速速度（cm/s）E为电场强度度（V/cmm）迁移率取决于带带电粒子的性性质（粒子所所带电量Q，粒粒子大小、rr、形状）介介质粘度，对于球状状分子，根据据Stokee定律V= QE/66rU=Q/6rr在实际测定中，电电泳速度V以以单位时间
28、tt（秒）内移移动的距离dd（厘米）表表示 V=d/t（ccm/s）电场强度E以单单位长度L（厘厘米）上所施施加的电势差差V（伏特）表表示E=V/L（VV/cm）所以 通过测量d，LL，V，t便可计算出出颗粒的迁移移率。由于不同的带电电粒子其迁移移率的不同，因因此在同一电电场中的移动动距离不同，故故能将其分离离，根据公式式dA=Vt/LA dB=Vt/LBA.B移动距离离差为d=（dAdB）=（AB）Vt/L分离距离与电压压和电泳时间间成正比，与与支持物长度度成正比。二、电泳技术的的分类和电泳泳仪（一）电泳的分分类1. 根据被分分离样品的多多少 分析析电泳，制备备电泳。2. 根据电泳泳电压的高
29、低低 常压电电泳，高压电电泳。3. 根据是否否使用支持介介质 自由由电泳，区带带电泳。4. 根据电泳泳系统的组成成是否均一 连续电泳泳，不连续电电泳。（二）电泳仪由直流电源和电电泳槽两部分分组成。1. 直流电源源 将交流流电源经整流流，滤波后获获得。分为（1）恒压电源源 电泳过过程中的电流流恒定不变。但但电泳过程中中的热效应，降降低外周电路路的电阻，使使电流慢慢增增大。（2）恒流电泳泳 电泳过过程中的电流流恒定不变。用用这种电流的的输出电压可可随外周阻力力减少而减少少，从而保持持电流恒定。（3）恒功率电电源 电泳泳中输出功率率恒定不变。主主要用于等电电聚焦电泳。2. 电泳槽 盛装缓冲冲液和进行
30、电电泳分析的场场所，一般用用塑料和有机机玻璃制成，它它包括电极，缓缓冲液槽，电电泳支架，透透明盖组成。电电泳槽的外形形有水平式，垂垂直式，圆盘盘式等多种。电极应具有良好好的导电性，抗抗腐蚀性和抗抗电解作用。以以铂金材料最最为理想，最最好贯穿整个个缓冲液槽。三、影响电泳的的因素（一）电场强度度 电场强强度增大，电电泳速度加快快，但是同时时电流增大，产产热增多，水水分蒸发加速速，甚至使蛋蛋白质变性。电电场强度降低低，电泳速度度减慢，电泳泳时间延长。醋醋酸纤维薄膜膜电泳的电场场强度一般为为10155V/cm（二）电泳缓冲冲液 维持持电泳介质ppH恒定，并并起导电作用用。1. 组成 由弱酸和弱弱酸盐组
31、成，常常用的有磷酸酸盐，硼酸盐盐，巴比妥盐盐和三羟甲基基氨基甲烷（TTris）等，其其中巴比妥缓缓冲液用得最最多，由巴比比妥钠和巴比比妥组成。选择缓冲液时应应考虑的因素素。（1）化学性能能稳定，不易易水解。（2）缓冲液的的pH应与弱酸酸的pK 值接近近，有较强缓缓冲能力。（3）缓冲液中中正负离子应应有相近的迁迁移率，避免免电晕出现正正负离子分布布不均。（4）缓冲液的的离子应该是是一价的，多多价离子有较较厚的双电层层，移动性差差。（5）缓冲液的的电导率要低低，避免通电电时产生较多多的热。2. pH 缓冲液pHH决定了蛋白白质的带电状状态，电泳时时应选择一个个合适pH，使各种种蛋白质在这这一pH时
32、净电荷荷差别最大以以利于分离。血血清蛋白醋酸酸纤维薄膜电电晕常用pHH8.6的巴比妥妥缓冲液。各各种蛋白质均均带负电荷，电电泳时向正极极移动。缓冲液pH的计计算电泳过程水会发发生电极。正极：2OHH2O +1/2O2+2e pHH负极：2H+ +2e H2 pH故电泳24次次后应将缓冲冲液正极交换换，减少这种种影响。3. 离子强度度 是指溶溶液中各种离离子的摩尔浓浓度（ci）与其电电荷数平方（ZZi2）乘积总和和的1/2。即即I=1/2ccizi2 I的的单位是mol/L。如0.1moll/L NaaCL I=0.1mol/L 0.2mool/LMggCL2 II=0.6mmol/L对于缓冲液
33、I计计算，由于弱弱酸的电离度度很低，一般般只计算盐的的。I愈大，缓冲能能力越大，ppH越稳定，但但缓冲液所载载分电流增加加，样品所载载的分电流减减少，电泳速速度减慢，导导电能力增加加，产热增加加。I过小，缓冲能能力小，pHH不稳定，缓缓冲液所载分分电流减少，样样品所载分电电流增加，缓缓冲液粘度系系数降低，电电泳速度加快快。但样品在在支持物上扩扩散严重，分分辨率降低。兼顾两方面的影影响，一般在在0.050.1mool/L。（三）支持介质质 对支持持介质的基本本要求是具有有化学惰性，不不与被分离的的样品或缓冲冲液起化学反反应，并具有有一定的坚韧韧度。1. 吸附 使被分离样样品滞留，而而降低电泳速速
34、度，造成拖拖尾而使分辨辨率降低。2. 电渗 电泳过程中中液体对固体体支持物的相相对移动称为为电渗。实际际上是电泳材材料表面的电电荷引起水的的定向移动。当电渗作用方向向与电泳方向向一致，电泳泳速度加快，顺顺水行舟。当电渗作用方向向与电泳方向向相反，电泳泳速度减慢，逆逆水行舟。四、常用电泳技技术区带电泳是目前前应用最广泛泛的一种电泳泳技术，区带带电泳的支持持介质常用的的有滤纸，醋醋酸纤维薄膜膜，凝胶等。（一）滤纸电泳泳（PE）是应用最早的支支持介质。优优点：材料价价廉易得，有有一定机械强强度。缺点：电泳时间长长，8100小时，吸附附作用大，造造成拖尾而降降低了分辨率率，目前已淘淘汰。（二）醋酸纤维
35、维薄膜电泳（CCAE）1957年Koohn首先采采用，醋酸纤纤维素是将纤纤维素分子中中葡萄糖单体体上的羟基乙乙酰化而形成成纤维素醋酸酸酯，然后用用丙酮和水的的混合溶剂溶溶解，涂成均均匀薄膜。优点：对蛋白质质吸附作用很很小，分辨率率高，区带清清晰，不吸附附燃料，区带带周围燃料可可完全清掉，检检测灵敏度较较高，样品用用量少0.332l，电泳时时间短20mmin1h，可透明明，便于用光光密度扫描仪仪定量。缺点：有轻度电电渗作用，吸吸水性较差，较较脆。（三）琼脂糖凝凝胶电泳（AAGE）琼脂糖是从琼脂脂中分离得到到的一种多糖糖。主要由半半乳糖和L-3，6-脱脱水半乳糖构构成。常用浓浓度0.51.0% 。
36、优点：吸附作用用，电渗作用用很小，故分分辨率重现性性好，应用广广，同工酶，脂脂蛋白，免疫疫电泳，样品品用量少0.63.0l，电泳时时间短30mmin1h。透明度度好，电泳后后可直接扫描描定量，也可可烘干制成薄薄膜。缺点：电泳完毕毕后区带易扩扩散，可及时时固定。点样样方法，挖孔孔法，滤纸插插入法。（四）聚丙烯酰酰胺凝胶电泳泳（PAGEE）是一种人工合成成的高分子材材料，60年年代新用于电电泳分析，能能将血清蛋白白分为20多多种组成。1. 优点：（1）具有分子子筛作用，分分离效果好。（2）化学稳定定性高，是一一种稳定的亲亲水胶体。（3）几乎没有有吸附和电渗渗作用。（4）机械强度度好，无色透透明，可
37、直接接光密度扫描描。（5）可调节凝凝胶孔径以适适合不同分子子量的分离。2. 聚合丙烯酰胺（Accr）+甲义义丙烯酰胺（BBis）聚丙烯酰胺胺单体 交联剂剂化学摧化 过硫酸铵铵-TEMEED（四甲基基乙二胺）系系统引发剂 加速速剂加速剂TEMEED促使引发发剂过硫酸铵铵形成自由基基，自由基与与Acr接触，使使Acr单体形成成自由基而活活化，引发聚聚合，聚合速速度与pH、单单体浓度、温温度有关。光催化 核黄黄素-TEMMED系统，核核黄素经光照照被还原成无无色核黄素，在在和痕量氧的的条件下，无无色核黄素又又被氧化成核核黄素自由基基，使Acrr活化，从而而引发聚合。优点：核黄素用用量少（100mg/
38、l），对对样品分析无无影响，聚合合时间可通过过调节光照时时间，强度来来控制。3. 孔径与机机械强度凝胶孔径由凝胶胶总浓度和交交联度决定。凝凝胶总浓度TT（g/dll）表示1000ml凝胶中Acrr和Bis的总克克数，T值越越大，孔径越越小。交联度C（%）表表示交联剂BBis占凝胶胶总浓度T的的百分比，CC值越大，孔孔径越小。T值固定不变时时，C值在55%时，凝胶胶孔径最小，大大于或小于55%，孔径都都会增大。常用标准胶T=7.5g/dll，孔径约55nm。凝胶的机械强度度、弹性、透透明度全要取取决于T及AAcr与Bis的比值值。通常要求 T为为2%5% Accr/ Bis=200 5%110%
39、 AAcr/ Bis=400 15%20% AAcr/ Bis=122520004. 分类 圆柱型根据凝胶的形状状： 水平式 平板型 垂直直式连续（均相），操操作方便。根据凝胶系统和和缓冲液组成成 不不连续（多相相），分离效效果好。5. 分离原理理聚丙烯胺凝胶电电泳大多属于于不连续电泳泳。（1）两种不同同孔径的凝胶胶系统；（2）电泳过程程中形成不均均匀不连续系系统 上层层大孔径浓缩缩胶T233g/dl、Tris-HCL、pH6.77。下层小孔孔径分离胶，TT510gg/dl，Tris-HCL，pH8.99。电极缓冲冲液Triss-甘氨酸pHH8.3。（3）电极槽，两两层凝胶中的的缓冲液pHH和
40、组成不同同。高分辨率主要是是由于下面三三种效应1. 样品浓缩缩效应 CCl迁移率最大大 快离子，解解离度最小的的甘氨酸离子子迁移率最小小 慢离子。蛋蛋白质离子介介于两之间，快快离子与慢离离子之间形成成低导电区，有有较高的电位位梯度，促进进蛋白质和慢慢离子的移动动，使蛋白质质样品被压缩缩为一薄层。2. 分子筛效效应 蛋白白质进入分离离胶，由于凝凝胶有一定的的孔径，不同同的蛋白质分分子大小不同同，受到的阻阻力不同，小小分子受阻力力小，走在前前面，大分子子受阻力大，走走在后面。3. 电荷效应应 同一般般电荷。五、蛋白质区带带的定性和定定量分析（一）蛋白质区区带的染色 蛋白质电电泳分离后可可以直接用紫
41、紫外光密度扫扫描仪定量（利利用蛋白质对对280nmm紫外光的吸吸收），但需需专门的仪器器，故临床上上一般采用染染色来进行定定性或定量分分析。蛋白质染色剂大大多是阴离子子燃料，易与与蛋白质阳离离子结合，因因此在pHpI的酸性溶溶液中较强。常用的染色剂有有氨基黑100B，溴酚蓝蓝，丽春红SS。（二）蛋白质区区带的定性分分析 经染染色后，首先先应仔细观察察有无异常区区带。如多发性骨髓瘤瘤病人有大量量单克隆蛋白白质（主要是是IgG或IgA）电泳泳时可在和之间呈现一一条区带，称称为M区带。（三）蛋白质区区带的定量分分析 蛋白白质电泳的定定量分析通常常以各区带占占总量的百分分率表示 如同时时测定了蛋白白质
42、总量，也也可换算成各各组分的绝对对量（g/LL）表示。如血清蛋白质电电泳经氨基黑黑10B染色色A：66% 1：3% 2 ：7% ：10% ：15% 总蛋白白75 g/L 49.5 g/L 2.255 g/L 5.25 g/L 77.25 gg/L 11.255 g/L1. 光密度仪仪直接扫描法法 透明的的电泳图谱可可用光密度仪仪直接扫描得得出各组分的的百分率。操操作简便，迅迅速，误差小小，结果较准准确。2. 洗脱比色色法 染色色后将各区带带分别剪下侵侵入适当的溶溶剂中，将蛋蛋白质吸附的的染料全部洗洗脱，然后进进行比色，求求出各组分的的百分含量。操作繁琐，费时时，准确度不不如光密度仪仪直接扫描法
43、法。六、电泳新技术术简介（一）等电聚焦焦电泳（IEEFE）是利用具有线性性pH梯度的两两性电解质为为载体，分离离等电点不同同的蛋白质等等两性分子的的一种电泳新新技术。其分分辨率可达00.01 ppH单位，特特别适用于分分离分子量相相近而等电点点不同的蛋白白质分子。正正常人血清蛋蛋白质采用此此法可分出550多条区带带。1. 基本原理理 在电泳泳系统中建立立一个从正极极到负极，ppH由低到高高的连续而稳稳定的pH梯度。处处于这一系统统的各种蛋白白质，根据各各自pI与所处环环境pH值的差别别带上正电或或负电，电泳泳时逐渐靠近近与其pI相同的pH位点，而而不断失去净净电荷，直至至达到pH= pI，净电
44、电荷为零时，不不再受电场力力的作用，而而达到聚焦。基本条件：（11）建立一个个稳定、重复复性良好的连连续pH梯度。 （2）有有一个抗对流流的材料，防防止已分离样样品重新混合合。 （3）电电泳后有适当当的方法来鉴鉴定分离的区区带。2.pH梯度的的建立 能能建立稳定ppH梯度的两两性电解质是是一种多羧基基、多氨基的的脂肪族化合合物。如瑞典典LKB公司司生产的商品品名为“Ampholline”的的，它由丙烯烯酸和多乙烯烯多胺合成。理想的两性电解解质载体应具具备以下特点点：（1）各成分的的导电能力彼彼此相近。（2）各成分的的pI彼此接近近，并在pII附近有良好好的缓冲能力力。（3）分子量小小，易于与样
45、样品分离。（4）对2800 nm紫外光没没有或仅有很很低的吸光度度，不干扰样样品测定。（二）双向电泳泳是先把样品从一一个方向进行行电泳分离，然然后在与其成成90。 方向上进进行第二次电电泳分离。如如第一次电泳泳可以其电荷荷性质为基础础；第二次电电泳则以分离离量不同进行行分离。通常常将等电聚焦焦电泳为第一一相电泳，以以SDS-聚聚丙烯酰胺凝凝胶为第二相相电泳。（三）转移电泳泳又称印迹转移电电泳。此项技技术是19775年由E，MM，Soutthern在在进行DNAA片段的研究究中首先使用用。将凝胶电电泳所得区带带经吸附作用用转移到硝酸酸纤维薄膜（NNC膜）上，由由于转移过程程类似于将墨墨迹吸到吸水水纸上，故称称为(Sou