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1、目 录录实验一一 显微微摄影术术实验二二 细胞胞凝集反反应与细细胞膜的的渗透性性实验验三线线粒体和和液泡系系的超活活染色与与观察实验四四叶绿绿体的分分离与荧荧光观察察实验五五 石蜡蜡切片法法实验验六 植物染染色体标标本的制制备与观观察实验验七 动物细细胞培养养原代细细胞培养养传代代细胞培培养与观察察实验一 显微摄摄影术一、实验验目的掌握显微微摄影装装置及其其操作技技术;独独立完成成显微摄摄影全过过程二、实验验用品1.器材材:复式显微微镜及其其摄影装装置、黑黑白胶片片、显影影罐、温温度计、电电炉、暗暗房袋、暗暗盒、相相纸、剪剪刀、塑塑料盘、烧烧杯、量量筒、天天平、生生物样品品等2.试剂剂:显影液
2、液 (DD72通通用显影影液): 用50蒸馏水水1500ml,先将小小袋药粉粉溶解,再将大大袋药粉粉放入,搅动至至完全溶溶解,加水至至2500ml.待温度度降至220左左右时使使用.定影液液: 用50蒸馏水水1500ml将将药粉完完全溶解解后,加水至至2500ml,待温度度降至约约20时使用用.三、实验验原理与与方法显微摄影影使通过过摄影装装置,拍拍摄显微微镜视场场中被检检样品的的光学影影象的一一种技术术.具体实验验步骤以以简图表表示如下下:显微摄影影装置的的安装与与调试显微镜的的光路调调整:通通过调中中,使照照明光束束与显微微镜的光光学系统统的光轴轴合一.装入胶片片取景聚焦焦暴光: 1/11
3、5seec(应应先测光光:绿灯亮亮可以正正确暴光光)黑白胶片片的冲洗洗:显影 33minn停显显 100secc定影影 155minn水洗洗:流水冲冲洗300minn 晾晾干印相放大大:取景聚聚焦暴光显影 停显 110seec定定影 115miin水水洗:流水冲冲洗300minn 上光剪切切四、实验验结果与与分析 独立完完成摄影影操作、上上交一张张照片并并对所拍拍摄的样样品加以以简要说说明;分析拍拍摄中应应注意的的主要问问题及改改进措施施.实验二 细胞凝凝集反应应与细胞胞膜的渗渗透性一、实验验目的：了解细胞胞膜的表表面结构构；细胞胞膜的渗渗透性及及各种物物质进入入细胞膜膜的速度度。二、实验验的
4、原理理：（一）细细胞凝集集反应细胞膜是是由脂类类双分子子层镶嵌嵌蛋白质质构成的的单位膜膜，而脂脂类和蛋蛋白质又又与糖分分子结合合为细胞胞表面的的分枝状状糖外被被。凝集素是是一类可可逆结合合特异糖糖基的蛋蛋白质，具具有使细细胞凝集集、血型型鉴定、促促进淋巴巴细胞分分裂、防防害抗虫虫等作用用。凝集集素使细细胞凝集集是由于于它与细细胞外被被的寡糖糖链相连连接，起起到“桥桥”的作作用。（二）细细胞膜的的渗透性性细胞膜是是细胞与与环境之之间进行行物质与与能量交交换的一一种选择择性通透透屏障，可可选择性性地控制制不同物物质进出出细胞，各各种物质质跨膜运运输的方方式是不不同的，物物质的通通透性是是由物质质本
5、身属属性和膜膜的结构构性质（如如脂溶性性、分子子大小、所所带电荷荷等）共共同决定定的；另另外物质质穿膜的的通透性性还要受受到细胞胞生理状状态和环环境条件件（如麻麻醉剂、热热、辐射射、pHH值、盐盐不平衡衡等）的的影响。渗入红细细胞内的的物质，增增加了细细胞内的的渗透压压，使细胞胞外的水水分进入入红细胞胞，细胞胞膨胀破破裂，称称为溶血血。由于于各种物物质透入入细胞的的速度不不同，溶溶血的时时间不同同。三、实验验用品1.器材材: 显微微镜、天天平、载载玻片、滴滴管、离离心管、烧烧杯、110mll移液管管、试管管、试管管架2.材料料: 土豆豆块茎3.试剂剂: 鸭血红红细胞、PBS缓冲液、土豆、0.1
6、7mol/L氯化钠、0.32mol/L乙醇等试剂四、实验验方法(一) 细胞凝凝集反应应1 鸭血红红细胞悬悬液制备备新鲜鸭血血加抗凝凝剂，生生理盐水水洗次次，每次次r/minn，离心心miin，按按红细胞胞压积用用生理盐盐水配成成鸭鸭血红细细胞悬液液2 土豆豆凝集素素制备 土豆豆克，加加mml缓冲冲液，浸浸泡hh.3 细胞胞凝集反反应 土土豆凝集集素滴 鸭血血红细胞胞液滴载玻片上上混匀，静静置minn，镜检检对照照 滴 鸭血血红细胞胞液滴（二）细细胞膜的的渗透性性低渗渗溶液试试管一支支：鸭血血红细胞胞液mllddH22O 100ml 轻轻摇混匀匀，观察察颜色变变化，若若有溶血血，记下下自加入入鸭
7、血到到溶液透透明澄清清的时间间（注意意结合镜镜检）等渗渗溶液0.177moll/L氯氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵、0.17mol/L硝酸铵、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸铵、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮等种溶液进行同样实验，步骤同上五、结果果与讨论论1.简图图表示血血细胞凝凝集原理理;2.以图图表的方方式记录录细胞渗渗透性的的实验结结果并进进行比较较分析实验三线粒体体和液泡泡系的超超活染色色与观察察一实验验目的观察察动植物物活细胞胞内线粒粒体、液液泡系的的形态数数量与分分布；学习
8、习一些细细胞器的的超活染染色技术术二实验验原理活体体染色是是指对生生活有机机体的细细胞或组组织能着着色但又又无毒害害的一种种染色方方法.其目的的是显示示生活细细胞内的的某些结结构,而不影影响细胞胞的生命命活动和和产生任任何理化化变化以以致引起起细胞死死亡.活染技技术可用用来研究究生活状状态下的的细胞形形态结构构和生理理、病理理状态.根据所用用染色剂剂的性质质和染色色方法的的不同, 活体体染色可可分为体体内活染染与体外外活染两两类.体内活活染是以以胶体状状的染料料溶液注注入动植植物体内内,染料的的胶粒固固定于细细胞内某某些特殊殊结构内内以达到到易于识识别的目目的. 体外活活染又称称超活染染色，是
9、是由活的的动植物物分离出出部分细细胞或组组织小块块，以染染料溶液液浸染，染染料因其其电化化学特特性与被被染部分分相互吸吸引被选选择固定定在活细细胞的某某种结构构中而显显色但不是任任何染料料都可作作为活体体染色剂剂使用,一般应应选择那那些无毒毒或毒性性小的碱碱性染料料(易溶于于类脂质质)并配成成较稀的的溶液来来使用.詹纳斯斯绿和和中性红红两种碱碱性染料料是活体体染色中中重要的的染料，对对线粒体体和液泡泡系的染染色各有有专一性性詹纳纳斯绿可专一一性地对对对线粒粒体进行行活染,这是由由于线粒粒体内的的细胞色色素氧化化酶系的的作用,使染料料始终保保持氧化化状态(即有色色状态),呈蓝蓝绿色;而线粒粒体周
10、围围的细胞胞质中,这些染染料被还还原为无无色的色色基. 中性红红对液泡泡系的染染色具有有专一性性,只将活活细胞中中的液泡泡系染成成红色,细胞核核和细胞胞质不着着色,这可能能与液泡泡中的某某些蛋白白质有关关.三实验验用品器材材：显微镜、恒恒温水浴浴锅、剪剪刀、镊镊子、解解剖刀、载载玻片、盖盖玻片、吸吸管、牙牙签、吸吸水纸试剂剂：Rinngerr溶液氯化钠 .g氯化钾 .g氯化钙 .g1/550000詹纳斯斯绿溶溶液称取0.5g詹詹纳斯绿绿溶于于5mll Riingeer溶液液中,稍加热热(300-400)溶解,用滤纸纸过滤后后,即为1%原液.取1mll1%原原液加入入49mmlRiingeer溶
11、液液,即得1/50000工工作液,将其装装入棕色色瓶中备备用.最好现现配现用用,以保持持充分的的氧化能能力.1/330000中性红红溶液称取0.5g中中性红溶溶于500ml Rinngerr液,稍加热热(300-400)溶解,用滤纸纸过滤,装入棕棕色瓶中中于暗处处保存.临用前取取1mll1%原原液加入入29mmlRiingeer溶液液,即得1/30000工作作液,将其装装入棕色色瓶中备备用.材料料：人口口腔上皮皮细胞洋葱葱鳞茎内内表皮细细胞绿豆豆幼根根根尖四 实验验方法（一）线线粒体的的超活染染色与观观察人口口腔黏膜膜上皮细细胞线粒粒体的超超活染色色与观察察载玻片于于恒温水水浴：1/50000
12、詹詹纳斯绿绿溶液液滴人人口腔上上皮细胞胞黏液牙牙签刮取取染色minn，盖上上盖玻片片，吸去去周围染染液，显显微镜下下观察洋葱葱鳞茎内内表皮细细胞线粒粒体的超超活染色色与观察察载玻片于于恒温水水浴：1/50000詹詹纳斯绿绿溶液液滴洋洋葱鳞茎茎内表皮皮镊镊子撕取取染色minn，吸去去染液，加加Rinngerr溶液滴，盖盖上盖玻玻片，显显微镜下下观察（二）绿豆幼幼根根尖尖液泡系系的中性性红染色色观察载玻片于于恒温水水浴：初生绿豆豆幼苗根根尖（cm）纵纵切面切切片片1/30000中中性红溶溶液滴染色mmin，吸吸去染液液，加RRingger溶溶液滴滴，盖上上盖玻片片压扁根根尖，显显微镜下下观察五结果
13、果与分析析绘出出人口腔腔上皮细细胞洋葱葱鳞茎内内表皮细细胞示线线粒体的的形态与与分布并并简要分分析；绘出出绿豆幼幼根根尖尖细胞示示液泡系系的形态态与分布布并简要要分析实验四叶绿体体的分离离与荧光光观察一实验验目的通过过植物细细胞叶绿绿体的分分离，了了解细胞胞器分离离的一般般原理与与方法；了解解菠菜叶叶绿体的的形态、分分布与数数量二实验验原理组织匀浆浆后悬浮浮在等渗渗介质中中进行差差速离心心，是分分离细胞胞器的常常用方法法一个个颗粒在在离心场场中的沉沉降速率率取决于于颗粒的的大小、形形状、密密度、离离心力及及介质黏黏度等同一离离心场中中，同一一时间内内，密度度和大小小不同的的颗粒沉沉降速率率不同
14、依次增增加离心心力和离离心时间间，就能能使非均均一的悬悬浮液中中的颗粒粒按其大大小、密密度先后后分批沉沉降在离离心管底底部，从从而可分分批收集集各种亚亚细胞成成分在等渗溶溶液中将将叶绿体体匀浆液液在rr/miin的条条件下离离心mmin，去去除其中中的组织织残渣和和未破碎碎细胞，再再在rr/miin的条条件下离离心mmin，即即得沉淀淀的叶绿绿体三实验验用品器材材离心机、组组织捣碎碎机、显显微镜、天天平、离离心管、纱纱布、烧烧杯、量量筒、滴滴管、载载玻片、盖盖玻片材料料新鲜菠菜菜试剂剂.moll/L氯氯化钠溶溶液四实验验方法（一）叶叶绿体的的分离与与观察取新新嫩菠菜菜叶，洗洗净檫干干后去除除叶
15、梗和和粗脉，称称g于mll .mool/LL氯化钠钠溶液中中，装入入组织捣捣碎机；利用用组织捣捣碎机低低速匀浆浆minn；将匀匀浆用层纱布布过滤于于ml烧杯杯中；取滤滤液mml在r/mmin下下离心minn，取上上清；上清清液rr/miin，离离心mmin去上清清，沉淀淀即为叶叶绿体；.mool/LL氯化钠钠溶液悬悬浮沉淀淀；取叶叶绿体悬悬液滴滴于载玻玻片上，加加盖片：普通光镜镜下观察察；（二）菠菠菜叶徒徒手切片片观察新嫩菠菜菜叶斜切切面 片.moll/L氯氯化钠溶溶液 滴滴加盖片轻轻压：光光镜下观观察；五实验验结果与与分析记录所观观察结果果并加以以简要描描述;实验五 石蜡切切片法一 实验验目
16、的学习石蜡蜡切片法法,观察染染色结果果,了解其其反应原原理.二 实验验原理DNA经经弱酸(1mool/LLHcll)水解解,其上的的嘌呤碱碱和脱氧氧核糖之之间的键键打开,使脱氧氧核糖的的一端形形成游离离的醛基基,这些醛醛基在原原位与SSchiiff试试剂(无色品品红亚硫硫酸钠溶溶液)反应,形成紫紫红色的的化合物物,使细胞胞内含有有DNAA的部位位呈紫红红色阳性性反应.紫红色色的产生生,是由于于反应产产物的分分子内含含有醌基基,醌基是是发色团团,因此具具有颜色色.对照组组预先用用热三氯氯醋酸处处理,抽提去去细胞中中的DNNA而得得到阴性性反应,从而证证明了FFeullgenn反应的的专一性性.三
17、 实验验用品1 材料料Carnnoy液液固定的的洋葱根根尖切片片2 试剂剂Carrnoyy固定液液:3份95%酒精加加1份冰醋醋酸;1mool/LL Hccl:取取比重11.188的浓盐盐酸822.5mml,加加水至1100mml;Schhifff试剂: 先将2000mll蒸馏水水煮沸,由火上上取下,加入碱碱性品红红1g,充分搅搅拌溶解解.待溶液液冷至550时时,过滤到到磨口棕棕色试剂剂瓶中.加入1mmol/LHccl 220mll,冷至至25时加入入1g偏亚亚硫酸钠钠充分振振荡后盖盖紧瓶塞塞,放于暗暗处过夜夜.次日取取出,呈淡黄黄色或近近于无色色,加中性性活性炭炭一匙,约0.55 g,剧烈振
18、振荡1mmin,过滤后后即得无无色品红红.外包黑黑布与冰冰箱内贮贮存.亚硫酸酸钠水溶溶液(漂白液液)10%偏偏重亚硫硫酸钠水水溶液55ml,蒸馏水水1000,5,摇匀,塞紧瓶瓶塞.应现配配现用,防止因因SO2的逸出出而失效效.0.55%固绿绿酒精溶溶液(995%酒酒精溶解解)5%三三氯醋酸酸、四 实验验方法石蜡切片片溶蜡二甲甲苯I (3-5miin)溶蜡二甲甲苯III (3-5miin)1/2纯纯酒精+1/22二甲苯苯 (3-55minn)纯酒精II (2-3miin)纯酒精III (2-3miin)95%酒酒精 (2-33minn) 83%酒酒精 (2-33minn)70%酒酒精 (2-33
19、minn) 对照组组蒸馏水-5%三三氯醋酸酸,90,155minn实 验 70%酒精(22-3mmin)组 1moll/L Hcll-蒸馏水水(过一下下) 1moll/L Hcll 600,88-155minn(水浴浴)Schiiff试试剂 (660-990miin)亚硫酸水水(I II IIII) (各5miin)流水冲洗洗 (5-15mmin)蒸馏水0.5%固绿酒酒精溶液液 (1miin)(此步注注意防止止过染)蒸馏水70%酒酒精83%酒酒精95%酒酒精纯酒精II纯酒精III纯酒精IIII透明二甲甲苯I透明二甲甲苯III封片(贴上标标签,注明材材料,反应名名称,作者姓姓名及日日期)显微镜下
20、下观察: 实验组组: 细胞胞核呈紫紫红色,核仁及及细胞质质呈绿色色 对照组组: 因DNAA被提取取破坏,细胞核核无紫红红色五 实验验结果与与讨论1 验交交Feuulgeen反应应制片11张;2 简图图表示FFeullgenn反应的的染色结结果;3 说明明Feuulgeen反应应中设立立对照组组的必要要性.实验六 植物物染色体体标本的的制备与与观察一、实验验目的学习植物物染色体体标本的的制各技技术，字字握染色色体的计计数了解染色色体的生生物学意意义二、实验验用品1、材料料洋葱根尖尖2、试剂剂1Caarnooy固定定液20.1秋秋水仙素素溶液卡宝品红红染液配方I原液A：称取33g碱性性品红，溶溶于
21、l000mll 700酒精精中(此液可可无限期期保存)。原液B：取100ml原原液A，加入入90mml 115石石炭酸(苯酚)水溶液液(两周内内使用)。染色液: 555ml原原液B加6m1冰醋酸酸和6mml 337甲甲醛(此液适适用于植植物原生生质体培培养中细细胞核和和核分裂裂的染色色)。配方III:取配方II中的染染色液22100m1，加900一98mm1 445醋醋酸和118g山梨梨醇(此液适适用于核核核染色色体的一一般形态态观察，具具有广泛泛的适用用性)。三、实验验方法1.取材材：切取取o5cmm长的洋洋葱根尖尖部分。2.预处处理：将将切下的的根尖浸浸入o1秋水水仙素液液中，室室温下处处
22、理34h。也也可把根根尖浸入入小烧杯内的的自来水水中，杯杯内加冰冰两小块块，在00一4冰箱箱内低温温处理224h左左右。3固定定；取出出根尖，投投入caarnooy液中中固定22244h，换换入700酒精精，暂时时保存。4.水解解；把根根尖投入入预热的的5860 lmm01L热Hcll中，恒恒温条件件下水解解14一15mmin。5染色色：去HHcl,加卡宝宝品红几几滴，染染色510 minn(也可可在冰箱箱内染色色1224hh)。6漂洗：吸去卡卡宝品红红，用漂漂洗液换换洗23次，每每次12miin。7酶解解；在载载玻片上上切取根根尖着色色深的部部分，浸浸入小酒酒杯内112滴滴混合酶酶液中，室室
23、温下酶酶解400minn左右或或在288温箱箱中酶解解20mmin左左右。8洗涤涤：吸去去酶液，加加蒸馏水水，用吸吸管换洗洗几次，除除去残留留酶液后后加入445醋醋酸。9压片片：用吸吸管从醋醋酸中吸吸取材料料，置干干净载坡坡片上，材材料周围围保留半半滴455醋酸酸盖上上盖玻片片，其上上放一片片吸水纸纸。左手手指压住住吸水纸纸的左边边，右手手指从吸吸水纸的的左端向向右方轻轻轻抹去去。再用用铅笔擦擦头从盖盖片上轻轻轻敲打打，使细细胞均匀匀散开。10镜镜检：把把压好的的片子放放显微镜镜下，先先观察细细胞分散散状况和和中期分分裂相的的多少，再再检查分分裂中期期细胞中中的染色色体是否否完全散散开。如如若
24、染色色体分散散不好而而难以分分辨和计计数，可可取下片片子，平平放桌面面上，用用手指隔隔着吸水水纸在盖盖玻片上上稍施压压力，如如果操作作细心，用用力适度度，便可可很容易易得到染染色体分分散良好好的压片片标本，供供观察，计计数和照照相用。11封封存：压压好的片片子如果果来不及及观察或或照相，必必须进行行暂时封封存。封封存时先先在盖坡坡片四周周各放麦麦粒大石石蜡一块块，然后后用烧热热的解剖剖针迅速速熔化石石蜡，使使盖片四四周严密密封闭。封封好的片片于可放放培养皿皿内湿滤滤纸上的的火柴棒棒支架上上，盖上上培养皿皿，可放放冰箱内内保存223天天。及培养的的细胞或或愈伤组组织，经经carrborrfucc
25、hznn染色，都都能得到到良好的的结果。四、实验验结果核核分析验交压片片标本112张张，要求求细胞分分散均匀匀，形态态完整，中中期分裂裂相中染染色体数数目齐全全，互不不重叠，能能够进行行准确计计数和照照相。实验七 动物物细胞培培养 细胞培培养是用用无菌操操作的方方法将动动物体内内的组织织(或器官官)取出，模模拟动物物体内的的生理条条件，在在体外进进行培养养使其其不断地地生长、繁繁殖，人人们借以以观察细细胞的生生长、繁繁殖、细细胞分化化以及细细胞衰老老等过程程的生命命现象。 细胞培培养的突突出优点点，一是是便于研研究各种种物理、化化学等外外界因素素对细胞胞生长发发育和分分化等的的影响；二是细细胞
26、培养养便于人人们对细细胞内结结构(如细胞胞骨架等等)、细胞胞生长及及发育等等过程的的观察。因因而细胞胞培养是是探索和和指示细细胞生命命活动规规律的种简便便易行的的实验技技术，同同时我们们也不可可忽略的的另一个个因素，那那就是它它脱离乐乐生物机机体后的的些变化化。细胞培养养技术目目前已广广泛地被被应用于于生物学学的各个个领域。如如分子生生物学、细细胞生物物学、遗遗传学、免免疫学、肿肿痛学及及病毒学学等 为此有有必要使使学生在在细胞培培养方面面得到一一些初步步的感性性知识，了了解动物物细胞培培养的基基本操作作过程，观观察体外外培养细细胞的生生长特征征，对原原代细胞胞与传代代细胞有有一个基基本概念念
27、。本实验分分两次进进行即即原代细细胞和传传代细胞胞的培养养与观察察。I原代代细胞培培养一、实验验目的：了解原代代细胞培培养的基基本方法法及操作作过程。学学习细胞胞消化、细细胞计数数、营养养液的配配制及酸酸碱度的的调节。初初步掌握握无菌操操作方法法。二、实验验原理原代细胞胞培养是是指直接接从动物物体内获获取的细细胞、组组织或器器官，经经体外培培养后，直直到第一一次传代代为止。这这种培养养，首先先用无菌菌操作的的方法，从从动物体体内取出出所需的的组织(或器官官)，经消消化，分分散为单单个游离离的细胞胞，在人人工培养养下，使使其不断断的地生生长及繁繁殖。细胞培养养是一种种操作繁繁琐而又又要求十十分严
28、谨谨的实验验技术。要要使细胞胞能在体体外长期期生长，必必须满足足两个基基本要求求：一是是供给细细胞存活活所必需需的条件件，如适适量的水水、无机机盐、氨氨基酸、维维生素、葡葡萄糖及及其有关关的生长长因子、氧氧气、适适宜的温温度，注注意外环环境酸碱碱度和渗渗透压的的调节。二二是严格格控制无无菌条件件。三、实验验用品1、器材材解剖剪、解解剖镊、眼眼科剪(尖头、弯弯头)、眼科科镊(尖头、弯弯头)、培养养皿、量量筒、试试管、锥锥形瓶、吸吸管、橡橡皮头、培培养瓶(小方瓶瓶或中方方瓶)等。上上述器材材均须彻彻底清洗洗、烤干干、包装装好，999xll04Pa(15磅)灭菌300minn备用。此外，还还有显微微
29、镜、血血细胞计计数器、血血细胞计计数板、酒酒精灯、酒酒精棉球球、碘酒酒棉球、试试管架、标标记笔、解解剖板等等。2、试剂剂平衡盐液液：Haank液液细胞消化化液：常常用的有有025胰胰蛋白酶酶(活性1：2500)05水解乳乳白蛋白白Haank液液(简称乳乳汉液)犊牛血清清4NaaHCOO310000单位ml青、链链霉素液液以上溶液液均经适适当包装装，灭菌菌后备用用。3、材料料出生后223天天乳鼠肾肾脏。四、实验验方法1、操作作者首先先进行手手的清洗洗与消毒毒，再将将实验用用品放在在适合的的位置，然然后配制制营养液液及调节节平衡盐盐液的ppH值。(1)乳乳鼠肾细细胞营养养液的配配制：05LH液99
30、0犊牛血清清 1001万单位位m11青、链链霉素 加至约约100单位ml74NaHHCO33 调调pH至68770 （2）平平衡盐液液Haank液液的调节节：用744NaHHCO33 调pH至68770 2迅速速处死动动物采用剪断断动物颈颈动脉放放血方法法处死动动物，然然后用水水浸湿体体表的被被毛(或新洁洁尔灭溶溶液)，将动动物固定定在解剖剖板上，使使其背都都向上，先先用碘酒酒棉球消消毒背部部的被毛毛，然后后再用酒酒精棉球球擦拭碘碘酒擦过过的部位位。3取肾肾在腰部的的后缘用解剖剖镊提起起皮肤，用用解剖剪剪剪开皮皮肤，将将剪开的的皮肤分分别拉向向两侧。此此时，再再换一把把解剖剪剪及解剖剖镊，剪剪
31、开背部部的肌肉肉，暴露露出腹腔腔，即可可见到肾肾脏，用用弯头眼眼科镊取取出肾脏脏，置于于无菌培培养皿中中。4剪肾肾用眼科剪剪及镊将将肾膜剪剪破，并并将其剥剥向肾门门，去肾肾膜及脂脂肪。用用Hannk液洗洗涤一次次，将洗洗过的肾肾脏转入入另一培培养皿中中。换一一把眼科科剪及镊镊，沿肾肾脏的纵纵轴剪开开。去掉掉肾盂部部分，将将肾剪成成数块，然然后用HHankk液洗涤涤次。将将洗过的的肾块转转移入无无菌的青青霉素瓶瓶中。用用弯头眼眼科剪将将肾剪成成1mmm3大小的的块，组组织块的的大小应应尽量均均匀一致致，再用用Hannk液洗洗涤23次，直直到液体体澄清为为止。5消化化及分散散组织块块将上步清清洗过
32、的的Hannk液吸吸掉，按按组织块块体积的的566倍加入入0.225胰胰蛋白酶酶液(ppH为7678)、置置于377水浴中中进行消消化。消消化时间间在200-40mmin。每每隔100minn摇动次青霉霉素瓶，以以便组织织块散开开，以利利继续消消化，直直到组织织变成松松散、粘粘稠状，并并且颜色色略变为为白色为为止。这这时可从从水浴中中取出青青毒素瓶瓶，吸去去胰蛋白白酶液、此此时再用用Hannk液洗洗涤23次。然然后，加加入少量量乳汉液液，用吸吸管反覆覆吹打组组织块直到大大部分组组织块均均分散成成混淆的的细胞悬悬液为止止。此时时，可将将分散的的细胞悬悬液经过过灭菌的的纱布(或不诱诱钢网)进行过过
33、滤，以以去除部部分较大大的组织织碎片。6计数数与稀释释从上步滤滤过的细细胞悬液液中吸取取1ml细胞液液，进行行计数。将将细胞液液滴于血血细胞计计数板上上，按白白细胞计计数法进进行计数数，计数数后用营营养液进进行稀释释。稀释释后的浓浓度一般般以每mml含细胞胞30-50万为为宜。7分装装与培养养将稀释好好的细胞胞悬液分分装于培培养瓶中中(一般5mm1/方瓶瓶，lmml青霉霉素瓶)，盖紧紧瓶塞，在在培养瓶瓶上面做做好标志志以免免放反，并并在瓶口口处注明明细胞，组组别及日日期。然后放于于培养架架上，并并轻轻摇摇动培养养架避避免细胞胞堆积，以以便细胞胞能均勾勾分布。最最后将培培养瓶置置于377条件件下
34、进行行培养。8观察察置于377培养养的细胞胞需逐逐日进行行观察主要观观察： (1)培养物物是否被被污染，如如培养液液变为黄黄色且混混浊，表表示该瓶瓶被污染染。 (2)细胞生生长状况况与培养养液颜色色的变化化，如培培养液变变为紫红红色，一一般细胞胞生长不不好。可可能是瓶瓶塞未盖盖紧或营营养液ppH过高高。 (3)培养液液变为桔桔红色，般显示细胞生长良好。 经过l一2天培养养后若若细胞生生长情况况较差或或培养液液变红了了，则可可换一次次营养液液。换液液时也要要注意无无菌操作作，在酒酒精灯旁旁，倒去去原培养养瓶中的的营养液液，再加加入等体体积新配配营养液液，pHH7o。若经经233天后，细细胞营养养
35、液变黄黄，此时时表示细细胞已生生长。如如果希望望细胞长长得更好好些，此此时也可可换液，换换时，所所用的溶溶液称为为维持液液，它与与营养液液的组成成完全相相同，仅仅所用血血清量为为5%。以以后每隔隔3-44天(是视细细胞液PPH值而而定)更换一一次维持持液。待待细胞已已基本长长成致密密单层时时，此时时即可进进行传代代培养了了。II、传传代细胞胞培养与与观察一、实验验目的了解传代代细胞的的传代方方法及操操作过程程，学习习观察体体外培养养细胞的的形态及及生长状状况二、实验验原理 传代代培养是是指细胞胞从一个个培养瓶瓶以1：2或1：2以上的的比例转转移，接接种到另另一培养养瓶的培培养。 这种种培养，第
36、第一步也也是制备备细胞悬悬液，当当细胞长长成致密密单层时时，它很很容易被被蛋白水水解酶和和EDTTA)所所破坏。所所以般般采用胰胰蛋白酶酶和EDDTA(乙二胺胺四乙酸酸盐)的混合合物，做做为消化化液。三、实验验用品1、器材材同上2、试剂剂L磷酸盐盐缓冲液液(PBBs)无钙、镁镁溶液细胞消化化液：005胰蛋蛋白酶和和04%EEDTAAEMEMM液3%谷氨氨酰胺05台盘蓝蓝染液等等3、材料料鼠肾原代代细胞四、实验验方法在做传代代细胞培培养之前前，首先先将培养养瓶置于于显微镜镜下，观观察培养养瓶中细细胞是否否已长成成致密单单层，如如已长成成单层，即即可进行行细胞的的传代培培养。1.营养养液配制制:
37、EMEEM液 990% 犊牛血血清 100% 双抗(11万单位位m11) 加至至约1000单位位m11 3谷谷氨酰胺 1m1 74NaHHCO33 调调pH至68770 2换液液:在酒精灯灯旁打开开瓶塞，倒倒去瓶中中的细胞胞营养液液，然后后加入适适量的无无钙，锈锈离子的的PBss液，轻轻轻摇动动，将溶溶液倒出出。3.消化化与分装装在上述瓶瓶中加入入适量消消化液(0.002%EEDTAA或0.004EDTTA十o5胰蛋蛋白酶液液各一半半)以盖满满细胞为为宜，置置于室温温，停留留233minn后，翻翻转培养养瓶，肉肉眼观察察细胞单单层是否否出现缝缝隙(针孔大大小的空空隙)，如出出现缝隙隙，即可可倒
38、去消消化液;如末出出现缝隙隙，则可可将瓶翻翻回，继继续进行行消化，直直到出现现缝隙为为让。此此时，可可倒去消消化液，加加入新配配制的营营养液33m1,以终止止消化。然然后用吸吸管吸取取培养瓶瓶中的营营养液，反反复吹打打瓶壁上上的细胞胞层至瓶瓶壁细胞胞全部脱脱落下来来为止。此此时，可可继续轻轻轻地吹吹打细胞胞悬液，以以使细胞胞散开。随随之即可可补加营营养液进进行分装装。4培养养分装好的的细胞瓶瓶上，做做好标志志，注明明细胞代代号、日日期。置置于培养养架上，轻轻摇使细细胞均匀匀分布，以以免堆积积成团。然然后置于于37培养。5.观察察(1)观观察体外外培养细细胞的几几个问题题；细胞培养养24hh后，
39、即即可进行行观察，观观察的重重点如下下：A.首先先要观察察培养细细胞是否否污染。主主要观察察培养液液颜色的的变化及及混浊度度B.观察察培养姬姬颜色变变化及细细胞是否否生长。C.如细细胞已生生长，则则要观察察细胞的的形态特特征并判判断其所所处的生生长阶段段。观察察时可参参照(22)的描描述进行行。D观察察完毕，可可用台盘盘蓝染液液对细胞胞进行染染色。以以确定死死、活细细胞的比比例。(2)细细胞的生生长阶段段及其形形态特征征传代培养养的细胞胞需逐日日进行观观察，注注意细胞胞有无污污染，培培养液颜颜色的变变化及细细胞生长长的情况况。般般中层培培养的细细胞，从从培养开开始，经经过生长长、繁殖殖、衰老老
40、及死亡亡的全过过程。它它是一个个连续的的生长过过程，但但为了观观察及描描述，人人为地将将具分为为5个时期期，但各各期间无无明显绝绝对界限限。现分分别描述述如下： A游游离期：当细胞胞经消化化分散成成单个细细胞后，由由于细胞胞原生质质的收缩缩相表面面张力以以及细胞胞膜的弹弹性。所所以，此此时细胞胞多为圆圆形，折折光率高高，此期期可延续续数h。 B吸吸附期(贴壁)：由于于细胞的的附壁持持性，细细胞悬液液静置培培养一段段时间(约788h)后后，便附附着在瓶瓶壁上(此期不不同细胞胞所需时时间不同同)。在显显微镜下下观察时时可见瓶瓶壁上有有各种形形态的细细胞，如如圆形、扁扁形、短短菱形。细细胞的特特点，大大多立体体感强，细细胞内颗颗粒少，透透明。 C.繁繁殖期：培养ll2h以以后直到到72hh，细胞胞进入繁繁殖期，加加速了细细胞生长长和分裂裂。此期期包括由由几个细细胞形成成的细胞