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1、生物芯片片技术简简介生物芯片片技术通通过微加加工工艺艺在厘米米见方的的芯片上上集成有有成千上上万个与与生命相相关的信信息分子子，它可可以对生生命科学学与医学学中的各各种生物物化学反反应过程程进行集集成，从从而实现现对基因因、配体体、抗原原等生物物活性物物质进行行高效快快捷的测测试和分分析。它它的出现现将给生生命科学学、医学学、化学学、新药药开发、生生物武器器战争、司司法鉴定定、食品品与环境境监督等等众多领领域带来来巨大的的革新甚甚至革命命。生物芯片片技术研研究的背背景原定于220055年竣工工的人类类30亿亿碱基序序列的测测定工作作（Huumann Geenomme PProjjectt，基因
2、因组计划划）由于于高效测测序仪的的引入和和商业机机构的介介入已经经完成，。怎怎样利用用该计划划所揭示示的大量量遗传信信息去探探明人类类众多疾疾病的起起因和发发病机理理，并为为其诊断断、治疗疗及易感感性研究究提供有有力的工工具，则则是继人人类基因因组计划划完成后后生命科科学领域域内又一一重大课课题。现现在，以以功能研研究为核核心的后后基因组组计划已已经悄然然走来，为为此，研研究人员员必需设设计和利利用更为为高效的的硬软件件技术来来对如此此庞大的的基因组组及蛋白白质组信信息进行行加工和和研究。建建立新型型、高效效、快速速的检测测和分析析技术就就势在必必行了。这这些高效效的分析析与测定定技术已已有多
3、种种，如DDNA质质谱分析析法，荧荧光单分分子分析析法，杂杂交分析析等。其其中以生生物芯片片技术为为基础的的许多新新型分析析技术发发展最快快也最具具发展潜潜力。早早在19988年年，Baainss等人就就将短的的DNAA片段固固定到支支持物上上，以反反向杂交交的方式式进行序序列测定定。当今今，随着着生命科科学与众众多相关关学科（如如计算机机科学、材材料科学学、微加加工技术术、有机机合成技技术等）的的迅猛发发展，为为生物芯芯片的实实现提供供了实践践上的可可能性。生生物芯片片的设想想最早起起始于880年代代中期，990年代代美国AAffyymettrixx公司实实现了DDNA探探针分子子的高密密度
4、集成成，即将将特定序序列的寡寡核苷酸酸片段以以很高的的密度有有序地固固定在一一块玻璃璃、硅等等固体片片基上，作作为核酸酸信息的的载体，通通过与样样品的杂杂交反应应获取其其核酸序序列信息息。生物物芯片由由于采用用了微电电子学的的并行处处理和高高密度集集成的概概念，因因此具有有高效、高高信息量量等突出出优点。基因芯片片技术的的前景 基基因芯片片用途广广泛，在在生命科科学研究究及实践践、医学学科研及及临床、药药物设计计、环境境保护、农农业、军军事等各各个领域域有着广广泛的用用武之地地。这些些无疑将将会产生生巨大的的社会和和经济效效益。有有着广泛泛的经济济、社会会及科研研前景。因因此，国国际上一一些著
5、名名的政治治家, 投资者者和科学学家均看看好这一一技术前前景。认认为基因因芯片以以及相关关产品产产值有可可能超过过微电子子芯片, 成为为下一世世纪最大大的高技技术产业业，具有有巨大的的商业潜潜力。一一、社会会前景基因因芯片可可为研究究不同层层次多基基因协同同作用提提供手段段。这将将在研究究人类重重大疾病病的相关关基因及及作用机机理等方方面发挥挥巨大的的作用。人人类许多多常见病病如肿瘤瘤、心血血管病、神神经系统统退化性性疾病、自自身免疫疫性疾病病及代谢谢性疾病病等均与与基因有有密切的的关系。 生生物芯片片能为现现代医学学发展提提供强有有力的手手段，促促进医学学从“系系统、血血管、组组织和细细胞层
6、次次”（第第二阶段段医学）向向“DNNA、RRNA、蛋蛋白质及及其相互互作用层层次”（第第三阶段段医学）过过渡，使使之尽快快进入实实际应用用。DNAA芯片技技术可用用于水稻稻抗病基基因的分分离与鉴鉴定。水水稻是我我国的主主要粮食食作物，病病害是提提高水稻稻产量的的主要限限制因素素。利用用转基因因技术进进行品种种改良,是目前前最经济济有效的的防治措措施。而而应用这这一技术术的前提提是必须须首先获获得优良良基因克克隆,但但目前具具有专一一抗性的的抗病基基因数量量有限，限限制了这这一技术术的应用用。而基基因芯片片用于水水稻抗病病相关基基因的分分离及分分析，可可方便的的获取抗抗病基因因，产生生明显的的
7、社会效效益。在医医药设计计、环境境保护、农农业等各各个领域域，基因因芯片均均有很多多用武之之地，成成为人类类造福自自身的工工具 二二、经济济前景美国国总统克克林顿在在19998年11月对全全国的演演讲中指指出“未未来十二二年, 基因芯芯片将为为我们一一生中的的疾病预预防指点点迷津”。119988年6月月27日日华盛顿顿邮报在在报道MMotoorolla进入入基因芯芯片领域域时, 认为这这将造福福于子孙孙后代。美美国“FForttunee”杂志志在19997年年3月重重点介绍绍了基因因芯片技技术, 论述了了未来产产业化的的前景,该文预预测“在在20005年仅仅仅在美美国用于于基因组组研究的的芯片
8、销销售额将将达约550亿美美元, 20110年有有可能上上升为4400亿亿美元”。这这还不包包括用于于疾病预预防及诊诊治以及及其它领领域中的的基因芯芯片，这这部分预预计比基基因组研研究用量量还要大大上百倍倍。由于生物物芯片的的重大意意义和巨巨大的商商业潜力力, 北北美和欧欧洲许多多国家的的政府和和公司投投入大量量人力物物力来推推动此项项研究工工作。如如美国的的国立卫卫生研究究院、商商业部高高技术署署、国防防部、司司法部和和一些大大公司以以及风险险投资者者投入了了数亿美美元的巨巨资。基基因芯片片以及相相关产品品产业有有可能成成为下一一世纪最最大的高高技术产产业之一一。 三三、社会会前景1、高高密
9、度芯芯片的批批量制备备技术：利用平平面微细细加工技技术，结结合高产产率原位位DNAA合成技技术，制制备高密密度芯片片是重要要的发展展趋势。 22、高密密度基因因芯片的的设计将将会成为为基因芯芯片发展展的一个个重要课课题，它它决定基基因芯片片的应用用和功能能。利用用生物信信息学方方法，根根据被检检测基因因序列的的特征和和检测要要求，设设计出可可靠性高高，容错错性好，检检测直观观的高密密度芯片片是决定定其应用用的关键键。 3、生生物功能能物质微微阵列芯芯片的研研制：发发展高集集成度的的生物功功能单元元的微阵阵列芯片片，特别别是发展展蛋白质质、多肽肽、细胞胞和细胞胞器、病病毒等生生物功能能单元的的高
10、密度度自组装装技术，研研制和开开发有批批量制备备潜力的的生物芯芯片制备备技术。表达谱基基因芯片片表达谱基基因芯片片是用于于基因功功能研究究的一种种基因芯芯片。是是目前技技术比较较成熟，应应用最广广泛的一一种基因因芯片检测原理理用不同的的荧光染染料通过过逆转录录反应将将不同组组织或细细胞的mmRNAA分别标标记成不不同的探探针，将将探针混混合后与与芯片上上的基因因进行杂杂交、洗洗涤，用用特有的的荧光波波长扫描描芯片，得得到这些些基因在在不同组组织或细细胞中的的表达谱谱图片，再再通过计计算机分分析出这这些基因因在不同同组织中中表达差差异的重重要信息息。是基基因功能能研究的的一种重重要手段段。应用意
11、义义 对来源源于不同同个体（正正常人与与患者）、不不同组织织、不同同细胞周周期、不不同发育育阶段、不不同分化化阶段、不不同病变变、不同同刺激（包包括不同同诱导、不不同治疗疗阶段）下下的细胞胞内的mmRNAA或逆转转录后产产生的ccDNAA与表达达谱基因因芯片进进行杂交交，可以以对这些些基因表表达的个个体特异异性、组组织特异异性、发发育阶段段特异性性、分化化阶段特特异性、病病变特异异性、刺刺激特异异性进行行综合的的分析和和判断，迅迅速将某某个或几几个基因因与疾病病联系起起来，极极大地加加快这些些基因功功能的确确立，同同时进一一步研究究基因与与基因间间相互作作用的关关系。所所以，无无论何种种研究领
12、领域，利利用表达达谱基因因芯片可可以获得得大量与与研究领领域相关关的基因因，使研研究更具具目的性性和系统统性，同同时也拓拓宽研究究领域。 表达谱基因芯片与传统Northern Blot比较 采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的Northern Blot相比有许多重要的优点：检测系统统的微型型化，对对样品等等需要量量非常小小同时研究究上万个个基因的的表达变变化，研研究效率率明显提提高能更多地地揭示基基因之间间表达变变化的相相互关系系，从而而研究基基因与基基因之间间内在的的作用关关系检测基因因表达变变化的灵灵敏度高高，可检检测丰度度相差几几个数量量级的表表达情况况节约费用用和时间间制作技术术光引
13、导原原位合成成原位合成成适于制制造寡核核苷酸和和寡肽微微点阵芯芯片，具具有合成成速度快快、相对对成本低低、便于于规模化化生产等等优点。照照相平板板印刷技技术是平平板印刷刷技术与与DNAA和多肽肽固相化化学合成成技术相相结合的的产物，可可以在预预设位点点按照预预定的序序列方便便快捷地地合成大大量寡核核苷酸或或多肽分分子。在在生物芯芯片研制制方面享享有盛誉誉的美国国Afffymeetriix公司司运用该该技术制制造大规规模集成成Gennechhip。原原位合成成后的寡寡核苷酸酸或多肽肽分子与与玻片共共价连接接。它用用预先制制作的蔽蔽光板和和经过修修饰的44种碱基基，通过过光进行行活化从从而以固固相
14、方式式合成微微点阵。合合成前，预预先将玻玻片氨基基化，并并用光不不稳定保保护剂将将活化的的氨基保保护起来来。聚合合用单体体分子一一端活化化另一端端受光敏敏保护剂剂的保护护。选择择适当的的挡光板板使需要要聚合的的部位透透光，不不需要发发生聚合合的位点点蔽光。这这样，光光通过挡挡光板照照射到支支持物上上，受光光部分的的氨基解解保护，从从而与单单体分子子发生偶偶联反应应。每次次反应在在成千上上万个位位点上添添加一个个特定的的碱基。由由于发生生反应后后的部位位依然接接受保护护剂的保保护，所所以可以以通过控控制挡光光板透光光与蔽光光图案以以及每次次参与反反应单体体分子的的种类，就就可以实实现在特特定位点
15、点合成大大量预定定序列寡寡核苷酸酸或寡肽肽的目的的。由于于照相平平板印刷刷技术每每步的合合成效率率较低（995%）2，合合成300nt的的终产率率仅为220%，所所以该技技术只能能合成330ntt左右长长度的寡寡核苷酸酸。在此此基础上上，有人人将光引引导合成成技术与与半导体体工业所所用的光光敏抗蚀蚀技术相相结合，以以酸作为为去保护护剂，将将每步合合成产率率提高到到99%，但制制造工艺艺复杂程程度增加加了许多多3。所以以如何简简便地提提高合成成产率是是光引导导原位合合成技 术有待待解决的的问题。(见下图图)打印原位位合成压电打印印原位合合成的方方式类似似于喷墨墨打印机机，合成成原理与与传统的的核
16、酸或或寡肽固固相合成成技术相相同。合合成过程程为：合合成前以以与光引引导原位位合成类类似的方方式对芯芯片片基基进行预预处理，使使其带有有反应活活性基团团，例如如伯氨基基。同时时，将合合成用前前体分子子（DNNA合成成碱基、ccDNAA和其它它分子）放放入打印印墨盒内内，由电电脑依据据预定的的程序在在xyzz方向自自动控制制打印喷喷头在芯芯片支持持物上移移动，并并根据芯芯片不同同位点探探针序列列需要将将特定的的碱基合合成前体体试剂（不不足纳升升）喷印印到特定定位点。喷喷印上去去的试剂剂即以固固相合成成原理与与该处支支持物发发生偶联联反应。由由于脱保保护方式式为酸去去保护，所所以每步步延伸的的合成
17、产产率可以以高达999%，合合成的探探针长度度可以达达到400500nt。以以后每轮轮偶联反反应依据据同样的的方式将将需要连连接的分分子喷印印到预定定位点进进行后续续的偶联联反应。类类似地重重复此操操作可以以在特定定位点按按照每个个位点预预定的序序列合成成出大量量的寡核核苷酸探探针。点 样 法点样法在在多聚物物的设计计方面与与原位合合成技术术相似。只只是合成成工作用用传统的的DNAA、多肽肽合成仪仪或PCCR扩增增或体内内克隆等等方法完完成。大大量制备备好的核核酸探针针、多肽肽、蛋白白等生物物大分子子再用特特殊的自自动化微微量点样样装置将将其以较较高密度度互不干干扰地印印点于经经过特殊殊处理的
18、的玻片、尼尼龙膜、硝硝酸纤维维素膜上上，并使使其与支支持物牢牢固结合合。支持持物需预预先经过过特殊处处理，例例如多聚聚赖氨酸酸或氨基基硅烷等等。亦可可用其它它共价结结合的方方法将这这些生物物大分子子牢牢地地附着于于支持物物上。现现在已经经有比较较成型的的点样装装置出售售，例如如美国BBioddot公公司的“喷喷印”仪仪以及CCarttesiian Tecchnoologgiess公司的的Pixx-Syys NNQ/PPA系列列“打印印”仪。这这些自动动化仪器器依据所所配备的的“打印印”或“喷喷印”针针将生物物大分子子从多孔孔板吸出出直接“打打印”或或“喷印印”于芯芯片片基基上(见见下图)。“打
19、打印”时时针头与与芯片片片基表面面发生接接触而“喷喷印”时时针头与与片基表表面保持持一定的的距离。所所以，“打打印”仪仪适宜制制作较高高密度的的微阵列列（例如如25000点/cm22），“喷喷印”法法由于“喷喷印”的的斑点较较大，所所以只能能形成较较低密度度的探针针阵列，通通常4000点/cm22。点样样法制作作芯片的的工艺比比较简单单便于掌掌握、分分析设备备易于获获取，适适宜用户户按照自自己的需需要灵活活机动地地设计微微点阵，用用于科研研和实践践工作。目前，除除了在生生物芯片片研制方方面享有有盛誉的的Afffymeetriix公司司等个别别公司使使用原位位合成技技术制造造芯片外外，大多多中小
20、型型公司普普遍采用用点样技技术制作作生物芯芯片。检测和分分析检测的原原理 荧荧光标记记和检测测是利用用荧光标标记的DDNA碱碱基在不不同的波波长下吸吸收和发发射光。在在微阵列列分析中中，多色色荧光标标记可以以在一个个分析中中同时对对二个或或多个生生物样品品进行多多重分析析，多重重分析能能大大地地增加基基因表达达和突变变检测结结果的准准确性，排排除芯片片与芯片片间的人人为因素素。荧光光为基础础的分析析使得利利用一些些先进的的数据获获得技术术成为可可能，包包括共聚聚焦扫描描的CCCD照相相技术。用用于芯片片制备的的无孔基基质表面面使得芯芯片检测测中的生生化反应应大大受受益。玻玻璃基质质所需的的反应
21、体体积（55-2000ull）比传传统的分分析要小小的多（55-500ml），小小反应体体积降低低了试剂剂的消耗耗，增加加了微阵阵列分析析中核酸酸的反应应物的浓浓度（00.1-1umm）,相相对于传传统分析析（0.1-44pm）增增加10000000倍之之多，浓浓度的增增加又能能加速杂杂交的速速度，从从而减少少获得强强荧光信信号的时时间，并并可用盖盖玻片封封闭杂交交槽进行行杂交反反应。 对于以以核酸杂杂交为原原理的检检测技术术，主要要过程为为：首先先用生物物素标记记经扩增增（也可可使用其其它放大大技术）的的靶序列列或样品品然后再再与芯片片上的大大量探针针进行杂杂交。用用链霉亲亲和素(strre
22、pttaviidinn)偶联联的荧光光素（常常用的荧荧光素还还有laassaaminne 和和phyycoeerytthriin）作作为显色色物质，图图象的分分析则用用落谢荧荧光显微微镜、激激光共聚聚焦显微微镜或其其它荧光光显微装装置对片片基扫描描，由计计算机收收集荧光光信号，并并对每个个点的荧荧光强度度数字化化后进行行分析。由由于完全全正常的的 Waatsoon-CCricck配对对双链要要比具有有错配(missmattch)碱基的的双链分分子具有有较高的的热力学学稳定性性，所以以，前者者的荧光光强度要要比后者者强出55-355%。从从这一点点来说，该该检测方方法是具具有一定定特异性性的，而
23、而且荧光光信号的的强度还还与样品品中靶分分子含量量呈一定定的线性性关系。荧光探针针目前用荧荧光探针针作为检检测信号号的仪器器，主要要是考虑虑荧光标标记所要要检测的的DNAA的效率率，以及及荧光探探针本身身的发光光效率和和光谱特特性。（一）PPCR过过程中的的DNAA标记 11.末端端标记：在引物物上标记记有荧光光探针，在在DNAA扩增过过程时，使使新形成成的DNNA链末末端带有有荧光探探针。 22 .随随机插入入：选择择四种缄缄机基，使使其中一一种或几几种挂有有荧光探探针，在在PCRR过程中中，带有有荧光探探针的碱碱基和不不带荧光光探针的的碱基，同同时参与与DNAA链的形形成。由由于带有有荧光
24、探探针的碱碱基，可可能影响响PCRR的产物物，因此此，需要要调整荧荧光标记记的碱基基与未标标记的碱碱基比率率，以使使得PCCR产量量和带有有荧光探探针的碱碱基在DDNA的的插入率率达到一一个平衡衡的水平平，使杂杂交信号号最强。 （二）RNNA转录录过程的的荧光探探针标记记 某一种种碱基标标记有荧荧光，但但要求该该种碱基基标记与与非标记记按一定定比率混混合，以以达到最最佳转录录效果。 （三）荧光光探针的的选择 主要要考虑以以下几个个因素： 荧光光探针的的激发和和发射频频谱； 荧光光探针的的发光效效率； 荧光光探针对对PCRR或逆转转录效率率的影响响； 不同荧荧光探针针的发射射光谱是是否有重重叠。
25、 常用用的荧光光探针：FITTC，CCY-33，ALLEAXX4888，CYY-5，AALEAAX5664聚焦扫描描和CCCD扫描描仪一旦荧光光标记样样品和微微阵列反反应后，未未结合的的成分就就可洗去去，结合合到芯片片的样品品可通过过荧光检检测装置置进行检检测。聚聚焦扫描描仪和CCCD相相机均已已成功地地应用于于芯片的的检测。聚聚焦扫描描主要是是利用玻玻璃基质质小区域域（约1100uum2）的的激光发发晒透镜镜（或两两者）使使整个影影像聚集集，每个个位点上上带荧光光的样品品发射的的光通过过一系列列的反光光镜，光光片和晶晶体后与与不要的的光分开开，然后后被光电电倍增管管（或一一种类似似的装置置）
26、转换换成一种种电信号号。聚焦焦扫描聚聚焦数据据的速度度（1-5miin）要要比传统统实验中中的放射射自显影影快的多多（1-10天天），快快速的荧荧光检测测技术是是芯片检检测技术术的一次次革命。CCCD相相机利用用许多与与聚焦扫扫描仪相相同的原原理聚焦焦荧光影影像。生化反应应杂交反应应概述该过程指指将从生生物样品品分离到到的蛋白白、DNNA或RRNA样样品与生生物芯片片进行反反应，从从固定于于芯片的的探针阵阵列得到到样品的的序列信信息。由由于玻片片本身的的荧光本本底很低低，所以以可用荧荧光标记记的方法法来对生生物芯片片实施检检测和分分析，同同时具有有快速、精精确和安安全等优优点。而而且，还还可用
27、多多个荧光光素进行行标记以以实现一一次性分分析多个个生物样样品。玻玻片作为为支持物物还可使使反应体体积缩小小到5-2000l，而而通常的的杂交反反应体积积为5-50mml。这这样一方方面节约约了试剂剂，同时时还可以以提高反反应试剂剂的有效效浓度(0.11-1M)，是是常规检检测(00.4-4pMM)的一一万倍。因因此促进进了杂交交速度减减少了杂杂交时间间，并可可取得较较强的荧荧光信号号。 样品的的制备 核酸样样品 RNNA样品品通常需需要首先先逆转录录成cDDNA并并进行标标记后才才可进行行检测。目目前，由由于检测测灵敏度度所限，尚尚难以普普通探针针对极少少量的核核酸分子子进行杂杂交和检检测，
28、所所以需要要对样品品或后续续测试信信号进行行适当的的放大。多多数方法法需要在在标记和和分析前前对样品品进行适适当程度度的扩增增，例如如通过PPCR方方法，以以使样品品核酸的的拷贝数数有所提提高达到到检测的的灵敏度度。但用用DNAA芯片进进行检测测分析时时需要对对样品大大量的DDNA片片段进行行扩增和和标记,所以需需要同时时对样品品核酸分分子大量量的区域域进行扩扩增，这这是一项项工作量量非常巨巨大的工工作。顺顺应这一一要求出出现了许许多解决决办法，并并在不同同程度上上减轻了了工作量量。例如如，Moosaiic TTechhnollogiies公公司引入入的固相相PCRR方法，将将多对引引物固定定
29、于支持持物上（其其位置和和序列信信息预定定），以以类似于于原位PPCR的的方式一一次性对对样品多多个片段段进行扩扩增和放放大，而而且不会会由于引引物种类类过多而而出现相相互间的的竞争和和抑制（这这种情况况曾出现现于多重重PCRR中）。引引物具有有较强的的特异性性，扩增增反应也也不存在在交叉污污染，因因而省略略了处理理常规多多重和多多个PCCR反应应的繁琐琐工作。再再如，LLynxx Thheraapeuuticcs公司司引入的的大规模模并行克克隆（mmasssiveely parralllel sollid-phaase clooninng），可可在一个个样品中中同时对对数以万万计的DDNA片
30、片段进行行克隆，且且无需单单独处理理和分离离每个克克隆。 除了了检测前前对样品品分子的的放大外外，通常常仍需要要有高灵灵敏度的的检测设设备来采采集、处处理和解解析生物物信息。但但，亦有有不经过过对样品品的扩增增和放大大而直接接应用特特殊处理理的探针针，例如如分支探探针技术术，而达达到较高高的检测测灵敏度度水平。这这种方法法的原理理是，设设计具有有庞大分分支结构构的分支支核苷酸酸探针，分分支末端端以酶标标记。这这样，经经过分支支核苷酸酸与酶的的双重放放大作用用而将标标本杂交交时极弱弱的信号号转换为为较强的的化学信信号。该该技术比比较成功功的例子子就是HHCV与与HBVV的检测测。它的的最大优优点
31、在于于其操作作简便，具具有较高高的灵敏敏度，同同时也可可以保证证检测结结果的特特异性2。当当然，由由于不同同检测方方式的灵灵敏度不不同对于于样品的的处理和和扩增情情况的要要求亦有有所不同同，具体体的处理理和放大大方法仍仍需根据据实际情情况进行行选择。 蛋白及及其它生生物样品品 同样，基基于生物物大分子子相互作作用原理理的生物物芯片在在检测时时生物样样品的处处理遵循循相似的的方式，即即信号的的放大和和样品的的标记。例例如，蛋蛋白芯片片在进行行检测和和分析时时，可以以将待分分析的蛋蛋白样品品用荧光光素或其其它物质质进行标标记，然然后与生生物芯片片上的生生物大分分子进行行相互作作用，最最后依据据标记物物质的不不同采取取相应的的检测方方式采集集和分析析样品和和芯片上上生物大大分子相相互作用用的结果果。对与与非核酸酸类的生生物大分分子，存存在的问问题是有有时不便便于对其其进行扩扩增和放放大，因因为其它它生物大大分子的的结构相相对比较较复杂不不能进行行简便的的克隆或或扩增。所所以，这这就向检检测的灵灵敏度提提出了更更高的要要求。其其它生物物大分子子的检测测和分析析类似与与蛋白分分子。例例如核酸酸与蛋白白的相互互作用，配配体间的的相互作作用，糖糖与蛋白白的相互互作用等等。