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1、生物化学学考试辅辅导资料料一.考试试内容精精要一、蛋蛋白质的的生物学学功能(了解即即可)蛋白白质是生生命的物物质基础础，没有有蛋白质质就没有有生命，生生物体结结构越复复杂，其其蛋白质质种类和和功能越越繁多，其主主要的生生物学功功能是：（一一）催化化和调节节能力某些些蛋白质质是酶，催催化生物物体内的的物质代代谢反应应。某些些蛋白质质是激素素，具有有一定的的调节功功能，如如胰岛素素调节糖糖代谢、体体内信号号转导也也常通过过某些蛋蛋白质介介导。（二二）转运运功能某些些蛋白具具有运载载功能，如如血红蛋蛋白是转转运氧气气和二氧氧化碳的的工具，血血清白蛋蛋白可以以运输自自由脂肪肪酸及胆胆红素等等。(三三）
2、收缩缩或运动动功能某些些蛋白质质赋予细细胞与器器官收缩缩的能力力，可以以使其改改变形状状或运动动。如骨骨骼肌收收缩靠肌肌动蛋白白和肌球球蛋白。（四四)防御御功能 如免疫疫球蛋白白，可抵抵抗外来来的有害害物质，保保护机体体。（五五）营养养和储存存功能如如铁蛋白白可以储储存铁。(六六）结构构蛋白许多多蛋白质质起支持持作用，给给生物结结构以强强度及保保护，如如韧带含含弹性蛋蛋白，具具有双向向抗拉强强度。（七七）其他他功能如病病毒和噬噬菌体是是核蛋白白，病毒毒可以致致病。二、蛋蛋白质的的分子组组成（一一）元素素组成组成成蛋白质质分子的的主要元元素有碳碳、氢、氧氧、氮、硫硫。有些些还含有有少量磷磷或金属
3、属元素。各各种蛋白白质的含含氮量很很接近，平平均为116，且且蛋白质质是体内内的主要要含氮物物，因此此可以根根据生物物样品的的含氮量量推算出出蛋白质质的大致致含量。（二二）氨基基酸氨基基酸是蛋蛋白质的的基本组组成单位位，存在在于自然然界的氨氨基酸有有3000余种，但但组成人人体蛋白白质的氨氨基酸仅仅有200种，且且均属LL-氨基基酸（甘甘氨酸除除外）即即左旋氨氨基酸，因因为甘氨氨酸无手手性碳原原子(与与四个不不同的原原子或基基团相连连的碳原原子)，大大多数有有手性碳碳原子的的是手性性分子，手手性分子子有旋光光活性。根根据它们们的侧链链R的结结构和性性质可分分为四类类：1非极性性疏水性性氨基酸酸
4、：这类类氨基酸酸的特征征是在水水中的溶溶解度小小于极性性氨基酸酸。2极性中中性氨基基酸：这类类氨基酸酸的特征征是比非非极性氨氨基酸易易溶于水水，且羧羧基数等等于氨基基数，故故为中性性氨基酸酸，但因因为羧基基电离能能力较大大，故其其实际上上具有弱弱酸性。3酸性氨氨基酸：天冬氨氨酸、谷谷氨酸。这这两种氨氨基酸都都含有两两个羧基基，在生生理条件件下带负负电，故故为酸性性氨基酸酸。4碱性氨氨基酸：赖氨酸酸、精氨氨酸和组组氨酸。这这类氨基基酸在生生理条件件下带正正电，故故为碱性性氨基酸酸。还需需要记住住这200种氨基基酸的英英文缩写写符号，尤尤其是三三字符号号，并且且这四种种类别的的氨基酸酸中还有有几种
5、特特殊的氨氨基酸，也也需记住住它们的的独特特特征。芳香香族氨基基酸：苯苯丙氨酸酸、酪氨氨酸、色色氨酸分分子中含含有芳香香环含硫氨氨基酸：甲硫氨氨酸、半半胱氨酸酸分子中中含硫元元素，甲甲硫氨酸酸也叫蛋蛋氨酸。 亚氨基基酸：脯脯氨酸，其其氨基处处于环中中，为亚亚氨基酸酸 支链氨氨基酸：缬氨酸酸、亮氨氨酸、异异亮氨酸酸，这三三种均含含有支链链 其中中有八种种氨基酸酸人体内内不能自自身合成成，必须须从食物物中获得得，称为为必需氨氨基酸，它它们是缬缬氨酸、亮亮氨酸、异异亮氨酸酸、苏氨氨酸、蛋蛋氨酸、赖赖氨酸、苯苯丙氨酸酸和色氨氨酸。三、氨氨基酸的的理化性性质（一一）两性性电离及及等电点点氨基基酸分子子中
6、含有有碱性的的-氨基基和酸性性的-羧基基，能与与酸或碱碱类物质质结合成成盐，故故它是一一种两性性电解质质。在某某一pHH值的溶溶液中氨氨基酸解解离成阳阳离子和和阴离子子的趋势势与程度度相等，成成为兼性性离子，呈呈电中性性，此时时溶液的的pH称称为该氨氨基酸的的等电点点(pII)。这这里有一一个等电电点的计计算问题题：1侧链RR为非极极性基团团或虽为为极性但但不解离离的，此此种氨基基酸的等等电点主主要由-氨基基和-羧基基的解离离常数的的负对数数pK11，pKK2决定定，pII=1/2(ppK1+pK22)2侧链基基团可以以解离，则则由-氨基基，-羧基基及R基基团解离离情况共共同决定定，只需需写出
7、电电离式，取取其兼性性离子两两边的ppK值的的平均值值即可。如如赖氨酸酸其电离离式为：由电电离式可可以看出出，其兼兼性离子子两边ppK值分分别是ppK-NHH3+和和pK-NHH+而而与-羧基基无关故故其pII=1/2 (8.995+110.5537)=9.74（二二）紫外外吸收性性质色氨氨酸、酪酪氨酸在在2800nm波波长附近近有最大大的紫外外吸收峰峰，由于于大多数数蛋白质含含有这类类氨基酸酸，所以以测定蛋蛋白质溶溶液2880nmm的光吸吸收值值，是分分析溶液液中蛋白白质含量量的快速速简便方方法。（三三）茚三三酮反应应：氨基基酸+茚茚三酮水水合物还原茚茚三酮+氨，还还原茚三三酮+氨氨+茚三三
8、酮蓝紫色色化合物物此化化合物最最大吸收收峰在5570nnm波长长处，由由于此吸吸收峰值值的大小小与氨基基酸释放放出的氨氨量成正正比，因因此可以以作为氨氨基酸定定量分析析的方法法。四、肽肽(一一)肽键键两分分子氨基基酸可由由一分子子所含的的氨基与与另一分分子所带带的羧基基脱去一一分子水水缩合成成二肽，两两个氨基基酸之间间产生的的酰胺键键称为肽肽键，具具有不典典型双键键性质。由由10个个以内的的氨基酸酸缩合而而成的肽肽称为寡寡肽，更更多的氨氨基酸相相连而构构成多肽肽。prr是具有有更大分分子量的的多肽链链，但多多肽和ppr在分分子量上上很难划划出明确确界限，实实际应用用中只有有一个习习惯上的的划分
9、。肽肽链中的的氨基酸酸分子因因脱水缩缩合而基基团不全全，称为为氨基酸酸残基。多多肽链中中自由氨氨基末端端称为NN端，自自由羧基基末端称称为C端端，命名名从N端端指向CC端。（二二）生物物活性肽肽1谷胱甘甘肽由谷谷氨酸和和甘氨酸酸和半胱胱氨酸组组成的三三肽。第第一个肽肽键比较较特殊，由由谷氨酸酸-羧基基与半胱胱氨酸的的氨基组组成。分分子中半半胱氨酸酸的巯基基是该化化合物的的主要功功能基团团。此巯巯基具有有还原性性，要记记住谷胱胱甘肽的的生理作作用：作为体体内重要要的还原原剂；保保护蛋白白质或酶酶免遭氧氧化，使使它们处处在活性性状态可还原原细胞内内产生的的H，避避免细胞胞受损其巯基基具有嗜嗜核特性
10、性，能与与外源的的致癌剂剂或药物物等结合合，从而而阻断它它们与DDNA、RRNA或或蛋白质质结合，保保护机体体免遭损损害。2多肽类类激素及及神经肽肽。 体体内有许许多激素素属寡肽肽或多肽肽，如催催产素、促促肾上腺腺皮质激激素，促促甲状腺腺激素等等。神经经肽是在在神经传传导过程程中起信信号转导导作用的的肽类，如如脑啡肽肽、-内啡啡肽等。五ppr的分分类prr的分类类分单纯纯pr、结结合prr，后者者除aaa外，还还含有非非pr部部分即辅辅基，绝绝大部分分辅基以以共价健健与prr部分相相连，根根据形状状分纤维维pr及及球状ppr六、蛋蛋白质的的分子结结构(要要注意构构成各级级结构的的化学键键)可分
11、分为一级级、二级级、三级级、四级级结构四四个层次次，后三三者统称称为高级级结构或或空间构构象。蛋蛋白质的的空间构构象涵盖盖了蛋白白质分子子中每一一个原子子在三维维空间的的相对位位置，并并非所有有pr都都有四级级结构，由由二条或或二条以以上多肽肽链形成成的prr才有四四级结构构。（一一）蛋白白质的一一级结构构蛋白白质的一一级结构构是指蛋蛋白质分分子中氨氨基酸的的排列顺顺序。主主要化学学键是肽肽键和二二硫键。一一级结构构是蛋白白质空间间结构和和特异生生物学功功能的基基础。氨氨基酸排排列顺序序的差别别意味着着从多肽肽链骨架架伸出的的侧链RR基团的的性质和和顺序对对于每一一种蛋白白质是特特异的因为为R
12、基团团大小不不同，所所带电荷荷数目不不同，对对水的亲亲和力不不相同，所所以蛋白白质的空空间构象象也不同同。（二二）蛋白白质的二二级结构构蛋白白质的二二级结构构指蛋白白质分子子中某一一段肽链链的局部部空间结结构，也也就是该该段肽链链主链骨骨架原子子的相对对空间位位置，并并不涉及及氨基酸酸残基侧侧链的构构象。维维系二级级结构的的化学键键主要是是氢键。二二级结构构的主要要形式包包括：-螺旋旋结构、一折叠、-转角和无规则卷曲。1肽单元元。参与与肽键的的6个原原子C1、CC、O、NN、H、CC2位于于同一平平面，且且C1、CC2在平平面上所所处的位位置为反反式构型型，此66个原子子即构成成了肽单单元，其
13、其基本结结构为图中中的A、BB键是单单键，可可自由旋旋转，也也正由于于这两个个单键的的自由旋旋转角度度，决定定了相邻邻肽单元之之间的相相对空间间位置。其其中的肽肽键有一一定程度度双键性性质，不不能自由由旋转。2-螺旋旋。多肽肽链主链链围绕中中心轴有有规律的的螺旋式式上升，每每隔36个残残基螺旋旋上升一一圈，每每个氨基基酸残基基向上平平移015nnm，故故螺距为为0554nmm。螺旋旋的走向向为右手手螺旋。-螺旋的每个肽键的NH和第四个肽键的羰基氧形成氢键，氢键的方向与螺旋长轴基本平行，侧链R基团则伸向螺旋外。3-折叠叠。多肽肽链充分分伸展，每每个肽单单元以CC为旋转转点折叠叠成锯齿齿状结构构，
14、侧链链R基团团交错位位于锯齿齿状结构构的上下下方。可可由两条条以上肽肽链或一一条肽链链内的若若干肽段段折叠成成锯齿状状结构。平平行肽段段间靠链链间肽键键羰基氧氧和亚氨氨基氢形形成氢键键，使构构象稳定定，此氢氢键方向向与折叠叠的长轴轴垂直。两两条平行行肽链走走向可相相同或相相反，由由一条肽肽链折返返形成的的-折叠叠多为反反式，反反式平行行较顺式式平行更更为稳定定。4-转角角和无规规卷曲。-转角常发生于肽链进行180度回折时的转角上，通常由4个氨基酸残基组成，其第一个残基的羰基氧与第四个残基的氨基氢可形成氢键。-转角第二个残基常为脯氨酸，因为其N原子位于环中，形成肽键N原子上已没有H，不能再形成氢
15、键，故走向转折-转角常发生在蛋白质分子的表面，这与蛋白质的生物学功能有关。无规卷曲用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。5模序。指指在许多多蛋白质质分子中中，可发发现两个个或三个个具有二二级结构构的肽段段，在空空间上相相互接近近，形成成一个具具有特殊殊功能的的空间结结构，称称为模序序。实际际上它是是一种超超二级结结构。一一个模序序总有其其特征性性的氨基基酸序列列，并发发挥特殊殊的功能能。常见见的-螺旋旋环-螺螺旋结构构及锌指指结构，前前者可结结合Caa2+，后后者可结结合Znn2+，使使-螺旋旋能镶嵌嵌于DNNA的大大沟中。因此此含此结结构的ppr可与与DNAA或RNNA结合合，这对对于pr
16、r调控DDNA的的转录和和pr翻翻译过程程是必要要的。一一段肽链链其氨基基酸残基基的侧链链适合形形成-螺旋旋或-折叠叠，就会会出现相相应的二二级结构构，aaa残基带带相同的的电荷或或侧链太太大，都都会妨碍碍二级结结构的形形成，此此外还有有一个分分子伴侣侣的概念念，其作作用就是是使肽链链正确折折叠，从从而形成成正确的的空间构构象。（三三）蛋白白质的三三级结构构指整整条肽键键中全部部氨基酸酸残基的的相对空空间位置置，也就就是整条条肽链所所有原子子在三维维空间的的排布位位置。三三级结构构的形成成和稳定定主要靠靠疏水键键、盐键键、二硫硫键、氢氢键和范范德华力力等次级级键。其其中疏水水键是最最主要的的稳
17、定力力量。疏疏水键是是蛋白质质分子中中疏水基基团之间间的结合合力，酸酸性和碱碱性氨基基酸的RR基团可可以带电电荷，正正负电荷荷互相吸吸引形成成盐键，与与氢原子子共用电电子对形形成的键键为氢键键。分子子量大的的蛋白质质三级结结构其整整条肽链链中常可可分割成成多折叠叠得转为为紧密的的结构域域，实际际上结构构域也是是一种介介于二级级和三级级结构之之间的结结构层次次，每个个结构域域执行一一定的功功能。（四四）蛋白白质的四四级结构构蛋白白质的四四级结构构是由有有生物活活性的两两条或多多条肽链链组成，肽肽链与肽肽链之间间不通过过共价键键相连，而而由非共共价键维维系。每每条多肽肽链都有有其完整整的三级级结构
18、，称称为蛋白白质的亚亚基，这这种蛋白白质分子子中各个个亚基的的空间排排布及亚亚基接触触部位的的布局和和相互作作用，称称为蛋白白质的四四级结构构。在四四级结构构中，各各亚基之之间的结结合力主主要是疏疏水作用用，氢键键和离子子键也参参与维持持四级结结构。含含有四级级结构的的蛋白质质，单独独的亚基基一般没没有生物物学功能能，只有有完整的的四级结结构才有有生物学学功能。七、蛋蛋白质结结构与功功能的关关系(一一)蛋白白质一级级结构与与功能的的关系要要明白三三点：1.一级结结构是空空间构象象和功能能的基础础，空间间构象遭遭破坏的的多肽链链只要其其肽键未未断，一一级结构构未被破破坏，就就能恢复复到原来来的三
19、级级结构，功功能依然然存在。2.即使是是不同物物种之间间的多肽肽和蛋白白质，只只要其一一级结构构相似，其其空间构构象及功功能也越越相似。3.物种越越接近，其其同类蛋蛋白质一一级结构构越相似似，功能能也相似似。但一一级结构构中有些些氨基酸酸的作用用却是非非常重要要的，若若蛋白质质分子中中起关键键作用的的氨基酸酸残基缺缺失或被被替代，都都会严重重影响其其空间构构象或生生理功能能，产生生某种疾疾病，这这种由蛋蛋白质分分子发生生变异所所导致的的疾病，称称为“分子病病”。(二二)蛋白白质空间间结构与与功能的的关系蛋白白质多种种多样的的功能与与各种蛋蛋白质特特定的空空间构象象密切相相关。其其构象发发生改变
20、变，功能能活性也也随之改改变。以以肌红蛋蛋白(MMb)和和血红蛋蛋白(HHb)为为例阐述述蛋白质质空间结结构与功功能的关关系。Mbb与Hbb都是含含有血红红素辅基基的蛋白白质。携携带氧的的是血红红素中的的Fe+，FFe有6个个配位键键，其中中四个与与吡咯环环N配位位结合，一一个与蛋蛋白质的的组氨酸酸残基结结合，另另一个即即可与氧氧结合。而而血红素素与蛋白白质的稳稳定结合合主要靠靠以下两两种作用用：一是是血红素素分子中中的两个个丙酸侧侧链与肽肽链中氨氨基酸侧侧链相连连，另一一作用即即是肽链链中的组组氨酸残残基与血血红素中中Fe22+配位位结合。Mbb只有一一条肽链链，故只只结合一一个血红红素，只
21、只携带11分子氧氧，其氧氧解离曲曲线为直直角双曲曲线，而而Hb是是由四个个亚基组组成的四四级结构构，共可可结合44分子氧氧，其氧氧解离曲曲线为“S”形曲线线，从曲曲线的形形状特征征可知，HHb第一一个亚基基与O22结合，可可促进第第二、第第三个亚亚基与OO2的结结合，前前三个亚亚基与OO2结合合，又大大大促进进第四个个亚基与与O2结结合，这这种一个个亚基与与其配体体结合后后，能影影响蛋白白质分子子中另一一亚基与与配体结结合能力力的效应应，称协协同效应应，O与Hbb之间是是促进作作用，称称正协同同效应。之之所以会会有这种种效应，是是因为未未结合OO2时，HHb结构构紧密，此此时Hbb与O22亲和
22、力力小，随随着O22的结合合，其亚亚基之间间键断裂裂，空间间结构变变得松弛弛，此种种状态HHb与OO2亲和和力即增增加。这种种一个氧氧分子与与Hb亚亚基结合合后引起起亚基构构象变化化的效应应称变构构效应，有有关此效效应会在在后面酶酶一章中中详细解解释。肌肌红蛋白白只有一一条肽链链，不存存在协同同效应。由此此可见，HHb与MMb在空空间结构构上的不不同，决决定了它它们在体体内发挥挥不同的的生理功功能。八、蛋蛋白质的的理化性性质及其其分离纯纯化(一一)蛋白白质的理理化性质质prr既具有有aa的的相关性性质，又又具有作作为生物物大分子子的一些些独特的的性质。1蛋白质质的两性性电离及及等电点点，这与与
23、aa的的性质相相似，其其氨基、羧羧基及侧侧链的某某些基团团皆可解解离。当蛋蛋白质溶溶液处于于某一ppH时，蛋蛋白质解解离成正正负离子子的趋势势相等，即即成为兼兼性离子子，净电电荷为零零，此时时溶液的的pH称称为蛋白白质的等等电点。蛋蛋白质溶溶液的ppH大于于等电点点时，该该蛋白质质颗粒带带负电荷荷，反之之带正电电荷。体体内各种种蛋白质质的等电电点不同同，但大大多数接接近于ppH5.0，所所以在人人体体液液pH77.4的的环境下下，大多多数蛋白白质解离离成阴离离子，带带负电。2蛋白质质的胶体体性质这是是pr作作为生物物大分子子才有的的性质可可将蛋白白质溶液液看作胶胶体溶液液。prr作为溶溶液稳定
24、定存在的的两大因因素：一一是蛋白白质颗粒粒表面大大多为亲亲水基团团，可吸吸引水分分子，使使颗粒表表面形成成一层水水化膜，从从而阻断断蛋白质质颗粒的的相互聚聚集，防防止溶液液中蛋白白质的沉沉淀析出出；二是是蛋白质质颗粒表表面可带带相同电电荷颗粒粒之间相相互排斥斥不易聚聚集沉淀淀，也可可以起稳稳定颗粒粒的作用用。若去去除蛋白白质颗粒粒这两个个稳定因因素，蛋蛋白质极极易从溶溶液中沉沉淀。3蛋白质质的变性性、沉淀淀和凝固固这也也是prr区别于于aa的的特有性性质。(11)变性性：蛋白白质在某某些理化化因素的的作用下下，其空空间结构构受到破破坏，从从而改变变其理化化性质，并并失去其其生物活活性，称称为变
25、性性。一般般认为蛋蛋白质变变性并不不涉及一一级结构构的改变变，故若若蛋白质质变性较较轻，在在去除变变性因素素后，其其仍可恢恢复原有有的构象象和功能能，称复复性。但但若其空空间构象象遭到严严重破坏坏，则去去除变性性因素也也不能复复性，称称不可逆逆变性。引引起变性性的因素素有各种种物理或或化学因因素。蛋蛋白质变变性后因因其空间间结构受受到破坏坏，其性性质也受受影响，如如易沉淀淀，粘度度增加，作作为酶其其催化活活性丧失失等。虽虽然变性性后蛋白白质失去去水化膜膜，其疏疏水侧链链暴露，但但只要其其溶液ppH值不不等于蛋蛋白质酶酶等电点点，蛋白白质仍可可不沉淀淀，故变变性后，蛋蛋白质溶溶解度减减少却并并不
26、一定定沉淀。医学学上消毒毒灭菌，就就是基于于蛋白质质变性的的原理，而而生物制制品的制制备和保保存则必必须防止止蛋白质质变性。（22）沉淀淀：蛋白白质在溶溶液中的的稳定因因素是水水化膜及及电荷，因因而凡是是能消除除蛋白质质表面的的水化膜膜并中和和电荷的的试剂均均可以引引起蛋白白质的沉沉淀。常常用的有有中性盐盐、有机机溶剂、某某些生物物碱试剂剂、大分分子酸类类及重金金属盐类类等。（33）凝固固：蛋白白质经强强酸、强强碱作用用发生变变性后，仍仍能溶解解于强碱碱或强酸酸溶液中中，若将将pH调调至等电电点，则则变性蛋蛋白质立立即结成成絮状的的不溶解解物，此此絮状物物仍可溶溶于强酸酸和强碱碱中，如如再加热
27、热则絮状状物可变变成较坚坚固的凝凝块，此此凝块不不易再溶溶于强酸酸与强碱碱中，这这种现象象称为蛋蛋白质的的凝固作作用。如如鸡蛋煮煮熟后本本来流动动的蛋清清变成了了固体，实实际上凝凝固是蛋蛋白质变变性后进进一步发发展的不不可逆的的结果。4蛋白质质的紫外外吸收。由于于蛋白质质分子中中含有有有共轭双双键的酪酪氨酸、色色氨酸，因因此在2280nnm波长长处有特特征性吸吸收峰，这这与aaa相似。在在此波长长范围内内，蛋白白质的吸吸收光度度值与其其浓度成成正比关关系，因因此可作作蛋白质质定量测测定。5蛋白质质的呈色色反应茚三酮酮反应：与氨基基酸作用用原理相相似。双缩脲脲反应：肽键+硫酸铜铜稀稀碱溶液液 紫
28、色色、红色色物，氨氨基酸不不出现此此反应，故故可检测测蛋白质质水解程程度。（二二）蛋白白质的分分离与纯纯化蛋白白质的分分离纯化化过程就就是巧妙妙利用蛋蛋白质分分子在大大小、形形状、所所带电荷荷种类与与数量、极极性与非非极性氨氨基酸比比例、溶溶解度、吸吸附性质质以及对对其他生生物大分分子亲和和力上的的差异，将将杂蛋白白除去的的过程，即即利用蛋蛋白质物物理、化化学性质质的差异异，将不不同的蛋蛋白质采采用恰当当的方法法分开，常常用的方方法如下下：1.根据蛋蛋白质两两性电离离及等电电点分离离的方法法：等电点点沉淀法法：因为为蛋白质质在其等等电点的的pH值值附近易易沉淀析析出，故故利用各各种蛋白白质等电
29、电点的不不同，即即可将蛋蛋白质从从混合溶溶液中分分开。电泳：指蛋白白质在一一定pHH情况下下带电荷荷，在电电场中能能由电场场一极向向另一极极移动的的现象。这这实际上上也利用用了蛋白白质分子子、形状状的不同同，因为为游动快快慢与蛋蛋白质所所带电荷荷的性质质、数目目、分子子、形状状有关，对对带相同同性质电电荷的蛋蛋白质来来说，带带电多、分分子小及及为球状状分子的的蛋白质质游动速速率大，故故不同蛋蛋白质得得以分离离。根据据支撑物物不同，可可分为薄薄膜电泳泳和凝胶胶电泳等等。不同同支持物物，分辨辨率不同同，如正正常人血血清蛋白白电泳仅仅分出五五条区带带，而聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳可可分出330多条条带
30、。电电泳结束束后，用用蛋白质质显色剂剂呈色，即即可看到到一条条条已经分分离的蛋蛋白质条条带。离子交交换层析析：在某某一特定定pH值值时，混混合蛋白白质溶液液中各种种蛋白质质所带电电荷数目目及性质质不同，事事先在层层析柱中中装上离离子交换换剂，其其所带电电荷性质质与蛋白白质电荷荷性质相相反，当当蛋白质质混合溶溶液流经经层析柱柱时，即即可被吸吸附于柱柱上，随随后用与与蛋白质质带相同同性质电电荷的洗洗脱剂洗洗脱，蛋蛋白质可可被置换换下来，由由于各种种蛋白质质带电量量不同，离离子交换换剂结合合的紧密密度不同同，带电电量小的的蛋白质质先被洗洗脱下来来，增加加洗脱液液离子强强度，带带电量多多的也被被洗脱下
31、下来，可可将蛋白白质分离离。2利用蛋蛋白质分分子量不不同分离离的方法法透析：利用特特殊膜制制成透析析袋，此此膜只允允许小分分子化合合物透过过，而蛋蛋白质是是高分子子化合物物故留在在袋内，故故把袋置置于水中中，蛋白白质溶液液中的小小分子杂杂质可被被去除，如如去除盐盐析后蛋蛋白质中中混杂的的盐类。也也常利用用此方法法浓缩蛋蛋白质。即即袋外放放吸水剂剂，小分分子的水水即可透透出，蛋蛋白质溶溶液可被被浓缩。分子筛筛：也叫叫凝胶过过滤，是是层析的的一种。层层析柱内内填充带带有网孔孔的凝胶胶颗粒。蛋蛋白质溶溶液加于于柱上，小小分子蛋蛋白进入入孔内，大大分子蛋蛋白不能能进入孔孔内而直直接流出出，小分分子因在
32、在孔内被被滞留而而随后流流出，从从而蛋白白质得以以分离。超速离离心：蛋蛋白质胶胶体溶液液与氯化化钠等真真溶液不不同之处处在于：蛋白质质在强大大离心场场中，在在溶液中中会逐渐渐沉降，各各种蛋白白质沉降降所需离离心力场场不同，故故可用超超速离心心法分离离蛋白质质及测定定其分子子量，因因其结果果准确又又不使蛋蛋白质变变性，故故是目前前分离生生物高分分子常用用的方法法。3.与蛋白白质的沉沉淀的性性质相关关的分离离方法：盐析：硫酸铵铵、硫酸酸钠等中中性盐因因能破坏坏蛋白质质在溶液液中稳定定存在的的两大因因素，故故能使蛋蛋白质发发生沉淀淀。不同同蛋白质质分子颗颗粒大小小不同，亲亲水程度度不同，故故盐析所所
33、需要的的盐浓度度不同，从从而将蛋蛋白质分分离，如如用硫酸酸铵分离离清蛋白白和球蛋蛋白，在在半饱和和的硫酸酸铵溶液液中，球球蛋白即即可从混混合溶液液中沉淀淀析出除除掉，而而清蛋白白在饱和和硫酸铵铵中才会会沉淀。盐盐析的优优点是不不会使蛋蛋白质发发生变性性。丙酮沉沉淀：丙丙酮可溶溶于水，故故能与蛋蛋白质争争水破坏坏其水化化膜，使使蛋白质质沉淀析析出，在在pH值值和离子子强度适适当的情情况下更更佳，但但丙酮使使蛋白质质变性，故故应低温温快速分分离，还还可用其其他有机机溶剂。重金属属盐沉淀淀：因其其带正电电荷，可可与蛋白白质负离离子结合合形成不不溶性蛋蛋白盐沉沉淀，可可利用此此性质以以大量清清蛋白抢抢
34、救重金金属盐中中毒的人人。(三三)多肽肽链中氨氨基酸序序列分析析主要要步骤及及原理如如下：1纯化蛋蛋白质：用于序序列分析析的蛋白白质应是是分子大大小均一一，电游游呈现一一条带具具有一定定纯度的的样品。2分析蛋蛋白质的的氨基酸酸组成：用酸、碱碱等将蛋蛋白质肽肽链水解解为游离离氨基酸酸，再用用电泳、层层析等方方法分离离、鉴定定所有游游离氨基基酸的种种类和含含量，现现在可用用氨基酸酸自动分分析仪来来快速测测定。3.测定肽肽链中NN末端和和C末端端为何种种氨基酸酸；若蛋蛋白质由由两条以以上肽链链组成，通通过末端端氨基酸酸的测定定还可估估计蛋白白质中的的肽链数数目。N末端端氨基酸酸测定：二硝基基氟苯、丹
35、丹磺酰氯氯都可与与末端氨氨基反应应，再用用盐酸等等将肽链链水解，将将带有二二硝基氟氟苯或丹丹磺酰氯氯的氨基基酸水解解下来，即即可分离离鉴定出出为何种种氨基酸酸，因丹丹磺酰氯氯具强烈烈荧光更更易鉴别别。C末端端氨基酸酸测定：用相应应的羧肽肽酶将CC末端氨氨基酸水水解下来来，因各各种羧肽肽酸水解解氨基酶酶的专一一性不同同，故可可对C末末端氨基基酸做出出鉴定。4.将链间间、链内内二硫键键打开，否否则会阻阻碍蛋白白水解溶溶剂的作作用，常常用巯基基化合物物还原法法。 55.选择择适当的的酶或化化学试剂剂将肽链链部分水水解成适适合作序序列分析析的小肽肽段，常常用的方方法有： 胰蛋白白酶法：水解赖赖氨酸或或
36、精氨酸酸的羧基基形成的的肽键，故故若蛋白白质分子子中有44个精氨氨酸或赖赖氨酸残残基，可可得5个个肽段。胰凝乳乳蛋白酶酶法：水水解芳香香族氨基基酸羧基基侧的肽肽键溴化氰氰法：水水解甲硫硫氨酸羧羧基侧的的肽键。6.测定各各肽段的的氨基酸酸排列顺顺序：一般般采用EEdmaan降解解法。因PPITCC(异硫硫氰酸苯苯酯)只只与N末末端氨基基酸作用用，用冷冷稀酸将将此末端端残基水水解下来来，鉴定定为何种种氨基酸酸衍生物物，残留留的肽段段N末端端可继续续与PIITC反反应，依依次逐个个鉴定出出氨基酸酸的排列列顺序。7.多肽链链用两种种方法分分别裂解解成几组组肽段，并并测定每每一方法法中每一一肽段的的氨基
37、酸酸排列顺顺序，肽肽段重叠叠法确定定整条肽肽链的氨氨基酸顺顺序，若若用两种种方法找找不出重重叠肽段段，就需需用第三三种、第第四种方方法，直直到找出出重叠肽肽段。8.确定二二硫键位位置：用电电泳法将将拆开二二硫键的的肽段条条带与未未拆开二二硫键的的条带进进行对比比即可定定位二硫硫键的位位置。如此此以来，一一个完整整蛋白质质分子的的一级结结构即可可被测定定。(四四)蛋白白质空间间结构测测定常用用的方法法有X射射线晶体体衍射法法和二维维核磁共共振技术术，还可可根据蛋蛋白质的的氨基酸酸序列预预测其三三维空间间结构。一、核核酸的化化学组成成核酸酸是以核核苷酸为为基本组组成单位位的生物物大分子子。包括括两
38、类：一类为为脱氧核核糖核酸酸（DDNA），另另一类为为核糖核核酸（RRNA ）。DDNA存存在于细细胞核和和线粒体体内，携携带遗传传信息；RNAA存在于于细胞质质和细胞胞核中，参参与细胞胞内遗传传信息的的表达。核核酸的基基本组成成单质是是核苷酸酸，而核核苷酸又又是由碱碱基、戊戊糖、磷磷酸组成成。(一一)碱基基构成成核苷酸酸的碱基基主要有有五种，分分属嘌呤呤和嘧啶啶两类。嘌嘌呤类化化合物包包括腺嘌嘌呤A和和鸟嘌呤呤G两种种。嘧啶啶类化合合物有三三种，胞胞嘧啶CC和胸腺腺嘧啶TT尿嘧啶啶U。嘌嘌呤和嘧嘧啶环中中均含有有共轭双双键，因因此对波波长2660nmm左右的的紫外光光有较强强吸收，这这一性质
39、质可用于于对核酸酸、核苷苷酸、及及碱基进进行定性性定量分分析。(二二)戊糖糖与核苷苷、核苷苷酸戊糖糖是核苷苷酸的另另一个主主要成分分，RNNA和DDNA主主要区别别有两点点：一是是构成DDNA的的碱基为为A、TT、G、CC，而RRNA的的碱基为为A、UU、C、GG，二是是构成DDNA的的核苷酸酸的戊糖糖是-D2-脱脱氧核糖糖，而构构成DNNA的核核苷酸的的戊糖为为-D核糖。即即RNAA糖环上上2号碳碳原子处处连的是是-OHH，而DDNA此此处连的的是-HH。表示示碱基和和糖环上上各原子子次序时时，在碱碱基杂环环上标以以顺序11，2，33；在糖糖环上标标以l，2，3 以作作区别。碱碱基与戊戊糖通
40、过过糖苷键键连接成成核苷。连连接位置置是C-1。核苷苷与磷酸酸通过磷磷酸酯键键连接成成核苷酸酸连接位位置是CC-5。此处处可连接接一个、二二个、三三个磷酸酸基团，称称为核苷苷一磷酸酸、核苷苷二磷酸酸、核苷苷三磷酸酸。体内内还有一一种核苷苷酸，即即C-33与C-5与同一一磷酸基基团相连连，在信信号转导导中起重重要作用用。二、DDNA的的结构与与功能DNNA与蛋蛋白质一一样，也也有其一一级、二二级、三三级结构构。（一一） DDNA的的一级法法构指DDNA分分子中核核苷酸的的排列顺顺序。由由于核苷苷酸的差差异主要要表现在在碱基上上，因此此也叫做做碱基序序列。四种种核苷酸酸按一定定排列顺顺序，通通过磷
41、酸酸二酯键键连成主主要核苷苷酸链，连连接都是是由前一一核苷酸酸3-OHH与下一一核苷酸酸5-磷酸酸基形成成3-5磷酸二二酯键，故故核苷酸酸链的两两个末端端分别是是5-游离离磷酸基基和3-游离离羟基，书书写应从从5到3。（二二）DNNA的二二级结构构即双双螺旋结结构模型型，要与与蛋白质质的-螺旋旋相区别别。1Chaargaaff规规则DNNA分子子中腺嘌嘌呤与胸胸腺嘧啶啶的含量量相等，鸟鸟嘌呤与与胞嘧啶啶的含量量相等；因此DDNA中中嘌呤与与嘧啶的的总数相相等：即即AGG=CT2双螺旋旋结构模模型19953年年Wattsonn和Crrickk正式提提出了关关于DNNA二级级结构的的右手双双螺旋结
42、结构模型型，主要要内容有有：（11）DNNA分子子由两条条反向平平行的多多聚核苷苷酸链围围绕同一中中心轴盘盘曲而成成，两条条链均为为右手螺螺旋，链链呈反平平行走向向，一条条走向是是53，另一一条是335。（22）DNNA链的的骨架由由交替出出现的亲亲水的脱脱氧核糖糖基和磷磷酸基构构成，位位于双螺螺旋的外外侧，碱碱基配对对位于双双螺旋的的内侧。（33）两条条多聚核核苷酸链链以碱基基之间形形成氢键键配对而而相连，即即A与TT配对，形形成两个个氢键，GG与C配配对，形形成三个个氢键。碱碱基相互互配对又又叫碱基基互补。RRNA中中若也有有配对区区，A是是与U以以两个氢氢键配对对互补。(44)碱基基对平
43、面面与螺旋旋轴几乎乎垂直，相相邻碱基基对沿轴轴转366，上升升0334nmm。每个个螺旋结结构含110对碱碱基，螺螺旋的距距为34nmm，直径径是20nmm。DNNA两股股链之间间的螺旋旋形成凹凹槽：一一条浅的的，叫小小沟；一一条深的的，叫大大沟。大大沟是蛋蛋白质识识别DNNA的碱碱基序列列发生相相互作用用的基础础，使蛋蛋白质和和DNAA可结合合而发生生作用。DDNA双双螺旋结结构要与与pr的的相区别别：DNNA是两两条核苷苷酸链通通过碱基基之间氢氢键相连连而成，而而蛋白质质的-螺旋旋是一条条肽链自自身盘曲曲而成，其其氢键是是其内部部第一位位肽键的的N-HH与第四四个肽键键的羰基基氧形成成的。
44、（55）DNNA双螺螺旋结构构的稳定定主要由由互补碱碱基对之之间的氢氢键和碱碱基堆积积力来维维持。碱碱基堆积积力是碱碱基对之之间在垂垂直方向向上的相相互作用用，可以以使DNNA分子子层层堆堆积，分分子内部部形成疏疏水核心心，这对对DNAA结构的的稳定是是很有利利的，碱碱基堆积积力对维维持DNNA的二二级结构构起主要要作用。3DNAA结构的的多样性性DNNA右手手双螺旋旋结构是是DNAA分子在在水性环环境和生生理条件件下最稳稳定的结结构，但但并不是是不变的的，当改改变溶液液的离子子强度或或相对湿湿度时，DDNA结结构会发发生改变变，除了了WasstonnCrrickk模型（BBDNNA）外外，还
45、存存在ZDNAA和ADNAA（三三）DNNA三级级结构真核核生物DDNA分分子很大大，DNNA链很很长，但但却要存存在于小小小的细细胞核内内，因此此DNAA必须在在二级结结构的基基础上紧紧密折叠叠，这就就形成了了三级结结构。1超螺旋旋原核核生物DDNA的的三级结结构绝大大部分原原核生物物DNAA是共价价闭合的的环状双双螺旋分分子，此此环形分分子可再再次螺旋旋形成超超螺旋，真真核生物物线粒体体、叶绿绿体DNNA也为为环形分分子，能能形成超超螺旋，非非环形DDNA分分子在一一定条件件下局部部也可形形成超螺螺旋。2.真核细细胞基因因组DNNA真核核细胞核核内染色色体即是是DNAA高级结结构的主主要表
46、现现形式。组组蛋白HH2A、HH2B、HH3、HH4各两两分子组组成组蛋蛋白八聚聚体。DDNA双双螺旋缠缠绕其上上构成核核心颗粒粒，颗粒粒之间再再以DNNA和组组蛋白HH1连成成核小体体，核小小体再经经多步旋旋转折叠叠形成棒棒状染色色体，存存在于细细胞核中中。(四四)DNNA的功功能DNNA的基基本功能能就是作作为生物物遗传信信息复制制的模板板和基因因转录的的模板，是是生命遗遗传繁殖殖的物质质基础，也也是个体体生命活活动的基基础。三、RRNA的的结构与与功能RNNA通常常以单链链形式存存在，这这与DNNA双链链形成螺螺旋不同同，但也也可以有有局部的的二级结结构或三三级结构构。RNNA分子子比DNNA分子子小，它它的功能能多样，种种类较多多，主要要有信使使RNAA、核蛋蛋白体RRNA、转转运RNNA、小小核RNNA及核核不均一一RNAA等。各各类RNNA在遗遗传信息息表达为为氨基酸酸序列过过程中发发挥不同同的作用用。（一一）信使使RNAA（mRRNA）在细细胞核内内以DNNA单链链为模板板转录生生成hnnRNAA,hnnRNAA经过剪剪切变为为成熟的的mRNNA,出出核后在在胞质内内为蛋白白质合成成提供模模板。成成熟mRRNA的的结构特特点：1具有