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1、江苏农林林职业技技术学院院 毕 业业 设 计（论论 文）SNL/QR77.5.4-33 菊花嫩茎茎快繁技技术的研研究专 业 生物物技术及及应用 学生姓名名 吴黎黎平 班 级 生物物技术及及应用(2)班班 学 号 006144012208 指导教师师 黄小忠忠 完成日期期 220099.6 7 第7页，共13页附1：成绩评议议学号姓名名题目指导教师师建议成成绩：评阅教师师建议成成绩：答辩小组组建议成成绩：院答辩委委员会评评阅意见见及评定定成绩：答辩委员员会主任任签字（盖盖章）： 年 月月 日附2：毕业设计计（论文文）任务务书姓名吴黎平平学号06144012208班级06生物物技术及及应用（2）题
2、目菊花嫩嫩茎快繁繁技术的的研究设计(论论文)主要内内容配制培养养基（包包括：诱诱导培养养基，继继代培养养基，生生根培养养基。）先配制诱诱导培养养基组培室室消毒（超超净工作作台紫外外消毒220miin）菊花嫩嫩茎消毒毒处理实验准准备实验操操作(初初代培养养,继代代培养,生根培培养) 观察并并记录数数据和现现象实验中中可能出出现问题题的处理理实验室室培养的的苗移栽栽到适用用田。重点研究究问题怎样避免免或减少少褐变的的机率，怎怎么样降降低污染染率。激激素在不不同时期期对其起起到什么么作用。光光照，温温度对其其有什么么影响。不不同品种种的菊花花其生长长环境有有什么不不同。培培养因素素对菊花花组织的的影
3、响。6BA和NAA对菊花叶片分离再生的影响等.主要技术术指标配置标准准的母液液，配置置培养基基，PHH及培养养基的浓浓度，灭灭菌锅的的正确操操作，超超净工作作台的操操作及无无菌操作作。诱导导培养的的成活率率，继代代培养的的成活率率及最终终长成小小苗的比比例。对对其生长长环境的的掌握程程度。其它要说说明的问问题茎老发生生褐变，真真菌污染染，操作作不当、讲讲话导致致细菌污污染。灭灭菌出错错，培养养基出现现问题（包包括灭菌菌时中途途打开灭灭菌锅在在里面加加东西，操操作失误误等）。不不同的菊菊花的生生长条件件不同等等。指导老师师意见指导教师师签字：年月日附3：指导教师师意见对论文的的简短评评价：1.指
4、出出论文存存在的问问题及错错误2.对创创造性工工作评价价3.建议议成绩 优 良 中 及及格 不及格格 指导导教师签签字年月日评阅教师师意见对论文的的简短评评价：1.指出出论文存存在的问问题及错错误2.对创创造性工工作评价价3.建议议成绩 优 良良 中 及格 不及及格评阅教师师签字年月日吴黎平 : 菊花愈伤组织快繁技术的研究答辩小组组评议意意见学号姓名名题目答辩小组组意见： 1、对对论文的的评价2.建议议成绩等等级 优 良良 中 及格 不及及格3.需要要说明的的问题 答辩辩小组长长签字年月日菊花嫩茎茎快繁技技术的研研究06生物物技术及及应用（22）班 吴吴黎平指指导老师师：黄小小忠摘要：先先实验
5、前前的准备备工作，然然后选取取菊花，以以带顶芽芽的嫩茎茎为外植植体接种种到诱导导培养基基中，放放在培养养室里培培养并观观察，一一周后长长出丛生生芽，再再没有污污染的丛丛生芽在在无菌超超净工作作台上用用手术刀刀切成多多块，再再将丛生生芽接到到继代培培养基中中进行继继代培养养，当发发现初步步长出嫩嫩根时，将将无污染染的带根根的丛生生芽接到到生根培培养基中中，当生生长成幼幼苗时将将生根试试管苗开开盖练苗苗,移栽栽。及在在培养过过程中遇遇到的问问题。关键词：菊花；组织培培养；褐褐变；脱脱毒；外外植体Rapiid PProppagaatioon oof CChryysanntheemumm teende
6、er sstemm ReeseaarchhAbsttracct: Tessts befforee fiirstt thhe pprepparaatorry wworkk, tthenn thhe sseleectiion chrrysaanthhemuum, plaantss thhe bbodyy taake thee beelt terrminnal budd teendeer sstemm ass ouutsiide to vacccinnatee inn thhe iinduuctiion cullturre mmediium, pllacees iin tthe raiise roo
7、om tto rraisse aand to obsservve, aftter a wweekk iss loong groows thiicklly tthe budd, tthenn dooes nott haave thee poolluutioon tto ggroww thhickkly thee buud tto sslivver thee muultii-bllockks oon tthe aseepsiis uultrra oonlyy woork tabble witth tthe scaalpeel, theen wwilll grrow thiicklly tthe b
8、udd grrafttingg too coontiinuee inn a genneraatioon oof ccultturee meediuum tto ccarrry oon cconttinuues a ggeneerattionn off raaisee, wwhenn diiscooverred wheen aat tthe begginnningg off thhe llenggth of strridee wiill leaave thee teendeer rroott, wwilll noot hhavee thhe ppolllutiion thee beelt roo
9、ot tto ggroww thhickkly thee buud ggrafftinng tto ttakee rooot in thee cuultuure meddiumm, wwhenn wiill groow tthe seeedliing willl ttakee rooot thee teest tubbe sseeddlinng tto uuncaap ppraccticces thee seeedllingg, wwilll trranssplaant.Andd quuesttionn whhichh meeetss inn thhe rraisse pproccesss.K
10、eywwordd：Chrrysaanthhemuum; Tisssuee cuultuure; Tuurniing broown; Esscappes thee pooisoon; Outtsidde pplannts thee boody目 录1材料料和方法法811材材料与用用具812培培养条件件913实实验前的的准备工工作9131培养养基配制制9132接种种室的灭灭菌9133超净净工作台台及器械械消毒9134材料料选取9135材料料灭菌914接接种1015诱诱导侧芽芽生长1016继继代培养养11017诱导生生根10018移移栽培养养1102结果与与分析102.1初代培培养1102.2继代培
11、培养11123生生根诱导导及移栽栽1112 44细菌、真真菌污染染及防治治1123.讨论论112参考文献献133致谢14菊花又称称“菊”、“秋菊”、“黄花”, 为菊菊科菊属属的多年年生宿根根草本植植物或半半灌木, 是原原产于我我国的十十大传统统名花和和世界最最主要的的切花之之一, 主产于于浙江、江江苏, 在四川川、安徽徽、河南南、山东东等省也也有栽培培。杭菊菊、亳菊菊、贡菊菊、滁菊菊、祁菊菊、怀菊菊、济菊菊、黄菊菊为我国国药用菊菊花的八八大主流流商品。菊菊花株高高801200cm 左右, 茎直立立,基部木木质化, 上部部多分枝枝, 枝略略具棱, 是典典型的温温带短日日照植物物。在短短日照下下能
12、提早早开花, 喜阳阳光忌荫荫蔽, 较耐旱旱、忌涝涝; 喜温温暖湿润润气候, 但也也能耐寒寒, 严冬冬季节根根茎能在在地下越越冬, 花能经经受微霜霜, 但幼幼苗生长长和分枝枝孕蕾期期需较高高的气温温, 最适适生长温温度为220左右。菊菊花的再再生能力力强, 采用扦扦插法繁繁殖操作作简便, 易于于成活, 且没没有季节节限制, 全年年均可进进行。菊花味甘甘、性寒寒,在明代代李时珍珍的本本草纲目目中载载有“利五脉脉,调四肢肢,治头目目风热,脑骨疼疼痛,养目血血,去翳膜膜,主肝气气不足”的功效效1，且具有有很强的的抗菌作作用, 对大肠肠杆菌、金金黄色葡葡萄球菌菌等有很很强的抑抑杀作用用，常用于于治疗心心
13、胸烦热热、疔疮疮、偏头头痛、冠冠心病、乳乳腺炎、扁扁桃炎等等疾病, 可降降低血液液中的血血脂和胆胆固醇, 预防防心脏病病的发生生, 并能能增强身身体的免免疫能力力。其花花中主要要含有挥挥发油、龙龙脑、乙乙酸龙酯酯、矢车车菊甙、绿绿原酸、维维生素、黄黄酮类物物质、微微量元素素硒等, 具有有清除人人体中超超氧离子子自由基基及抗衰衰老、增增加机体体免疫力力的生理理活性作作用。现现代研究究表明, 菊花花花瓣中中不仅含含有多种种营养物物质, 它还有有食用、药药用等多多种价值值, 有抗抗病毒、抗抗炎、抗抗氧化、抗抗HIVV 和癌癌细胞的的成分、舒舒血管、降降血压、降降血脂、抗抗肿瘤等等多种药药理作用用。菊
14、花的主主要繁殖殖方法有有扦插繁繁殖、分分株繁殖殖、压条条繁殖、嫁嫁接繁殖殖等,这些方方法均存存在一定定程度的的缺点与与不足,主要表表现为繁繁殖速度度不快、病病虫害发发生频率率高、易易受季节节变化 影响等等等, 尤其其在北方方地区冬冬季严寒寒,夏秋秋季为主主要绿化化季节,冬春季季节为育育苗季节节,相对对来说任任务重,成本高高。随着着组培技技术的发发展,其其快速、 高效、 保优等等都将改改变这种种不足,因此推推动菊花花走向组组培育苗苗的道路路在北方方地区有有着广阔阔的前景景。利用用组织培培养技术术进行菊菊花的快快速繁殖殖,则可有有效解决决上述问问题与矛矛盾,已越来来越成为为菊花繁繁殖的重重要方法法
15、与手段段,在菊花花种苗生生产上加加以推广广应用。现在生产产上多用用扦插和和嫁接繁繁殖,但但该方法法大面积积绿化使使用时成成苗慢,根据植植物细胞胞全能性性 ,利利用组织织培养方方法，在在短时间间内将体体细胞培培养出大大量植株株 ,在在农业生生产中有有着非常常大的推推广潜力力与意义义。栽培培技术在在菊花科科研中占占据着重重要的地地位, 已成为为人们研研究的重重点；其中人人们更侧侧重于成成分提取取与分析析研究, 人们们已经意意识到菊菊花的化化学成分分、色素素研究对对开发其其有效成成分有重重大意义义2。1.材料料和方法法1.1材材料与用用具 植物材料料：菊花嫩嫩茎。器材与用用具：超净工工作台、 解剖刀
16、刀、 长长柄镊子子、 架架台、无无菌滤纸纸、 酒酒精灯、火火柴、 标签、棉棉球、废废液缸、垃垃圾袋、皮皮筋、精精密pH试纸纸（5.47.00）、玻玻璃三角角瓶（1150mml）、封封口膜、培培养皿。药品与试试剂：MS培培养基母母液、激激素(生生长素 、细胞胞分裂素素等)母母液、有有机物（琼琼脂、蔗蔗糖）、无菌水、0.1 %升汞、 70 %、75%酒精、0.1MNaOH。1.2培培养条件件 适宜的温温度范围围为244 226，28培养时时生长快快但增殖殖倍数低低, 226时增殖殖倍数最最高,但但温度在在27 299时, 玻璃化化现象较较为严重重。3为了减轻轻试管苗苗玻璃化化现象我我们在培培养基中
17、中添加活活性碳，而而添加水水解酪蛋蛋白则使使玻璃苗苗百分率率增加。培养基基pH值值对玻璃璃苗发生生也有影影响，在在 pHH 5.877.0范范围内，玻玻璃苗百百分率以以pH 6.22时最高高，pHH 7.0时最最低；培培养过程程中注意意通气以以尽可能能降低培培养容器器内的空空气相对对湿度和和改善氧氧气供应应状况，有有助于克克服玻璃璃化光周期:以122 116h/ d 为宜。 在愈伤伤诱导期期进行适适量的暗暗培养, 有促促进愈伤伤形成的的作用。光光照强度度。范围围为10000 40000llx, 较多选选择15500 20000llx。 40000 50000lxx 的光光照使试试管苗的的分化增
18、增殖倍数数提高, 但对对生根则则相反。白白色光一一般能满满足生长长需要。1.3实实验前的的准备工工作1.3.1培养养基配制制 表-1 培养养基制作作配比培养基配比蔗糖琼脂pH丛生芽诱诱导MS+66-BAA3.00mg/L+NNAA00.5mmg/LL3%0.7%5.8继代培养养MS+66-BAA3.55mg/L+NNAA00.5mmg/LL3%0.7%5.8生根培养养1/2MMS+NNAA00.2mmg/LL3%0.7%5.8灭菌条件件为0.11MMPA，1120mmin。在煮琼脂脂时要把把握好时时间，不不宜过长长以免糖糖分受热热分解，导导致灭菌菌好的培培养基发发黄。灭菌前要要检查灭灭菌锅是是
19、否缺水水，灭菌菌时要正正确操作作，灭菌菌一定要要彻底，中中途期间间不要打打开灭菌菌锅。1.3.2接种种室的灭灭菌在实验的的前一天天,将接接种室用用高锰酸酸钾和甲甲醛熏蒸蒸进行灭灭菌消毒毒。1.3.3超净净工作台台及器械械消毒启动超净净工作台台,操作作之前用用 700 %的的酒精擦擦台面。将将操作用用刀、 镊子、 剪子等等用具在在酒精灯灯下用火火灼烧到到变红,冷却待待用。 1.3.4材料料选取 选取在脱脱毒实验验中成功功移栽上上盆而且且长势健健壮的植植株作为为实验材材料,选选取茎作作为实验验材料8。1.3.5材料料灭菌 选取生长长健壮的的嫩茎洗洗去表面面泥土 ,在超超净工作作台 ,用 775 %
20、酒精处处理 220330 秒秒 ,再再用无菌菌水冲洗洗 35 次次 ,转转入 00.1 %升汞汞溶液浸浸泡 88100 分钟钟 ,再再用无菌菌水冲洗洗 46 次次 ,用用滤纸吸吸干水分分。1.4.接种在无菌条条件下将将其切成成2厘米左右右带有腋腋芽的小小段，用镊子子夹取切切好的外外殖体材材料,然然后按极极性方向向直立迅迅速接种种到锥形形瓶的培培养基中中,深约约 23 mmm,注注意培养养瓶口始始终在火火焰下方方,尽量量使切口口接触培培养基，每个锥形瓶可接种 34 块外殖体。接种时锥形瓶应保持倾斜,接种后要迅速将瓶口在酒精灯上转动灼烧一遍进行消毒,然后迅速盖上专用透性膜封好。最后在瓶壁上贴上标签
21、,注明接种材料的名称、 编号和接种日期。接种完成后即转入培养室进行初代培养 ,培养温度2228 ,光强10004000 Lx。1.5诱诱导侧芽芽生长接种于诱诱导培养养基上进进行培养养。置于于光照培培养箱中中,每天连连续光照照1216hh ,光光照强度度为2 00003 0000LLx ,培养温温度(225 1) 。经过过10dd 菊花花茎尖颜颜色逐渐渐变绿,基部逐逐渐增大大,茎尖也也逐渐伸伸长,一般255d 后后,长出丛丛生芽。1.6继继代培养养将丛生芽芽切割下下,分开接接种于继继代培养养基之上上,一般155d 后后可长出出丛生芽芽,取丛生生芽转接接于新的的培养基基继代上,则可在在更短的的时间
22、内内(约10dd) 长长出丛生生芽,继代培培养的次次数越多多,从接种种到长出出丛生芽芽所需的的时间越越短,但不短短于7dd ,若若不及时时转接,芽苗会会迅速长长高。1.7诱导生生根待继代获获得较多多丛生芽芽后,将丛生生芽切成成单株,取长约约23 ccm的芽芽苗分开开接种于于生根培养养基上,进行诱诱导生根根培养,10dd 左右右就可出出现大量量小根,最后有有16 条根根可长得得较长,芽苗也也迅速长长高。待待生根后后,将生根根试管苗苗开盖练练苗,移栽。1.8移移栽培养养待根长至至12cmm时开瓶瓶进行练练苗,先将瓶瓶塞打开开,让其由由无菌环环境转至至有菌且且湿度较较低的环环境之中中约3dd ,将将
23、苗取出出,小心用用流水洗洗去根表表面的培培养基残残留物,移栽到到素沙中中,适当遮遮荫,一星期期后即可可成活,成活率率达955 %以以上,一个月月后即可可上盆。2结果与与分析21初初代培养养不同外植植体对芽芽诱导的的影响9，外植体体诱导成成芽时间间有差异异4。在拿菊菊花茎尖尖和菊花花叶片接接种到初初代培养养基上在在相同的的条件下下培养时时，发现现茎尖及及茎段最最为合适适,其他外外殖体在在此培养养基效果果不明显显。在培养过过程中我我们发现现有很多多都褐变变死亡。为为了防止止褐变我我们加入入了VCC溶液。为为了证明明VC能能抑制褐褐变我们们做了组组对比实实验，在在1，22组中我我们没加加入VCC，在
24、33，4组组中我们们加入了了VC，其其他条件件不变（如如表2）。表2 初代培培养记录录表：次数接种量真菌污染染细菌污染染褐变玻璃化正常成活率160107523660%260128823050%360910203965%460116313965%统计：240423118514460%从表2上上我们看看到第33，4组组的褐变变的数量量比第11，2组组的褐变变数量少少。可见见在接种种前先用用1000 mgg/ LL Vcc 浸泡泡外植体体1 hh ,在在其以后后的继代代过程中中加入 2000 mgg/ LL 聚乙乙烯吡咯咯吡烷酮酮（PVVP） ,可有有效地控控制褐变变现象5。当褐变变现象不不再发生生
25、时,要要及时停停止添加加PVPP ,以以防长期期使用 PVPP 对外外植体产产生毒副副作用。22继继代培养养表-3 继代代培养记记录表：次数接种量真菌污染染细菌污染染褐变玻璃化正常成活率1992130304545%2841527004250%31171833036354%41082433304844%统计：408781236319849%23生生根诱导导及移栽栽对大多数数菊花而而言加入入适量的的生长素素效果会会更好, 从生生根的天天数和生生根的质质量看IIBA 较NAAA 好 6。表-4菊菊花组培培中生长长素的浓浓度范围围(单位:mmg/L )生长素NAAIBAIAA愈伤诱导导和分化化0. 0
26、01 2-0. 33 3生根0. 11 0. 3 (1/2M S)0. 11 0. 31. 006-BAA浓度00. 5 mmg/LL范围内内,菊花分分枝数随随6-BA浓度度增高而而增多,但超过过这一浓浓度,菊花分分枝数随随浓度增增高而降降低,说明菊菊花分枝枝数在一一定范围围内与66-BA 浓度呈呈正相关关。当 6-BA 浓度为为0. 5mgg/L,与其他他浓度相相比差异异极显著著(P 0. 01)7。在实验过过程中发发现,66-BA/ NAAA 比比值越大大有利于于芽分化化。结果果显示,试验所所采用的的诱导培培养基芽芽分化虽虽然较少少,但分化化的芽都都属有效效芽。最最终筛选选出此培培养基较较
27、佳配方方,继代周周期为22530dd ,增增殖倍数数47 倍。因时间和和材料问问题本次次试验为为能完成成生根培培养和移移栽，但但通过查查阅资料料得知：当继代代培养的的丛生芽芽长至22. 553. 5cmm,具23 片叶叶时,可将其其切成单单株,转接到到各种生生根培养养基上进进行培养养,一般1 周后有有根出现现100。在组织织培养的的过程中中,试管苗苗移栽的的成功与与否也是是一个关关键的环环节,因为试试管苗在在试管中中不论生生长多好好,移栽若若不成功功则导致致前功尽尽弃。在在试验中中,当试管管苗具有有45 片叶叶,56 条根根时即可可移栽。24细细菌、真真菌污染染及防治治表-5 初代代、继代代培
28、养中中的污染染统计培养类型型污染分类类总计概率率染菌表现现初代真菌污染染17.55%外植体周周围有白白色绒毛毛状菌丝丝，培养养基出现现绿、白白菌斑细菌污染染13%培养基表表层呈水水渍状污污染，外外植体周周围滴形形云雾状状污染继代真菌污染染19%培养基表表层出现现黄、白白色油滴滴状菌斑斑细菌污染染30%培养基表表层有粉粉红色如如水渍状状分布的的菌斑在实验过过程中，我我们会发发现每次次实验下下来总有有几瓶污污染的，大大多都是是真菌和和细菌污污染。细细菌污染染主要是是我们的的操作部部规范，接接种时没没有严格格按照操操作制，在在接种时时说话，或或者随处处走动，自自身消毒毒不彻底底导致。为了防止当代培养
29、基染菌，我们在培养基中附加50150mg/l氨苄青霉素；为了防止生根培养基的试管苗染菌我们加入50mg/l 硫酸丁胺卡那霉素。3.讨论论通过本次次实验我我们了解解到不同同的激素素组合对对不定芽芽的增殖殖也有影影响。激激素水平平对愈伤伤组织再再分化关关系密切切, 随激激素水平平的提高高外植体体的分化化率增加加,芽的分分化系数数也提高高 , 但激素素浓度过过高和生生长素与与细胞分分裂素配配比失调调, 易导导致玻璃璃化苗的的产生。在在相同激激素水平平、相同同条件下下, 不同同菊花品品种的生生长有很很大的差差异。由由此可见见, 对某某一品种种的菊花花进行组组培时, 选用用什么样样的激素素种类和和配比,
30、 较难难有一个个固定的的模式, 除了了参照前前人的经经验外, 最好好的办法法还是先先进行小小规模的的试验, 选出出适宜的的激素组组合再扩扩大生产产。我们在继继代增殖殖试验过过程中注注意到,采用0. 7 %的琼琼脂比采采用0. 1 %的植植物胶效效果要好好。0.7%琼脂脂培养基基培养皿皿中湿度度稍低。而且在实验过程中可能会出现培养基不凝固现象，那么我们首先考虑的对象就是琼脂，而这导致这现象有2种可能：一、琼脂放置时间过长，效果削弱；二、可能要对其百分比进行调整。特别是在接种时如果发现嫩茎很难插进培养基那么下次应该适当的降低琼脂比例，如发现随凝固但很软就应在下次增大比例 ，方案上的不一定都合适，要
31、看实际情况而定。菊花为试试管苗快快速繁殖殖系数较较高的一一种植物物. 在实实践中,如何建建立高效效的无菌菌系、选选择合适适的培养养基、控控制各个个阶段的的培养条条件是技技术关键键。参考文献献：1李李时珍. 本草草纲目M. 第二二册. 北京:人民卫卫生出版版社, 19779: 9299.2 李金格格等. 我国菊菊花研究究状况和和发展趋趋势文献献计量分分析. 现代代农业科科技,20008 ,16(2): 10007- 577393 孙满芝芝,尹成涛涛. 植植物组培培过程中中玻璃化化现象的的发生与与解决措措施. 山东林林业科技技,20001,(6):199-2004 建德锋锋,赵文若若,赵海锋锋,陈
32、刚.菊花组组织培养养技术研研究.北北方园艺艺,20007,(9) :220020115 张素琴琴等. 非洲菊菊组织培培养抑制制褐变现现象的研研究.贵贵州农业业科学,20007 ,35 (2) :5566 刘忠荣荣,洪波波. 培培养因素素对菊花花组织培培养的影影响.广广西农业业科学,20004,(1):19-217 王艳玲玲,奚广生生.不同同浓度66-BA对菊菊花分枝枝的影响响. 安徽徽农业科科学, 20008, 366 (220) : 8846558胡胡军荣.菊花的的脱毒与与快繁技技术.安徽农农学通报报, 220088, 114 (5)9 吴友根根.菊花花外植体体分化诱诱导及植植株再生生研究初初报.中中国农学学通报,20007,223 (12):63310焦德志志等.菊花花的快速速繁殖.北方园园艺,220077,(6) :22082100致谢 感谢生生养了我我的父母母是你们们给了我我学习上上的支持持，感谢谢培养了了我的母母校给我我们即将将踏上社社会的引引导，感感谢指导导了我的的老师们们，是你你们辛勤勤的汗水水换来了了我们对对未来的的憧憬，感感谢和我我一同度度过三年年美好时时光的同同学。感感谢 第23页，共13页