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1、微生物饲饲料添加加剂 乳乳酸菌的的微生物物学检验验www.饲料检测网.中国www. 饲料检测网.cn一、概述述乳酸细菌菌是一类类能利用用发酵糖糖产生大大量乳酸酸的细菌菌通称。乳乳酸细菌菌主要包包括233个属，通通常在饲饲料中用用作有益益微生物物的菌种种有干酪酪乳杆菌菌（Laactoobaccilllus cassei）、植物乳乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、粪肠球菌(Enterococcus faecium)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、两歧双歧杆菌(Bifidoba
2、cterium bifidum)、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、乳酸乳杆菌(Lactococcus Lactis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等。乳杆菌常常用MRRS琼脂脂作半选选择培养养基。AAPT培培养基通通常用于于分离绿绿色乳杆杆菌和其其他乳杆杆菌及肉肉食杆菌菌。当乳乳杆菌仅仅是复杂杂区系中中的部分分菌类时时，SLL培养基基常用作作为选择择性培养养基。对对于芽孢孢乳杆菌菌常用GGYP培培养基，链链球菌有有TYCC培养基基、MSS培养基基，还有有利用磺磺胺二甲甲恶唑、制制大肠菌菌素和结结晶紫等等作为选选择因子子。M117培养养基被用
3、用作乳球球菌的分分离培养养基。此此外还有有如溴甲甲酚紫培培养基、CHALMERS培养基等也常用于乳酸菌的分离。以下举几几个例子子来说明明乳酸菌菌的作用用及特性性。嗜酸酸乳杆菌菌属于乳乳杆菌属属（Laactoobaccilllus）的的一个种种。其特特性为：杆菌，两两端圆，不不运动，无无鞭毛，接接触酶阴阴性，和和苦杏仁仁苷、纤纤维二糖糖、七叶叶灵、果果糖、半半乳糖、葡葡萄糖、乳乳糖、麦麦芽糖、甘甘露糖、水水杨苷、蔗蔗糖反应应为阴性性，阿拉拉伯糖、葡葡糖酸盐盐、甘露露醇、松松三糖、鼠鼠李糖、核核糖、山山梨糖、木木糖反应应为阴性性。由于于嗜酸乳乳杆菌在在生长中中可以产产生一些些抑菌物物质，如如有机酸
4、酸、细菌菌素及类类细菌素素，可以以抑制肠肠道中有有害微生生物生长长繁殖，起起到平衡衡肠道菌菌群的作作用。并并能产生生B族维维生素，包包括各种种叶酸、生生物素、维维生素BB6和维生生素K等等，分泌泌各种有有益物质质，如乳乳酸、乙乙酸等，降降低肠道道pH值。粪肠肠球菌主主要存在在于人类类或动物物肠道，是是人类和和动物肠肠道的正正常菌群群等。粪粪肠球菌菌为革兰兰氏阳性性，圆形形或椭圆圆形，能能在胆汁汁七叶苷苷琼脂上上生长，不不产生色色素。乳乳酸片球球菌细胞胞呈球状状，直径径0.661.0m，在直直角两个个平面交交替形成成四联状状，一般般细胞成成对生，单单生者罕罕见，不不成链状状排列。革革兰氏阳阳性，
5、不不运动，兼兼性厌氧氧。在MMRS培培养基上上菌落小小，呈白白色。沿沿洋菜穿穿刺线的的生长物物呈丝状状，接触触酶阴性性，不产产细胞色色素，在在不加啤啤酒花的的麦芽汁汁中生长长，能利利用半乳乳糖、阿阿拉伯糖糖、木糖糖和海藻藻糖产酸酸，不分分解蛋白白质，不不产吲哚哚，不水水解马尿尿酸盐。某某些菌株株能利用用蔗糖和和乳糖产产微量的的酸。不不能利用用麦芽糖糖、甘露露醇、糊糊精等产产酸，能能产丁二二酮。二、检测测方法1 范范围本方法规规定了微微生物饲饲料中各各乳酸菌菌(包括干干酪乳杆杆菌、植植物乳杆杆菌、粪粪肠球菌菌、屎肠肠球菌、嗜嗜酸乳杆杆菌、乳乳酸乳杆杆菌、戊戊糖片球球菌)及其总总数的测测定及鉴鉴定
6、方法法。本方法适适用于微微生物饲饲料中乳乳酸菌的的检测。2 术术语：乳酸菌：一群能能分解葡葡萄糖或或乳糖产产生乳酸酸，需氧氧和兼性性厌氧，多多数无动动力，过过氧化氢氢酶阴性性，革兰兰氏阳性性的无芽芽胞杆菌菌和球菌菌。乳酸菌菌菌数总数数：试料料在一定定条件下下培养后后，所得得1mL试料料中所含含乳酸菌菌菌落的的总数。3 设设备和材材料3.1 恒温培培养箱：361。3.2 冰箱：044。3.3 恒温水水浴：44613.4 电炉：可调式式。3.5 吸管：容量为为1、10、25mLL。3.6 广口瓶瓶或三角角瓶：容容量为5500 mL。3.7 平皿：直径为为9 cmm。3.8 试管：181800 mm
7、m。3.9 显微镜镜。3.100高压灭灭菌锅。3.111烘箱。4 培养养基和试试剂4.1 改良TTJA培培养基（改改良番茄茄汁琼脂脂培养基基）。4.2 改良MMC培养养基（MModiifieed CChallmerrs培养养基）。4.3 0.11%美兰兰牛乳培培养基。4.4 6.55%氯化化钠肉汤汤。4.5 pH99.6葡葡萄糖肉肉汤。4.6 40%胆汁肉肉汤。4.7 淀粉水水解培养养基。4.8 精氨酸酸水解培培养基。4.9 乳酸杆杆菌糖发发酵管。4.100 七叶叶苷培养养基。4.111 革兰兰氏染色色液。4.122 3%过氧化化氢溶液液。4.133 蛋白白胨水、靛靛基质试试剂。4.144 明
8、胶胶培养基基。4.155 硝酸酸盐培养养基、硝硝酸盐试试剂。4.166 生理理盐水：将蒸馏馏水加入入8.55g的食盐盐中做成成10000 mmL的溶溶液。在在1211下灭菌菌15mmin。5 乳酸酸菌菌落落总数的的测定5.1 检验程程序乳酸菌菌菌落总数数检验程程序如下下：试料作成几个适当倍数的稀释液选择23个适当稀释度，各以1 mL之量加入灭菌平皿内每皿内加入适量改良TJA或改良MC培养基721361菌落计数报告图：乳酸酸菌检测测程序图图5.2 操作作步骤5.2.1 以以无菌操操作将经经过充分分摇匀的的试料225 mmL（或或25 g）放入入含有2225 mL灭菌菌生理盐盐水的灭灭菌广口口瓶内
9、作作成1:10的的均匀稀稀释液。5.2.2用11mL灭菌菌吸管吸吸取1:10稀稀释液11mL，沿沿管壁徐徐徐注入入含有99 mLL灭菌生生理盐水水的试管管内（注注意吸管管尖端不不要触及及管内稀稀释液）。5.2.3另取取1 mmL灭菌菌吸管，按按上述操操作顺序序，作110倍递递增稀释释液，如如此每递递增一次次，即换换用1支支1 mmL灭菌菌吸管。5.2.4选择择233个以上上适宜稀稀释度，分分别在作作10倍倍递增稀稀释的同同时，即即以吸取取该稀释释度的吸吸管移11 mLL稀释液液于灭菌菌平皿内内，每个个稀释度度作两个个平皿。5.2.5稀释释液移入入平皿后后，应即即时将冷冷至500的乳酸酸菌计数数
10、培养基基（改良良TJAA或改良良MC）注注入平皿皿约155 mLL，并转转动平皿皿使混合合均匀。同同时将乳乳酸菌计计数培养养基倾入入加有11 mLL稀释液液试料用用的灭菌菌生理盐盐水的灭灭菌平皿皿内作空空白对照照，以上上整个操操作自培培养物加加入培养养皿开始始至接种种结束须须在200 miin内完完成。5.2.6待琼琼脂凝固固后，翻翻转平板板，置3361恒温培培养箱内内培养7721 h取出出，观察察乳酸菌菌菌落特特征（见见表1），选选取菌落落数在3303300之之间的平平板进行行计数。5.3 乳酸菌菌在改良良TJAA和改良良MC培培养基上上菌落生生长形态态特征见见表1。表1 乳酸酸菌菌落落特征
11、改良TJJA改良MCC杆菌平皿底为为黄色，菌菌落中等等大小，微微白色，湿湿润，边边缘不整整齐，直直径31mm，如如棉絮团团状菌落落。平皿底为为粉红色色，菌落落较小，圆圆形，红红色，边边缘似星星状，直直径21mm，可可有淡淡淡的晕。球菌平皿底为为黄色，菌菌落光滑滑，湿润润，微白白色，边边缘整齐齐。平板底为为粉红色色，菌落落较小，圆圆形，红红色，边边缘整齐齐，可有有淡淡的的晕。注：干酪酪乳杆菌菌在改良良TJAA培养基基上为圆圆形光滑滑，边缘缘整齐，侧侧面呈菱菱形状，6乳酸菌菌的鉴定定进行革兰兰氏染色色，显微微镜检查查，并做做过氧化化氢酶试试验。革革兰氏阳阳性，过过氧化氢氢酶阴性性，无芽芽胞的球球菌
12、或杆杆菌可定定为乳酸酸菌。对对上述分分离到的的乳酸菌菌需进行行菌种鉴鉴定，则则作以下下试验。6.1 菌种制制备：自自平板上上挑取菌菌落，接接种于改改良TJJA或改改良MCC琼脂斜斜面，于于361，244488 h培养养，刮取取菌苔，分分别进行行下列试试验。6.2 乳酸杆杆菌鉴定定试验：极少见见还原硝硝酸盐，不不液化明明胶，不不产生靛靛基质和和硫化氢氢。6.3几几种乳杆杆菌属内内种的碳碳水化合合物反应应，见表表2。6.4肠肠球菌的的鉴别试试验，见见表3。6.5 肠球菌菌属与片片球菌属属容易混混淆，其其鉴别可可见表44。表2 常见乳乳杆菌属属内种的的碳水化化合物反反应七叶苷纤维二糖糖麦芽糖甘露醇水
13、杨苷山梨醇棉籽糖蔗糖干酪乳杆杆菌+d+-d嗜酸乳杆杆菌+-+-d+植物乳杆杆菌+注：d有些些菌株阳阳性，有有些菌株株阴性；#弱、慢慢或阴性性。表3 肠肠球菌的的鉴别表表名称-半乳乳糖苷酶酶L-阿拉拉伯糖甘露醇蜜二糖山梨醇丙酮酸发发酵粪肠球菌菌-+-D+屎肠球菌菌VVVVD-注：D+，通常常阳性；D-，通通常阴性性；V，不不同或可可变。表4 链球属属与片球球菌属的的鉴别特特征链球菌属属片球菌属属细胞形态态球或卵圆圆形球形排列成对，链链四联，成成对接触酶-d厌氧条件件下生长长良好+从葡萄糖糖产气-抗万古霉霉素-+注：d有些些菌株阳阳性，有有些菌株株阴性。7 结果果计算及及表述7.1 乳酸菌菌总数菌落计数数后，随随机挑取取5个菌菌落进行行鉴定。根根据证实实为乳酸酸菌菌落落计算出出该皿内内的乳酸酸菌数，然然后乘其其稀释倍倍数即得得每毫升升样品中中乳酸菌菌数。7.2 各乳酸酸菌数菌落计计数后，随随机挑取取5个菌菌落进行行鉴定，根根据证实实为某乳乳酸菌菌菌落计算算出该皿皿内的此此乳酸菌菌数，然然后乘其其稀释倍倍数即得得每毫升升样品中中此乳酸酸菌数。如如含有屎屎肠球菌菌的试料料中100-6稀释释液在改改良TJJA琼脂脂平板上上，生成成的屎肠肠球菌可可疑菌落落为1000个，取取5个鉴鉴定，证证实为屎屎肠球菌菌的是44个，由由1克试料料中含屎屎肠球菌菌数为：。.