《《生物化学》实验指导书doz.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《生物化学》实验指导书doz.docx（50页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、生物化化学实实验指导导书适用专业业：生物物技术、生生物工程程、食品品科学与与工程生物与食食品工程程学院生生物科学学系生物化学学实验细细则为了保证证生物化化学实验验的顺利利进行，培培养同学学们掌握握良好、规规范的生生物化学学基本实实验技能能，特制制定以下下实验细细则，请请同学们们严格遵遵守。1. 实验前应应提前预预习实验验指导书书并复习习相关知知识。2. 严格按照照生物化化学实验验分组，分分批进入入实验室室，不得得迟到。非非本实验验组的同同学不准准进入实实验室。3. 进入实验验室必须须穿实验验服。各各位同学学进入各各自实验验小组实实验台后后，保持持安静，不不得大声声喧哗和和嬉戏，不不得无故故离开
2、本本实验台台随便走走动。绝绝对禁止止用实验验仪器或或药物开开玩笑。4. 实验中应应保持实实验台的的整洁，废废液倒入入废液桶桶中，用用过的滤滤纸放入入垃圾桶桶中，禁禁止直接接倒入水水槽中或或随地乱乱丢。5. 实验中要要注意节节约药品品与试剂剂，爱护护仪器，使使用前应应了解使使用方法法，使用用时要严严格遵守守操作规规程，不不得擅自自移动实实验仪器器。否则则，因非非实验性性损坏，由由损坏者者赔还。6. 使用水、火火、电时时，要做做到人在在使用，人人走关水水、断电电、熄火火。7. 做完实验验要清洗洗仪器、器器皿，并并放回原原位，擦擦净桌面面。8. 实验后，要要及时完完成实验验报告。20066年1月目
3、录生物化学学实验细细则1目 录2实验1 蛋白白质的沉沉淀、变变性反应应3实验2 醋酸酸纤维素素薄膜电电泳分离离血清蛋蛋白66实验3 SDDS聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳测定蛋蛋白质分分子量111实验4 凝胶胶过滤层层析法测测定蛋白白质分子子量116实验5 DNNA的琼琼脂糖凝凝胶电泳泳200实验6 唾液液淀粉酶酶的性质质和活力力测定24实验7生生物氧化化与电子子传递25实验8 植物物体内的的转氨基基作用277实验1蛋白质质的沉淀淀、变性性反应（3学时时）目的要求求1. 加加深对蛋蛋白质胶胶体溶液液稳定因因素的认认识。2. 了了解沉淀淀蛋白质质的几种种方法及及其实用用意义。3. 了了解蛋白白质变性性
4、与沉淀淀的关系系。原 理在水溶液液中，蛋蛋白质分分子表面面形成水水化层和和双电层层而成为为稳定的的胶体颗颗粒，所所以蛋白白质溶液液和其他他亲水胶胶体溶液液相类似似。但是是，蛋白白质胶体体颗粒的的稳定性性是有条条件的，相相对的。在在一定的的物理化化学因素素影响下下，蛋白白质颗粒粒失去电电荷，脱脱水，甚甚至变性性，则以以固态形形式从溶溶液中析析出，这这个过程程称为蛋蛋白质的的沉淀反反应。这这种反应应可分为为以下两两种类型型：1可逆逆沉淀反反应在发生沉沉淀反应应时，蛋蛋白质虽虽已沉淀淀析出，但但它的分分子内部部、空间间结构并并未发生生显著变变化，基基本上保保持原有有的性质质，沉淀淀因素除除去后，能能
5、再溶于于原来的的溶剂中中。这种种作用称称为可逆逆沉淀反反应。如如大多数数蛋白质质的盐析析作用或或在低温温下用乙乙醇（或或丙酮）短短时间作作用于蛋蛋白质以以及利用用等电点点的沉淀淀，提纯纯蛋白质质时，常常利用此此类反应应。2不可可逆沉淀淀反应在发生沉沉淀反应应时，蛋蛋白质分分子内部部结构、空空间构象象遭到破破坏，失失去原来来的天然然性质，这这时蛋白白质已发发生变性性。这种种变性蛋蛋白质的的沉淀不不能再溶溶解于原原来溶剂剂中的作作用称为为不可逆逆沉淀反反应。重重金属盐盐、生物物碱试剂剂，强酸酸、强碱碱、加热热、震荡荡、超声声波、有有机溶剂剂等都能能使蛋白白质发生生不可逆逆沉淀反反应。蛋白质变变性后
6、，有有时由于于维持溶溶液稳定定的条件件仍然存存在（如如电荷）并并不析出出，因此此，变性性蛋白质质不一定定都表现现为沉淀淀，而沉沉淀的蛋蛋白质也也未必都都已变性性。试剂和器器材一、试剂剂1. 蛋蛋白质溶溶液：110mll/组 取5mll鸡或鸭鸭蛋清，用用蒸馏水水稀释至至1000ml，搅搅拌均匀匀后用448层纱纱布过滤滤，新鲜鲜配置。2.蛋白白质氯化化钠溶液液：3mml/组组取20mml蛋清清，加蒸蒸馏水2200mml和饱饱和氯化化钠溶液液1000ml，充充分搅匀匀后，以以纱布滤滤去不溶溶物（加加入氯化化钠的目目的是溶溶解球蛋蛋白）。3.其余余试剂：硫酸铵粉粉末（110克/组），饱饱和硫酸酸铵溶液
7、液(1550mll)，3%硝酸银银（2880mll），00.5%乙酸铅铅（2000mll），浓浓硫酸（5ml/组），5%磺基水杨酸（100ml），0.1%硫酸铜（100ml），饱和硫酸铜溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），饱和氯化钠溶液（25ml），10%氢氧化钠溶液（500ml）。二、器材材试管（115支/组组），过过滤漏斗斗（1个个），试试管架11个/组组，玻璃璃棒1支支/组，沸沸水浴44台，量量筒（总总需要220mll1,2200mml1），烧烧杯（总总需要1100mml2，44002），试试剂瓶（112个/组，附附胶头滴滴管100支/组组），移移液
8、管（55ml6/组组，1mml3/组组），滤滤纸1盒盒，洗瓶瓶1个/组，废废液缸11个/组组，药匙匙1个/组，移移液管架架1个/组操作方法法一、蛋白白质的可可逆沉淀淀反应蛋白质质的盐析析作用(分级盐盐析)二、蛋白白质的不不可逆沉沉淀反应应1.重金金属沉淀淀蛋白质质2.酸沉沉淀蛋白白质1）2）3.加热热沉淀蛋蛋白质取5支试试管，编编号，按按下表加加入有关关试剂（单单位/滴滴）。试剂管号蛋白质溶溶液0.1%乙酸10%乙乙酸饱和氯化化钠10%氢氢氧化钠钠蒸馏水123451010101010555227225将各管混混匀，观观察记录录各管现现象后，放放入沸水水浴中加加热100minn，比较较各管的的沉
9、淀情情况。思 考 题1. 名名词解释释：水化化层；双双电层；蛋白质质变性；盐溶与与盐析；蛋白质质等电点点沉淀。2. 将将实验结结果写在在实验报报告中操操作方法法的对应应位置上上并就实实验现象象作简要要解释。3. 根根据实验验现象，讨讨论下列列问题：1） 蛋白质可可逆沉淀淀与不可可逆沉淀淀的本质质区别是是什么？2） 简述蛋白白质的沉沉淀反应应、变性性作用和和凝固作作用的相相互关系系。4. 作作为杀菌菌剂，氯氯化汞是是怎样起起作用的的？实验2醋酸纤纤维素薄薄膜电泳泳分离血血清蛋白白（4学时时）目的要求求1. 学习蛋白白质电泳泳的一般般原理及及方法。2. 掌握用醋醋酸纤维维素薄膜膜电泳分分离蛋白白质
10、的操操作技术术。原 理带电颗粒粒在电场场的作用用下，向向着与其其电性相相反的电电极移动动，这种种现象称称为电泳泳。带电电颗粒之之所以能能在电场场中向一一定的方方向移动动，并具具有一定定的迁移移速度，是是取决于于带电颗颗粒本身身性质的的影响，以以及电场场强度、溶溶液的ppH值、离离子强度度及电渗渗等因素素的影响响。蛋白白质具有有两性性性质，在在溶液中中可解离离的基团团除肽链链末端的的氨基和和羧基外外，还有有很多侧侧链基团团在一定定的pHH条件下下能解离离而使蛋蛋白质带带电。当当溶液的的pHpI（等等电点）时时，蛋白白质带负负电荷，在在电场中中向正极极移动，而而的pHHpI时时，则带带正电荷荷，电
11、泳泳时向负负极移动动。由于于蛋白质质分子在在溶液中中解离成成带电的的颗粒，所所以在电电场中除除等电点点外均能能定向泳泳动，其其电泳的的方向和和速度主主要决定定于所带带电荷的的性质，以及所带电荷数量、颗粒大小和形状。不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用迁移率来表示。迁移率的定义是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。其计算公式如下：式中：mm为迁移移率（ccm2/Vs）；v为颗颗粒的泳泳动速度度（cmm/s）；E为电场场强度（V/cm）；为颗粒泳动的距离（cm）；为支持物的有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为电泳时间（s）。各种蛋白白质的等等电点、分分子量及及颗粒大大小各不不相同，
12、在在某一指指定的ppH值溶溶液中，各各种蛋白白质所带带的电荷荷不同，因因而在电电场中迁迁移的方方向和速速度不同同。根据据这个原原理，就就可以从从蛋白质质混合物物中将各各种蛋白白质分离离出来。因因此，电电泳技术术在生物物化学与与分子生生物学研研究中被被广泛用用于生物物大分子子或小分分子（如如蛋白质质、核酸酸、氨基基酸等）的的分离纯纯化与分分析鉴定定等。同同时此项项技术也也普遍用用于临床床诊断和和工农业业生产实实践中，并并已发展展成为这这些部门门的重要要分析分分离手段段。醋酸纤维维素薄膜膜电泳是是以醋酸酸纤维素素薄膜为为支持物物的一种种区带电电泳。这这种薄膜膜具有均均一的泡泡沫状结结构，厚厚度为1
13、120m，渗渗透性强强，对样样品无吸吸附作用用，用它它作支持持物进行行电泳，电电泳效果果比纸电电泳好，具具有样品品用量少少，分离离速度快快，电泳泳图谱更更为清晰晰，灵敏敏度也较较高（55g / mll以上）等优点点。目前前已广泛泛应用于于血清蛋蛋白、血血红蛋白白、脂蛋蛋白、同同工酶的的分离和和测定等等方面。本实验以以醋酸纤纤维素薄薄膜为电电泳支持持物，分分离各种种血清蛋蛋白。血血清中含含有清蛋蛋白、-球蛋蛋白、-球蛋蛋白、-球蛋蛋白和各各种脂蛋蛋白等。各各种蛋白白质由于于氨基酸酸组分、立立体构象象、分子子量、等等电点及及形状不不同（如如图2-1），在电场场中迁移移速度不不同。分分子量小小、等电
14、电点低、在在相同碱碱性pHH缓冲体体系中、带带负电荷荷多的蛋蛋白质颗颗粒在电电场中迁迁移速度度快。例例如，正正常人血血清在ppH8.6的缓缓冲体系系中电泳泳1h左左右，染染色后可可显示55条区带带。清蛋蛋白泳动动最快，其其余依次次为1，2，-及-球蛋蛋白（如如图2-2）。这些区区带经洗洗脱后可可用分光光光度法法定量，也也可直接接进行光光吸收扫扫描自动动绘出区区带吸收收峰及相相对百分分比。临临床医学学常利用用它们间间相对百百分比的的改变或或异常区区带的出出现作为为临床鉴鉴别诊断断的依据据。蛋白质名名称等电点（ppI）分子量清蛋白-球蛋蛋白-球蛋蛋白-球蛋蛋白4.8885.0665.1226.85
15、57.506900001-220000002-3300000090000015000000156000030000000图2-11 人血清清中5种种蛋白质质的等电电点及分分子量图2-22 正常人人血清醋醋酸纤维维素薄膜膜电泳示示意图1为清蛋蛋白（或或称为白白蛋白），22、3、44、5分分别为1-、2-、-及-球蛋蛋白，66为点样样原点试剂和器器材一、测试试材料未溶血的的人或动动物血清清。二、试剂剂1.巴比比妥巴比妥妥钠缓冲冲液（PPH8.6，00.077moll/L，离离子强度度0.006）：称取1.66gg巴比妥妥（ARR）和112.776g巴巴比妥钠钠（ARR），置置于三角角烧瓶中中，加蒸
16、蒸馏水约约6000ml，稍稍加热溶溶解，冷冷却后用用蒸馏水水定容至至10000mll。置44保存，备备用。2. 染染色液（00.5%氨基黑黑10BB）：称取0.5g氨氨基黑110B，加加蒸馏水水40mml，甲甲醇（AAR）550mll，冰乙乙酸（AAR）110mll，混匀匀溶解后后置具塞塞试剂瓶瓶内贮存存。3. 漂洗液：取95%乙醇（AAR）445mll，冰乙乙酸（AAR）55ml和和蒸馏水水50mml，混混匀置具具塞试剂剂瓶内贮贮存。4. 透透明液：临用前前制备。甲液：取取冰乙酸酸（ARR）155ml，无无水乙醇醇（ARR）855ml，混混匀置试试剂瓶内内，塞紧紧瓶塞，备备用。乙液：取取冰乙
17、酸酸（ARR）255ml，无无水乙醇醇（ARR）755ml，混混匀置试试剂瓶内内，塞紧紧瓶塞，备备用。5. 保保存液：液体石石蜡。6. 定定量洗脱脱液（00.4mmol/L NNaOHH溶液）：称取166g氢氧氧化钠（AAR）用用少量蒸蒸馏水溶溶解后定定容至110000ml。三、器材材醋酸纤维维素薄膜膜（28cmm），培培养皿（直直径910ccm），解解剖镊子子，点样样器，直直尺和铅铅笔，电电泳仪及及电泳槽槽，玻璃璃板（11212ccm），试试管及试试管架，吸吸量管（22ml，55ml），吹吹风机，普普通滤纸纸。操作方法法一、薄膜膜与仪器器的准备备1. 醋醋酸纤维维素薄膜膜的润湿湿与选择择用镊
18、子取取一片薄薄膜，小小心地平平放在盛盛有缓冲冲液的平平皿中。若若漂浮于于液面的的薄膜在在1530ss内迅速速润湿，整整条薄膜膜色泽深深浅一致致，则此此膜均匀匀可用于于电泳；若薄膜膜润湿缓缓慢，色色泽深浅浅不一或或有条纹纹及斑点点等，则则表示薄薄膜不均均匀应弃弃去，以以免影响响电泳结结果。将将选好的的薄膜用用镊子轻轻压，使使其完全全浸泡于于缓冲液液中约330miin后，方方可用于于电泳。2. 电泳槽的的准备根据电泳泳槽膜支支架的宽宽度，裁裁剪尺寸寸合适的的滤纸条条。在两两个电极极槽中，各各倒入等等体积的的电极缓缓冲液，在在电泳槽槽的两各各膜支架架上，各各放两层层滤纸条条，使滤滤纸一端端的长边边与
19、支架架前沿对对齐，另另一端侵侵入电极极缓冲液液内。当当滤纸条条全部润润湿后，用用玻璃棒棒轻轻挤挤压在膜膜支架上上的滤纸纸以驱赶赶气泡，使使滤纸的的一端能能紧贴在在膜支架架上。滤滤纸条是是两个电电极槽联联系醋酸酸纤维素素薄膜的的桥梁，因因而称为为滤纸桥桥。3. 电极槽的的平衡用平衡装装置（或或自制平平衡管）连连接两个个电泳槽槽，使两两个电极极槽内的的缓冲液液彼此处处于同一一水平状状态，一一般需平平衡15520mmin，注注意，取取出平衡衡装置时时应将活活塞关紧紧。二、 点样1. 制备点样样模板取一张干干净滤纸纸（10010ccm），在在距纸边边1.55cm处处用铅笔笔划一平平行线，此此线为点点样
20、标志志区。2. 点样用镊子取取出浸透透的薄膜膜，夹在在两层滤滤纸间轻轻轻按压压，吸去去多余的的缓冲液液。无光光泽面向向上平放放在点样样模板上上，使其其底边与与模板底底边对齐齐。点样样区距阴阴极端11.5ccm处。点点样时，先先用玻片片一端截截面沾取取一定量量的血清清，然后后将沾有有样品的的玻片截截面垂直直地与纤纤维素薄薄膜点样样区处轻轻轻接触触，样品品即呈一一条线“印”在薄膜膜上，（如如图2-3）使使血清完完全渗透透至薄膜膜内，形形成细窄窄而均匀匀的直线线。此步步是实验验的关键键，点样样前应在在滤纸上上反复练练习，掌掌握点样样技术后后再正式式点样。图2-33 醋酸酸纤维素素薄膜规规格及点点样位
21、置置示意图图虚线处为为点样位位置三、 电泳用镊子将将点样端端的薄膜膜平贴在在阴极电电泳槽支支架的滤滤纸桥上上（点样样面朝下下），另另一端平平贴在阳阳极端支支架上，如如图所示示。要求求薄膜紧紧贴滤纸纸桥并绷绷直，中中间不能能下垂。如如一电泳泳槽中同同时安放放几张薄薄膜，则则薄膜之之间应相相隔几毫毫米。盖盖上电泳泳槽盖，使使薄膜平平衡100minn。图2-44 电泳泳装置剖剖视示意意图1.滤纸纸桥2.电泳槽槽3. 醋酸纤纤维素薄薄膜4.电泳槽槽支架55.电极极室中央央隔板用导线将将电泳槽槽的正、负负极分别别连接，注注意不要要接错。在在室温下下电泳，打打开电源源开关，用用电泳仪仪上细调调节旋扭扭调到
22、每每厘米膜膜宽电流流强度为为0.33mA（88片薄膜膜则为44.8 mA）。通通电10015mmin后后，将电电流调节节到每厘厘米膜宽宽电流强强度为00.5mmA（88片共88mA），电电泳时间间约50080mmin。电电泳后调调节旋扭扭使电流流为零，关关闭电泳泳仪切断断电源。四、 染色与漂漂洗1. 血清蛋白白染色与与漂洗脱脱色用解剖镊镊子取出出电泳后后的薄膜膜，放在在含0.5%氨氨基黑110B染染色液的的培养皿皿中，浸浸染5mmin。取取出后再再用漂洗洗液浸洗洗、脱色色，每隔隔10mmin换换漂洗液液一次，连连续数次次，直至至背景蓝蓝色脱尽尽。取出出薄膜放放在滤纸纸上，用用吹风机机的冷风风将
23、薄膜膜吹干。五、透明明 将脱色色吹干后后的薄膜膜浸入透透明甲液液中2mmin，立立即放入入透明乙乙液中浸浸泡1mmin，取取出后立立即紧贴贴于干净净玻璃板板上，两两者间不不能有气气泡。约约23miin薄膜膜完全透透明。若若透明太太慢可用用滴管取取透明乙乙液少许许在薄膜膜表面淋淋洗一次次，垂直直放置待待其自然然干燥，或或用吹风风机冷风风吹干且且无酸味味。再将将玻璃板板放在流流动的自自来水下下冲洗，当当薄膜完完全润湿湿后用单单面刀片片撬开薄薄膜的一一角，用用手轻轻轻将透明明的薄膜膜取下，用用滤纸吸吸干所有有的水分分，最后后将薄膜膜置液体体石蜡中中浸泡33minn，再用用滤纸吸吸干液体体石蜡，压压平
24、。此此薄膜透透明，区区带着色色清晰，可可用于光光吸收计计扫描。长长期保存存不褪色色。注 意 事 项项1 醋酸纤维维素薄膜膜的预处处理市售醋酸酸纤维素素薄膜均均为干膜膜片，薄薄膜的浸浸润与选选膜是电电泳成败败的重要要关键之之一。将将干膜片片漂浮于于电极缓缓冲液表表面，其其目的是是选择膜膜片厚薄薄均匀，如如漂浮11530ss时，膜膜片吸水水不均匀匀，则有有白色斑斑点或条条纹，这这提示膜膜片厚薄薄不均匀匀，应弃弃去不用用，以免免造成电电泳后区区带扭曲曲，界限限不清，背背景脱色色困难，结结果难以以重复。由由于醋酸酸纤维素素薄膜亲亲水性比比纸小，浸浸泡300minn以上是是保证膜膜片上有有一定量量的缓冲
25、冲液，并并使其恢恢复到原原来多孔孔的网状状结构。最最好是让让漂浮于于缓冲液液的薄膜膜吸满缓缓冲液后后自然下下沉，这这样可将将膜片上上聚集的的小气泡泡赶走。点点样时，应应将膜片片表面多多余的缓缓冲液用用滤纸吸吸去，以以免缓冲冲液太多多引起样样品扩散散。但也也不能吸吸得太干干，太干干则样品品不易进进入薄膜膜的网孔孔内，而而造成电电泳起始始点参差差不齐，影影响分离离效果。吸吸干的程程度以不不干不湿湿为宜。为为防止指指纹污染染，取膜膜时，应应戴指套套或用夹夹子。2 缓冲液的的选择醋酸纤维维素薄膜膜电泳常常选用ppH8.6巴比比妥缓冲冲液，其其浓度为为0.0050.009mool/LL。选择择何种浓浓度
26、与样样品及薄薄膜的厚厚薄有关关。在选选择时，先先初步定定下某一一浓度，如如电泳槽槽电极之之间的膜膜长度为为810ccm，则则需电压压25VV/cmm膜长，电电流强度度为0.40.55mA/cm膜膜宽。当当电泳时时达不到到或超过过这个值值时，则则应增加加缓冲液液浓度或或进行稀稀释。缓缓冲液浓浓度过低低，则区区带泳动动速度快快，并由由于扩散散变宽；缓冲液液浓度过过高，则则区带泳泳动速度度慢，区区带分布布过于集集中，不不易分辨辨。3. 加样量量加样量的的多少与与电泳条条件、样样品的性性质、染染色方法法与检测测手段灵灵敏度密密切相关关。作为为一般原原则，检检测方法法越灵敏敏，加样样量越少少，对分分离更
27、有有利。如如加样量量过大，则则电泳后后区带分分离不清清楚，甚甚至互相相干扰，染染色也较较费时。如如电泳后后用洗脱脱法定量量时，每每厘米加加样线上上需加样样品0.15L，约约相当55-110000g蛋白白。血清清蛋白常常规电泳泳分离时时，每厘厘米加样样线加样样量不超超过1L，相相当于660-80g蛋白白质。但但糖蛋白白和脂蛋蛋白电泳泳时，加加样量则则应多些些。对每每种样品品加样量量应先作作预实验验加以选选择。点样好坏坏是获得得理想图图谱的重重要环节节之一，以以印章法法加样时时，动作作应轻、稳稳，用力力不能太太重，以以免将薄薄膜弄破破或印出出凹陷而而影响电电泳区带带分离效效果。4. 电量的的选择电
28、泳过程程应选择择合适的的电流强强度，一一般电流流强度为为0.440.55mA/cm膜膜宽为宜宜。电流流强度高高，则热热效应高高，尤其其在温度度较高的的环境中中，可引引起蛋白白质变性性或由于于热效应应引起缓缓冲液中中水分蒸蒸发，使使缓冲液液浓度增增加，造造成膜片片干涸。电电流过低低，则样样品泳动动速度慢慢且易扩扩散。5. 染色液液的选择择对纤维素素薄膜电电泳后应应根据样样品的特特点加以以选择。其其原则是是燃料对对被分离离样品有有较强的的着色力力，背景景易脱色色；应尽尽量采用用水溶性性染料，不不宜选择择醇溶性性染料，以以免引起起醋酸纤纤维素薄薄膜溶解解。应控制染染色时间间。时间间长，薄薄膜底色色深
29、不易易脱去；时间太太短，着着色浅不不易区分分，或造造成条带带染色不不均匀，必必要时可可进行复复染。6. 透明及及保存透明液应应临用前前配制，以以免冰乙乙酸及乙乙醇挥发发而影响响透明效效果。这这些试剂剂最好选选用分析析纯。透透明前，薄薄膜应完完全干燥燥。透明明时间应应掌握好好，如在在透明乙乙液中浸浸泡时间间太长则则薄膜溶溶解，太太短则透透明度不不佳。 透透明后的的薄膜完完全干燥燥后才能能浸入液液体石蜡蜡中，使使薄膜软软化。如如有水，则则液体石石蜡不易易浸入，薄薄膜不易易展平。思 考 题1. 名名词解释释：区带带电泳；电渗现现象；电电泳迁移移率2通过过本次实实验，讨讨论下列列问题：（1）简简述醋酸
30、酸纤维薄薄膜电泳泳原理。（2）根根据人血血清中血血清蛋白白各组分分等电点点，如何何估计它它们在ppH8.6的巴巴比妥巴比妥妥钠电极极缓冲液液中，移移动的相相对位置置。（3）醋醋酸纤维维素薄膜膜与滤纸纸相比较较，有哪哪些优点点？实验3SDSS聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳测定蛋蛋白质分分子量（4学时时）目的要求求1学习习SDSSPAGGE测定定蛋白质质分子量量的原理理。2掌握握SDSSPAGGE测定定蛋白质质分子量量的操作作方法。原 理聚丙烯酰酰胺凝胶胶是由单单体丙烯酰酰胺（aacryylammidee,简称称Acrr）和交交联剂N,NN-甲叉叉双丙烯烯酰胺（mmethhyleene-bissacrr
31、ylaamidde,简简称Biis）在在加速剂剂和催化化剂的作作用下聚聚合而成成的高分分子物质质，具有三三维网状状结构和和分子筛筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE）。由于各种种蛋白质质所带的的净电荷荷、分子子量大小小和形状状不同，在在电泳中中会产生生不同的的电荷效效应和分分子筛效效应，不不连续电电泳还有有浓缩效效应，因因而有不不同的迁迁移率。聚丙烯酰酰胺凝胶胶由于富富含酰胺胺基，故故它是稳稳定的亲亲水凝胶胶。结构构中不带带电荷，因因而在电电场中电电泳电渗渗现象极极为微小小。网状状结构能能限制蛋
32、蛋白质大大分子的的扩散运运动，具具有良好好的抗对对流作用用。在合合适浓度度范围内内还具有有较好的的透明度度，一定定的机械械强度，以以及化学学上惰性性、吸附附作用很很小等许许多优点点。十二烷基基硫酸钠钠（简称称SDSS）是阴阴离子表表面活性性剂，它它在水溶溶液中，以以单体和和分子团团的混合合形式存存在。单单体SDDS能与与蛋白质质结合生生成蛋白白质SDSS复合物物。由于于SDSS带有大大量负电电荷，所所以生成成的蛋白白质SDSS复合物物所带的的负电荷荷大大超超过了天天然蛋白白质原有有的电荷荷，因而而消除或或掩盖了了不同种种类蛋白白质所带带净电荷荷的差异异，均带带有相同同密度的的负电荷荷，。在在蛋
33、白质质溶液中中，加入入SDSS和巯基基乙醇，巯巯基乙醇醇可使蛋蛋白质分分子中的的二硫键键还原，使使多肽组组分分成成单个亚亚单位，SSDS可可使蛋白白质亚单单位中的的氢键、疏疏水键打打开，因因此SDDS与蛋蛋白质结结合后，还还引起蛋蛋白质构构象的改改变，蛋蛋白质SDSS复合物物形状近近似雪茄茄形的长长椭圆棒棒，不同同复合物物的短轴轴相同，约约1.88nm，而而长轴改改变则与与蛋白质质的分子子量成正正比。基基于上述述两种情情况，蛋蛋白质SDSS复合物物在凝胶胶电泳中中的迁移移率不再再受原有有电荷和和形状的的影响，而而只是与与椭圆棒棒的长度度有关，也也就是只只与蛋白白质分子子量有关关。在电电泳体系系
34、中加入入十二烷烷基硫酸酸钠（简简称SDDS），则则电泳迁迁移率主主要依赖赖于蛋白白质分子子量，而而与所带带的净电电荷和形形状无关关，这种种电泳方方法称为为SDSS聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳（SDDSPAGGE）。蛋白质分分子量在在10，00002000，0000之间间时，电电泳迁移移率与分子量量的对数数呈线性性关系，可用下列公式表示：上式中，为蛋白质分子量；为常数；为斜率；为相对迁移率（即蛋白质的电泳迁移距离除以示踪染料迁移距离）。根据上述述方程将将已知分分子量的的标准蛋蛋白质电电泳迁移移率与分分子量的的对数作作图，可可制作出出一条标标准曲线线。在相相同条件件下只要要测得未未知分子子量的蛋蛋白质
35、的的电泳迁迁移率，即可从从标准曲曲线求得得其近似似分子量量。不同的凝凝胶浓度度适用于于不同的的分子量量范围（见见表3-1），可可根据所所测分子子量的范范围选择择最适凝凝聚浓度度，并尽尽可能选选择分子子量范围围和性质质与待测测样品相相近的蛋蛋白质作作标准蛋蛋白。凝胶浓度度交联度分子量范范围5%2.6%25,00002000,000010%2.6%10,000070,000015%2.6%10,000050,0000表3-11 分分子量范范围与凝凝胶浓度度的关系系由于SDDSPAGGE具有有设备简简单、快快速，分分辨率和和灵敏度度高等优优点，广广泛应用用于生物物化学、分分子生物物学、基基因工程程、
36、医学学及免疫疫学等方方面。SDSPAGGE作为为一种测测定蛋白白质分子子量的方方法，尽尽管对于于大部分分蛋白质质来说，在在比较广广泛的分分子量范范围内，蛋蛋白质的的迁移率率与其分分子量的的对数确确实存在在着线性性关系，但但是有许许多蛋白白质是由由亚基或或两条以以上肽链链组成的的（如血血红蛋白白、胰凝凝乳蛋白白酶等），他他们在变变性剂和和强还原原剂的作作用下，解解离成亚亚基或单单条肽链链。因此此，对于于这一类类的蛋白白质，SSDSPAGGE测定定的只是是它们的的亚基或或单条肽肽链的分分子量，而而不是完完整蛋白白质的分分子量。为为此，对对这类样样品分子子量的测测定，还还必须采采用其他他测定方方法作
37、参参照。当当然这也也使得SSDSPAGGE特别别适用于于寡聚蛋蛋白及其其亚基的的分析鉴鉴定和分分子量的的测定。另外，还还有一些些电荷异异常和构构象特殊殊的蛋白白质（如如组蛋白白F1），含含有较大大辅基的的糖蛋白白和含有有二硫键键较多的的蛋白质质，以及及一些结结构蛋白白（如胶胶原蛋白白）等，它它们在SSDS凝胶系系统中，电电泳的迁迁移率与与分子量量的对数数不呈线线性关系系。因此此，为了了测得真真实和完完整的蛋蛋白质分分子量，通通常可采采用多种种方法进进行测定定和相互互验证。试剂与器器材一、试剂剂1. 标标准蛋白白质试剂剂盒（220次/支）：按使用用说明配配制2. 胰胰蛋白酶酶3. 连连续体系系S
38、DSSPAGGE有关关试剂1）0.2mool/LL pHH7.22磷酸盐盐缓冲液液：称 Naa2HPOO412HH2O51.58gg及NaaH2PO42H2O8.774g，溶溶于重蒸蒸水中并并定容11L。2) 样样品溶解解液（上上样液）：10ml/组0.011moll/L pH77.2磷磷酸盐缓缓冲液，内内含1%SDSS、1%巯基乙乙醇、110%甘甘油和00.022%溴酚酚蓝。用用来溶解解标准蛋蛋白质及及待测蛋蛋白质样样品。配配制方法法见表3-22：SDS巯基乙醇醇甘油溴酚蓝0.2mmol/LpHH磷酸盐盐缓冲液液加重蒸水水至最后后总体积积为100mmg0.1mml1ml2mg0.5mml10
39、mll表3-22 连连续体系系样品溶溶解液3) 凝凝胶贮液液：称Acrr30g，Biss0.88g，加重重蒸水至至1000ml，过过滤后置置棕色瓶瓶内，44贮存可可用12个月月。4) 凝凝胶缓冲冲液：66ml/组称SDSS0.22g，加00.2mmol/L ppH7.2磷酸酸盐缓冲冲液至1100mml。4贮存，用用前稍加加温使SSDS溶溶解。5) 11%TEEMEDD：取TEMMED11ml，加加重蒸水水至1000mll，置棕棕色瓶内内4贮存。6) 110%过过硫酸铵铵（APP）：11ml/组称AP110g，加加重蒸水水1000ml，置置棕色瓶瓶内4贮存。7) 电电极缓冲冲液（00.1%SDS
40、S，0.1mool/LLpH77.2磷磷酸盐缓缓冲液）：称SDSS1克，加加5000ml0.2mool/LLpH77.2磷磷酸盐缓缓冲液，再再用蒸馏馏水定容容至1LL。8) 22%琼脂脂（糖）粉粉：200ml/组称琼脂（糖糖）2g，加1100mml上述述电极缓缓冲液，4贮存。4. 固固定液：取50%甲醇4454mml，冰冰乙酸446mll混匀。5. 染染色液： 考马斯亮亮蓝R2250 0.1125gg，加上上述固定定液2550mll，过滤滤后应用用。6. 脱脱色液：冰乙酸775mll，甲醇醇50mml，加加蒸馏水水定容至至1L。二、器材材夹心式垂垂直板电电泳槽（附附带凝胶胶模133510001
41、.55mm，11台/组组），直直流稳压压电源（电电压30006000V，电电流5001000mA），移移液管（11ml2/组组，5mml1/组组，100ml2/组），烧烧杯（550mll3/组组），细细长头的的滴管11只/组组，1mml注射射器，微微量注射射器（110或550L），大大培养皿皿（12001600mm1/组组），不不锈钢药药铲1个个/组，大大烧杯（盛盛放废液液）2个个/组，洗洗瓶2个个/组（分分别盛重重蒸水、蒸蒸馏水），滤滤纸一盒盒，细铜铜丝（22小段/组），移移液管架架1个/组操作方法法一、安装装夹心式式垂直板板电泳槽槽夹心式垂垂直板电电泳槽操操作简单单，不易易渗漏。这这种电泳
42、泳槽两侧侧为有机机玻璃制制成的电电极槽，两两个电极极槽中间间夹有一一个凝胶胶模，该该模由11个凵形硅胶胶框、长长与短玻玻璃板及及样品槽槽模板（梳梳子）所所组成。电电泳槽由由上贮槽槽（白金金电极在在上或面面对短玻玻璃板），下下贮槽（白白金电极极在下或或面对长长玻璃板板）和回回纹冷凝凝管组成成。两个个电极槽槽与凝胶胶模间靠靠贮液槽槽螺丝固固定。各各部分按按下列顺顺序组装装：1） 装上贮槽槽和固定定螺丝销销钉，仰仰放在桌桌面上。2） 将长、短短玻璃板板分别插插到凵形硅胶胶框的凹凹形槽中中。注意意勿用手手接触灌灌胶面的的玻璃。3） 将已插好好玻璃板板的凝胶胶模平放放在上贮贮槽上，短短玻璃板板应面对对上
43、贮槽槽。4） 将下贮槽槽的销孔孔对准已已装好螺螺丝销钉钉的上贮贮槽，双双手以对对角线的的方式旋旋紧螺丝丝帽。5） 竖直电泳泳槽，用用细长头头滴管吸吸取已熔熔化的22%琼脂脂（糖）加加在长玻玻璃板下下端与硅硅胶框交交界的缝缝隙内，其其目的是是封住空空隙，加加琼脂（糖糖）溶液液时中应应避免有有气泡。二、配胶胶及凝胶胶板的制制备1. 配配胶根据所测测蛋白质质分子量量范围，选选择适宜宜的分离离胶浓度度。表33-3表表示配制制20mml不同同浓度分分离胶所所需各种种试剂用用量（单单位/mml）。凝胶浓度试剂5%7.5%10%凝胶贮液液30%Acrr0.88%Biis3.3335.0006.6660.2m
44、mol/LpHH7.22磷酸缓缓冲液内内含0.2%SSDS10.00010.00010.0001%TEEMEDD2.0002.0002.000重蒸馏水水4.5772.9001.13310%AAP0.1000.1000.200表3-33 220mll不同浓浓度分离离胶各试试剂用量量2. 凝凝胶板的的制备按表配制制20mml100%浓度度的胶，将将分离胶胶混合液液直接倒倒入两块块玻璃板板的缝隙隙内直至至距离短短玻璃板板上缘00.5ccm处，插插入样品品槽模板板。凝胶胶聚合约约需300minn，20030miin后，小小心拔出出梳形样样品槽模模板，用用窄条滤滤纸吸去去残余水水分，注注意不要要弄破凹凹
45、形加样样槽的底底面。倒倒入电极极缓冲液液即可准准备加样样。三、加样样加样体积积要根据据凝胶厚厚度及样样品浓度度灵活掌掌握，一一般加样样体积为为1015L。如如果样品品槽中有有气泡，可可用注射射器针头头挑除。加加样时，将将微量注注射器的的针头通通过电极极缓冲液液伸入加加样槽内内，尽量量接近底底部，轻轻轻推动动微量注注射器，注注意针头头勿碰破破凹形槽槽胶面。四、电泳泳上槽接负负极，下下槽接正正极，打打开电源源，将电电流调至至20mmA，待待样品进进入分离离胶后，将将电流调调至600mA，待待染料前前沿迁移移至距硅硅胶框底底边11.55cm处，停停止电泳泳。五、凝胶胶板剥离离电泳结束束后，取取下凝胶胶模，卸卸下硅胶胶框，用用不锈钢钢药铲撬撬开短玻玻璃板，在在凝胶板板切下一一角作为为前沿标标记。在在两侧溴溴酚蓝染染料区带带中