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1、关于提取基因组和原理第1页，讲稿共72张，创作于星期二破膜：破膜：释放出目的核酸分子释放出目的核酸分子分离：分离：通过酶、有机溶剂、调节通过酶、有机溶剂、调节pHpH值、离心等手段值、离心等手段得到粗制品得到粗制品纯化：纯化：去除杂质，纯化目的核酸。去除杂质，纯化目的核酸。三个过程：三个过程：破膜、分离、纯化破膜、分离、纯化第2页，讲稿共72张，创作于星期二ULtraPureULtraPureTMTMgDNAgDNA快速抽提试剂盒快速抽提试剂盒在高盐状态下，在高盐状态下，DNADNA纯化树脂纯化树脂ULtraPureULtraPureTMTM专一专一性地吸附性地吸附DNA;DNA;在低盐或水溶
2、液状态下在低盐或水溶液状态下,DNA,DNA被被洗脱下来洗脱下来第3页，讲稿共72张，创作于星期二二、试剂二、试剂纯化树脂（于纯化树脂（于纯化树脂（于纯化树脂（于GNGN结合液中）结合液中）结合液中）结合液中）GNGN结合液结合液结合液结合液漂洗液漂洗液离心纯化柱（空柱子）离心纯化柱（空柱子）离心纯化柱（空柱子）离心纯化柱（空柱子）无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇TETETETE缓冲液：缓冲液：缓冲液：缓冲液：Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl（pH7.6)Tris:pH7.6)Tris:pH7.6)Tris:pH7.6)Tris:三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷
3、三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷 EDTA EDTA EDTA EDTA （pH8.0)pH8.0)pH8.0)pH8.0)乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸第4页，讲稿共72张，创作于星期二三、操作过程三、操作过程1 1 1 1、混匀全血，、混匀全血，1ml1ml1ml1ml树脂中加树脂中加树脂中加树脂中加0.5ml0.5ml全血全血全血全血,颠倒混匀颠倒混匀5-65-6次。室温下温育次。室温下温育次。室温下温育次。室温下温育3 3 3 3分钟，其间颠倒混匀分钟，其间颠倒混匀分钟，其间颠倒混匀分钟，其间颠倒混匀1 1 1 1次，次，5 5，000rpm000rpm离心离心3 3
4、 3 3秒，弃上清。秒，弃上清。2 2、加入、加入、加入、加入1mlGN1mlGN1mlGN1mlGN结合液，悬浮上述树脂，颠倒混匀，结合液，悬浮上述树脂，颠倒混匀，5 5，000rpm000rpm离心离心离心离心3 3秒，弃上清。秒，弃上清。秒，弃上清。秒，弃上清。3 3、取、取、取、取0.5ml0.5ml漂洗液漂洗树脂两次漂洗液漂洗树脂两次漂洗液漂洗树脂两次漂洗液漂洗树脂两次,颠倒混匀，颠倒混匀，5 5，000rpm000rpm离心离心3 3 3 3秒，弃上清。秒，弃上清。秒，弃上清。秒，弃上清。第5页，讲稿共72张，创作于星期二如果树脂仍然呈黄色或褐色，重复如果树脂仍然呈黄色或褐色，重复
5、3 3 3 3步步1-21-2次。次。4 4 4 4、加入、加入、加入、加入0.8ml0.8ml0.8ml0.8ml无水乙醇无水乙醇,悬浮树脂悬浮树脂悬浮树脂悬浮树脂,装入离心纯化柱装入离心纯化柱,13,000rpm,13,000rpm离心离心1 1 1 1分钟分钟,倒掉乙醇倒掉乙醇,再离心再离心再离心再离心1 1分钟分钟,尽量除尽尽量除尽乙醇。乙醇。5 5 5 5、将纯化柱套入一个干净的、将纯化柱套入一个干净的1.5ml1.5ml离心管中，加离心管中，加离心管中，加离心管中，加100100100100 lTElTE于于于于纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置纯化树脂上（不能粘在管壁上），
6、室温下放置纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3 3分钟，分钟，分钟，分钟，13,000rpm13,000rpm13,000rpm13,000rpm离心离心2 2 2 2分钟。分钟。第6页，讲稿共72张，创作于星期二6 6 6 6、收集离心管中洗脱下来的、收集离心管中洗脱下来的、收集离心管中洗脱下来的、收集离心管中洗脱下来的gDNAgDNAgDNAgDNA，取，取2 l2 l电泳电泳（1%1%琼脂糖，琼脂糖，琼脂糖，琼脂糖，120V120V120V120V，20202020分钟）检测。其余分钟）检测。其余分钟）检测。其余分钟）检测。其余-20 -20
7、 -20 -20 保存备保存备用。用。注意：离心时保持平衡。注意：离心时保持平衡。注意：离心时保持平衡。注意：离心时保持平衡。7 7 7 7、紫外分光光度计测量核算的浓度及纯度。、紫外分光光度计测量核算的浓度及纯度。、紫外分光光度计测量核算的浓度及纯度。、紫外分光光度计测量核算的浓度及纯度。（测（测（测（测A260A260与与与与A280A280值）值）值）值）第7页，讲稿共72张，创作于星期二实验前注意事项实验前注意事项:1 1 1 1、所有微量离心管、所有微量离心管、所有微量离心管、所有微量离心管(eppdorf)(eppdorf)(eppdorf)(eppdorf)、枪头（、枪头（、枪头
8、（、枪头（tiptiptiptip）必）必）必）必须高压灭菌。须高压灭菌。须高压灭菌。须高压灭菌。2 2 2 2、微量移液器的使用：看清刻度、轻旋、轻放。、微量移液器的使用：看清刻度、轻旋、轻放。、微量移液器的使用：看清刻度、轻旋、轻放。、微量移液器的使用：看清刻度、轻旋、轻放。3 3 3 3、取不同的试剂、样品须更换、取不同的试剂、样品须更换、取不同的试剂、样品须更换、取不同的试剂、样品须更换tiptiptiptip。4 4 4 4、纯化树脂（于、纯化树脂（于、纯化树脂（于、纯化树脂（于GNGNGNGN结合液中）为灰褐色粉状结合液中）为灰褐色粉状结合液中）为灰褐色粉状结合液中）为灰褐色粉状物
9、质，静置时沉淀于瓶底，使用时要充分混匀。物质，静置时沉淀于瓶底，使用时要充分混匀。物质，静置时沉淀于瓶底，使用时要充分混匀。物质，静置时沉淀于瓶底，使用时要充分混匀。5 5 5 5、室温低于、室温低于、室温低于、室温低于25 25 25 25 时，纯化树脂与时，纯化树脂与时，纯化树脂与时，纯化树脂与GNGNGNGN结合液可能出结合液可能出结合液可能出结合液可能出现结晶或盐析，请务必预热，完全溶解后使用。现结晶或盐析，请务必预热，完全溶解后使用。现结晶或盐析，请务必预热，完全溶解后使用。现结晶或盐析，请务必预热，完全溶解后使用。第8页，讲稿共72张，创作于星期二QuickGene Mini80
10、与DNA全血试剂盒一、样本抽提前仪器安装准备1 正确安装好各个仪器配件，接上电源。2 把试剂盒内的废液管、收集管和带膜的套管放在仪器配件的正确位置上二、DBS试剂盒第一次使用前准备工作1 向EDB干粉中添加3.3ml无菌水，混匀室温静置30min2 向WDB缓冲液中加入160ml无水乙醇第9页，讲稿共72张，创作于星期二三、样本处理及血液基因组三、样本处理及血液基因组DNADNA纯化1.1.取一新的取一新的15ml或50ml50ml离心管，依次加入离心管，依次加入300ml EDB300ml EDB溶液、2ml2ml全血、全血、2.5ml LDB溶液2.2.上下颠倒混匀10次，2500rpm涡
11、旋震荡涡旋震荡15sec15sec3.563.56水浴5min4.加入加入2.5ml2.5ml无水乙醇5.5.上下颠倒混匀10次，2500rpm涡旋震荡涡旋震荡15sec15sec6.6.将处理过的全血倒入QuickGene-610L的带膜的套管内7.7.上机，第一次抽提选择模式上机，第一次抽提选择模式“DNA WHOLE BLOOD”DNA WHOLE BLOOD”，按“start”start”开始8.第二次抽提选择模式“INSOLUTION A”INSOLUTION A”第10页，讲稿共72张，创作于星期二四、测DNA浓度与纯度五、将抽提好的DNA 立即使用或保存于-20冰箱中，按实验室说
12、明丢弃其他管子。第11页，讲稿共72张，创作于星期二PCR原理第12页，讲稿共72张，创作于星期二PCR定义:polymerase chain reaction，聚合酶链式反应.简单的说，PCR就是利用TaqDNA聚合酶对特定基因做体外或试管内(In Vitro)的大量合成。基本上它是利用合成的TaqDNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。第13页，讲稿共72张，创作于星期二PCR的要件一、基本原理PCR技术是利用DNA聚合酶在体外条件下,催化一对引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。包括三个基本过程：第14页，讲稿共72张，创作于星期
13、二 DNA的变性(denaturation)：在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。第15页，讲稿共72张，创作于星期二第16页，讲稿共72张，创作于星期二解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)：使50%的DNA发生变性时的环境温度。DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。第17页，讲稿共72张，创作于星期二第18页，讲稿共72张，创作于星期二增色效应：增色效应：DNA变性后对变性后对260nm紫紫外光收增加的现象。外光收增加的现象。第19页，讲稿共72张，创作于星
14、期二DNA的复性（的复性（renaturation)：在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNA的两条互的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。过程。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，此过程称为此过程称为退火退火(annealing)。第20页，讲稿共72张，创作于星期二第21页，讲稿共72张，创作于星期二减色效应减色效应：变性变性DNA复性后对复性后对260nm紫外光吸收紫外光吸收减少的现象减少的现象。第22页，讲稿共72张，创作于星期二1.常用的变性方法：常用的变性方法：热变性热变性 酸碱变性酸碱变性 化学试剂变性化学试
15、剂变性 第23页，讲稿共72张，创作于星期二2.2.影响复性的因素影响复性的因素 序序序序列列列列简简简简单单单单的的的的分分分分子子子子复复复复性性性性快快快快，如如如如poly(dT)和和poly(dA)poly(dA)识识别快别快 DNADNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 离子强度离子强度离子强度离子强度有利于复性有利于复性有利于复性有利于复性 DNA浓度浓度复性复性 Tm值的估算值的估算 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)%Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺（甲酰胺%）第24页，讲稿共72张，创作
16、于星期二PCR的基本成分：1 热稳定DNADNA聚合酶：催化模板依赖的DNA合成。合成。热稳定热稳定DNADNA聚合酶的选择：主要依据合成大片段DNADNA产物需要的保真度、效率及合成能力而决定。常规常规PCRPCR，TaqDNA 聚合酶是常用酶。聚合酶是常用酶。2 2 一对引导一对引导DNA合成的寡核苷酸引物：合成的寡核苷酸引物：设计目的：获得高产率的目的扩增物，抑制非特异序列的设计目的：获得高产率的目的扩增物，抑制非特异序列的扩增。扩增。第25页，讲稿共72张，创作于星期二3 脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准PCR反应体系中包含4中等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸。4 二价阳离子：常用镁离子用于
17、激活，适当增加镁离子可减少非特异性引导。5 维持PH值的缓冲液：室温下标准缓冲液的PH值为8.38.8之间，72时反应体系的PH值下降1个多单位，PH值接近7.2。第26页，讲稿共72张，创作于星期二6 一价阳离子：标准PCR缓冲液内包含有50mmol/L KCl，适于大于500bp长度的DNA 片段。提高KCl 浓度在70100mmol/L，适于较短的DNA 片段。7 模板DNA：当使用高分子量的DNA（10kb）做模板时，如用限制性内切酶先行消化（此酶不应切割靶序列）则扩增效果更好。第27页，讲稿共72张，创作于星期二基本PCR中寡核苷酸引物的设计原则：A A 碱基组成：碱基组成：G+CG
18、+C含量应在含量应在40%和和60%60%之间，4种碱基种碱基在引物中分配均匀在引物中分配均匀没有多聚嘌呤或多聚嘧啶的序列，并且没有二核苷酸重复序列。B B 长度：引物中与模板互补的区域应该为长度：引物中与模板互补的区域应该为18251825个核苷酸长度。上下游引物的长度差别不能大于3bp3bp。C 不能有大于不能有大于3bp3bp的反向重复序列或自身互补序列存在。的反向重复序列或自身互补序列存在。这种序列可形成发夹结构，如果这种结构在这种序列可形成发夹结构，如果这种结构在PCRPCR条件条件下稳定，它会非常有效地阻止寡核苷酸和靶下稳定，它会非常有效地阻止寡核苷酸和靶DNA之间之间的复性。的复
19、性。第28页，讲稿共72张，创作于星期二D 解链温度（TmTm）：两个引物的）：两个引物的Tm值相差不能大于5 5，扩增产物的，扩增产物的TmTm值与引物的TmTm值相差不能大于值相差不能大于1010。保证扩增产物在每个保证扩增产物在每个PCR循环可有效变性。循环可有效变性。E 3E 3末端：末端：33末端碱基最好是G或C C，但不应是，但不应是NNCGNNCG或或NNGCNNGC。因为末端GC含量高可促进发夹结构的形成，还含量高可促进发夹结构的形成，还可能产生引物二聚体。可能产生引物二聚体。F F 上下游引物的互补性：一个引物的上下游引物的互补性：一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物的
20、任何位点上，避免引物二聚体的形成和扩增。第29页，讲稿共72张，创作于星期二PCR温度条件的设计：1 模板的热变性温度和时间：双链DNA模板的变性温度由其G+C含量决定。DNA分子越长，两条链完全分开所需的时间也越长。应用Taq DNA聚合酶时，变性一般在9495下，这是Taq DNA聚合酶进行30或以上PCR循环而活力不致受到过多损失所能耐受的极限温度。第30页，讲稿共72张，创作于星期二2 引物和模板DNA的复性：复性温度过高，寡核苷酸引物不能与模板很好复性，扩增效率降低；复性温度太低，非特异性DNA片段扩增增加。3 寡核苷酸引物的延伸：常在热稳定DNA聚合酶的催化DNA合成的最适温度下进
21、行。对Taq DNA聚合酶来说最适温度是7278。第31页，讲稿共72张，创作于星期二PCRPCR反应特点反应特点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高简便、快速简便、快速对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低第32页，讲稿共72张，创作于星期二特异性强特异性强关键：引物与模板的正确结合关键：引物与模板的正确结合引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的配对原则的合成反应的忠实性及合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性
22、大大增加，被扩增的靶温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高第33页，讲稿共72张，创作于星期二PCRPCR反应的特异性决定因素反应的特异性决定因素引物与模板引物与模板DNA特异正确的结合；特异正确的结合；碱基配对原则；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性靶基因的特异性与保守性第34页，讲稿共72张，创作于星期二灵敏度高灵敏度高PCR 产物的生成量是以指数
23、方式增加的，能产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板量级的起始待测模板扩增到微克扩增到微克(ug=10-6)水平水平从从 100 万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞在病毒的检测中，在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达的灵敏度可达 3 个个RFU(空斑形成单位空斑形成单位)在细菌学中最小检出率为在细菌学中最小检出率为3个细菌个细菌第35页，讲稿共72张，创作于星期二简便、快速简便、快速PCR反应用耐高温的反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一次聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在性地将反应液加好后，即在DNA 扩增液和水扩增液和水浴锅
24、上进行变性浴锅上进行变性-退火退火-延伸反应，一般在延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广推广第36页，讲稿共72张，创作于星期二对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低不需分离病毒或细菌及培养细胞，不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板均可作为扩增模板可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩扩增检测增检测第37页，
25、讲稿共72张，创作于星期二q热启动PCRqTouch-down PCRqRT-PCRq兼并引物PCRq巢氏PCRq反向PCRq不对称PCRq原位PCRq连接酶链反应qRACE-PCRqAFLPq免疫-PCR(immuno-PCR)qMSP甲基化特异PCR第38页，讲稿共72张，创作于星期二1 1 1 1）不对称）不对称）不对称）不对称PCRPCRPCRPCR 目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链DNADNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物物和非限制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.010
26、.5M,0.010.5M,关键关键是限制性引物的绝对量。是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组基因组DNADNA结构功能的研究结构功能的研究 PCRPCR的类型第39页，讲稿共72张，创作于星期二 高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物第40页，讲稿共72张，创作于星期二2)2)2)2)反向反向反向反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片段，对某片段，对某个已知个已知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。
27、片段两侧的未知序列进行扩增。未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列第41页，讲稿共72张，创作于星期二已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶第42页，讲稿共72张，创作于星期二3 3 3 3）多重）多重）多重）多重PCRPCRPCRPCR（复合（复合（复合（复合PCRPCRPCRPCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。第43页，讲稿共72张，创作于星期二电电泳泳引物引物12341234第44页，讲稿共72张，创作于星期二4 4 4 4）LP-PCRLP-PCRLP-PCRLP-P
28、CR（Labelled primers)Labelled primers)Labelled primers)Labelled primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标记利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分第45页，讲稿共72张，创作于星期二标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物第46页，讲稿共72张，创作于星期二5 5 5 5）锚定）锚定PCRPCRPCRPCR（anchored PCR,A-PCRanchored
29、PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCR）锚定锚定PCRPCR首先合成第一链首先合成第一链cDNA,cDNA,然后再添加一同聚物然后再添加一同聚物尾（尾（polydG),polydG),与同聚物尾配对的与同聚物尾配对的33锚定引物（带有限制性锚定引物（带有限制性内切位点内切位点polydC)polydC)一起作一起作PCRPCR扩增扩增第47页，讲稿共72张，创作于星期二cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG5CCCC CCCC 锚定引物锚定引物锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG55CCCCCCCC3GGGG3GGG
30、GCCCCCCCC第48页，讲稿共72张，创作于星期二6 6 6 6）PCRPCR固相分析法固相分析法固相分析法固相分析法模板生物素生物素化引物化引物PCRPCR扩增扩增探针亲和固相介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作第49页，讲稿共72张，创作于星期二7 7 7 7）原位）原位）原位）原位 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsIn Still PCR,IsPCRPCR）是由）是由HaaseHaase等于等于19901990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片
31、段的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提在不破坏细胞的前提下下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。量较少的靶序列。第50页，讲稿共72张，创作于星期二操作步骤操作步骤1.1.细细胞胞或或组组织织固固定定：细细胞胞经经固固定定和和乙乙醇醇通通透透化化处处理理后后便便适适于于一般一般PCRPCR试剂（包括引物和试剂（包括引物和TaqTaq
32、酶）进入酶）进入2.PCR2.PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段3.3.原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达第51页，讲稿共72张，创作于星期二8 8）逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCRPCR扩增扩增第52页，讲稿共72张，创作于星期二9)9)荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCRPCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对对PCRPCR产产物进行标物进行标 记跟踪记跟踪,实时在线监控反应过程实
33、时在线监控反应过程,结合相应的结合相应的软件可以对结果进行分析软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。计算待测样品的初始模板量。内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)Amplifluor(Intergen)第53页，讲稿共72张，创作于星期二5353SGSGSGSGSGExcitationEmiss
34、ionSYBR-Green I 第54页，讲稿共72张，创作于星期二 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪梯度梯度PCR仪仪普通普通PCR仪仪第55页，讲稿共72张，创作于星期二PCR的运用PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常(Gene mutation,deletion,and rearrangement)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估；对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取(DNA sequencing)及其它的运用。第56页，
35、讲稿共72张，创作于星期二举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。也可以做DNADNA指纹(Fingerprints)比对帮助亲子关系的鉴定。比对帮助亲子关系的鉴定。PCRPCR更可以用于器官移植组织兼容性更可以用于器官移植组织兼容性HLA的分析。另外在的分析。另外在演化上的分析，经由演化上的分析，经由PCRPCR的运用也产生重大的进展。近来，在生物医学的研究上，特别是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质(Interleukines)及各种生长因子(Growth factors)(Growth factors)基因的表现都可用PCR来进行质与来进行质与量
36、的分析。量的分析。第57页，讲稿共72张，创作于星期二凝胶电泳依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可被分成两个亚类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。相比之下，琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。一般，琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.250kb范围内的DNA片段。第58页，讲稿共72张，创作于星期二琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳一、基本原理一、基本原理一、基本原理一、基本原理：核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中（冲液
37、中（冲液中（冲液中（pH8.0-8.3)pH8.0-8.3)，其碱基不解离，而磷酸全部解，其碱基不解离，而磷酸全部解，其碱基不解离，而磷酸全部解，其碱基不解离，而磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同大小和构离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同大小和构离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同大小和构离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同大小和构象的核酸分子所带电荷量大致相同。在自由泳动时难象的核酸分子所带电荷量大致相同。在自由泳动时难以分开，采用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分以分开，采用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分以分开，采用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分以分开，采用琼
38、脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子的迁子筛功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子的迁子筛功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子的迁子筛功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离目的。移率出现较大差异，从而达到分离目的。移率出现较大差异，从而达到分离目的。移率出现较大差异，从而达到分离目的。第59页，讲稿共72张，创作于星期二二、主要试剂二、主要试剂琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖6X6X上样缓冲液（上样缓冲液（上样缓冲液（上样缓冲液（loading bufferloading bufferloading bufferloading
39、buffer）10mg/ml10mg/ml溴已锭溴已锭溴已锭溴已锭(EB)(EB)(EB)(EB)1010倍浓缩的倍浓缩的倍浓缩的倍浓缩的TBETBETBETBE电泳缓冲液配方如下电泳缓冲液配方如下电泳缓冲液配方如下电泳缓冲液配方如下:Tris Tris108 g108 g108 g108 g EDTA EDTA EDTA EDTA 9.3 g9.3 g9.3 g9.3 g 硼酸硼酸55 g55 g55 g55 g用蒸馏水定容至用蒸馏水定容至用蒸馏水定容至用蒸馏水定容至1 000 mL1 000 mL，调节，调节，调节，调节pHpH为为8.08.08.28.28.28.2备备备备用，使用时需稀
40、释用，使用时需稀释1010倍倍 第60页，讲稿共72张，创作于星期二表表1-11-1琼脂糖凝胶浓度与分离琼脂糖凝胶浓度与分离DNADNA分分子大小的范围子大小的范围琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度(%)(%)(%)(%)线型线型线型线型DNADNADNADNA分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围(千碱千碱千碱千碱基对，基对，基对，基对，kb)kb)kb)kb)0.30.30.30.35 5 5 5606060600.60.60.60.61 1 1 1202020200.70.70.70.70.80.80.80.8101010100.90.90.90.
41、90.50.50.50.57 7 7 71.21.21.21.20.90.90.90.96 6 6 61.51.51.51.50.20.20.20.24 4 4 42.02.02.02.00.10.10.10.13 3 3 3第61页，讲稿共72张，创作于星期二电泳缓冲液电泳缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、是电泳场中的导体，它的种类、pHpH值及离子强值及离子强度直接影响电泳的效率。常用的有度直接影响电泳的效率。常用的有度直接影响电泳的效率。常用的有度直接影响电泳的效率。常用的有Tris-Tris-Tris-Tris-醋酸醋酸（TAETAETAETAE）、）、）、）、Tris-Tris-硼酸
42、（硼酸（TBETBE）Tris-Tris-磷酸磷酸磷酸磷酸（TPETPE）。）。）。）。第62页，讲稿共72张，创作于星期二6X6X上样缓冲液（上样缓冲液（Loading bufferLoading buffer）组成：组成：组成：组成：0.25%0.25%0.25%0.25%溴酚蓝、溴酚蓝、溴酚蓝、溴酚蓝、0.25%0.25%二甲苯青、二甲苯青、40%40%蔗糖蔗糖作用：作用：作用：作用：能够增加样品密度，确保能够增加样品密度，确保DNADNADNADNA均匀沉入加均匀沉入加均匀沉入加均匀沉入加样孔内；能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色和蓝样孔内；能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色和蓝色指示带，
43、从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；色指示带，从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；色指示带，从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；色指示带，从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。第63页，讲稿共72张，创作于星期二溴化乙锭溴化乙锭（EBEB）（染色剂）（染色剂）核酸电泳后，需要染色才能在紫外线下观察到带核酸电泳后，需要染色才能在紫外线下观察到带型。型。溴化乙锭溴化乙锭溴化乙锭溴化乙锭(EB)(EB)是一种荧光染料，有剧毒，因是一种荧光染料，有剧毒，
44、因是一种荧光染料，有剧毒，因是一种荧光染料，有剧毒，因此操作时要非常小心。此操作时要非常小心。此操作时要非常小心。此操作时要非常小心。EBEBEBEB可嵌入可嵌入可嵌入可嵌入DNADNADNADNA双链的碱基之双链的碱基之间，在紫外线激发下能发出橙红色荧光，见光易间，在紫外线激发下能发出橙红色荧光，见光易分解分解分解分解,棕色瓶保存于棕色瓶保存于棕色瓶保存于棕色瓶保存于4,4,使用终浓度使用终浓度0.5g/mL0.5g/mL。第64页，讲稿共72张，创作于星期二三、操作步骤1 1 1 1、选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，、选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，、选择合适的
45、水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，、选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。检查稳压电源与正负极的线路。检查稳压电源与正负极的线路。检查稳压电源与正负极的线路。2 2、用透明胶带纸将、用透明胶带纸将tanktanktanktank两端封好，选择孔径大小适合两端封好，选择孔径大小适合的梳板，垂直架于的梳板，垂直架于tanktanktanktank的一端。的一端。3 3 3 3、制备琼脂糖凝胶，称取适量琼脂糖，溶解在、制备琼脂糖凝胶，称取适量琼脂糖，溶解在0.5XTBE0.5XTBE0.5XTBE0.5XTBE中中中中,置微波炉中加热置微波炉中加热置微波炉中加热
46、置微波炉中加热,均匀溶解琼脂糖。均匀溶解琼脂糖。第65页，讲稿共72张，创作于星期二4 4、加入、加入、加入、加入EBEB（0.5g/mL0.5g/mL），摇匀，待凝胶冷却至），摇匀，待凝胶冷却至50 50 50 50 左左左左右，倒入右，倒入右，倒入右，倒入tanktank中，室温下冷却凝固。避灭产生气泡。中，室温下冷却凝固。避灭产生气泡。5 5 5 5、撕去两端的透明胶带纸，将、撕去两端的透明胶带纸，将tanktank和凝胶一起放入电泳和凝胶一起放入电泳槽内。在电泳槽内加入槽内。在电泳槽内加入0.5XTBE0.5XTBE，使缓冲液盖过胶面，小，使缓冲液盖过胶面，小，使缓冲液盖过胶面，小，使
47、缓冲液盖过胶面，小心取出梳板，保持点样孔的完好。心取出梳板，保持点样孔的完好。心取出梳板，保持点样孔的完好。心取出梳板，保持点样孔的完好。第66页，讲稿共72张，创作于星期二6 6、待测的、待测的DNADNADNADNA样品与样品与样品与样品与1/51/51/51/5体积的上样缓冲液混匀后点样，体积的上样缓冲液混匀后点样，记录上样次序及点样量，在样品的左侧点样孔加入分记录上样次序及点样量，在样品的左侧点样孔加入分子量标准。子量标准。7 7 7 7、打开电源开关，选择适当电压（不超过、打开电源开关，选择适当电压（不超过、打开电源开关，选择适当电压（不超过、打开电源开关，选择适当电压（不超过5V/
48、cm5V/cm5V/cm5V/cm。8 8、电泳至所需位置，停止电泳。、电泳至所需位置，停止电泳。、电泳至所需位置，停止电泳。、电泳至所需位置，停止电泳。9 9 9 9、取出凝胶到紫外投射仪或凝胶成像系统观察或照相。、取出凝胶到紫外投射仪或凝胶成像系统观察或照相。、取出凝胶到紫外投射仪或凝胶成像系统观察或照相。、取出凝胶到紫外投射仪或凝胶成像系统观察或照相。第67页，讲稿共72张，创作于星期二 注意事项A 使吸管与加样孔垂直，使吸管尖端刚好在加样孔开口之下，缓慢将DNADNA样品加入加样孔中。B 加加样样完完毕毕后后，正正确确连连接接电电泳泳槽槽和和电电源源（黑黑的的连连阴阴极极，红红的的连连
49、阳阳极极）。将将胶胶床床放放在在电电泳泳槽槽内内，加加样样孔孔一一侧侧靠靠近近阴阴极极（黑黑末末端端），注注入入适适量量的的TBETBE缓缓冲冲液液，通通常常缓缓冲冲液液高高于于胶胶面面1cm，加加溴溴化化乙乙锭锭（EBEB）至至TBETBE缓缓冲冲液液中中并并使使之之混混匀匀（EBEB的的终终浓浓度度是是1g/mL1g/mL）。EBEB也也可可加加到到胶胶中中，即即将将琼琼脂脂糖糖在在微微波波炉炉中中加加热热，然然后后冷冷却至却至50，再加入EB。第68页，讲稿共72张，创作于星期二C 通过检查加样孔附近黑末端的铂线来检测线柱是否连接良好。若连接良好，负极附近的铂丝会有气泡产生。D 电泳过程
50、要进行一个合适的时间。电泳时间的选取取决于胶的长度和电压大小。胶越长，电压越低，所需时间越长。然而使用高压时，大的DNA片段的分辨率很低。第69页，讲稿共72张，创作于星期二聚丙烯酰胺凝胶电泳一 原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂N,N-亚甲双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵或核黄素作用下聚合交联而成的三维网状结构凝胶.聚合反应需要有催化剂参加,催化剂包括引发剂和加速剂.引发剂:硫酸铵或核黄素.加速剂:N,N,N,N-四甲基乙二胺.第70页，讲稿共72张，创作于星期二常用的聚丙烯酰胺凝胶:1 非变性聚丙烯酰胺凝胶:用于分离和纯化双链DNA片段.无法确定双链DNA大小.2 变性聚丙烯酰胺凝胶: