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1、实验大大肠杆菌的培养与分离杆菌的培养与分离第一页，讲稿共四十三页哦实验目的实验目的:1.进行进行大肠杆菌的扩增大肠杆菌的扩增，利用，利用液体培养基液体培养基进进行细菌培养的操作行细菌培养的操作2.进行进行大肠杆菌的分离大肠杆菌的分离,用用固体平板培养基进固体平板培养基进行细菌的划线培养行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理理第二页，讲稿共四十三页哦特点：特点：结构都相当结构都相当简单简单,个体多数十分个体多数十分微小微小.通常要用光学显通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结
2、构.且体内且体内一般不含有叶绿素一般不含有叶绿素.不能进行光合作用不能进行光合作用.微生物包括哪五类：微生物包括哪五类：病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌原生动物原生动物 原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界一、基础知识：一、基础知识：(一一)微生物微生物：是一切肉眼看不见或看不清楚的：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称微小生物的总称第三页，讲稿共四十三页哦(二二)细菌细菌1、结构、结构2、分裂、分裂3、生殖、生殖4、变异类型、变异类型5、在基因工程中的应用、在基因工程中的应用第四页，讲稿共四十三页哦细菌的类型细菌的类型图图1-1常见的三种细菌典型形态常
3、见的三种细菌典型形态A.球菌球菌B.杆菌杆菌C.弧菌弧菌第五页，讲稿共四十三页哦大肠杆菌属于杆状菌大肠杆菌属于杆状菌第六页，讲稿共四十三页哦n根据细菌所利用的根据细菌所利用的能源和碳源能源和碳源的不同的不同将细菌分为两大营养类型。将细菌分为两大营养类型。n自养菌自养菌:n异养菌异养菌:腐生菌腐生菌寄生菌寄生菌 大部分病原菌大部分病原菌细菌的营养类型细菌的营养类型 光能自养型光能自养型:光合细菌光合细菌化能自养型化能自养型:硝化细菌硝化细菌,铁细菌铁细菌,硫细菌硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌第七页，讲稿共四十三页哦细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色 革兰氏染色法是一种用
4、于细菌的染色革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不差别在于细胞壁的成分不同同。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌大肠杆菌属于革兰氏阴性菌第八页，讲稿共四十三页哦-培养基培养基1.定义定义培养基（培养液）是培养基（培养液）是由人工方法配制而由人工方法配制而成的，专供微
5、生物生长繁殖使用的混合营成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养养液。液。(三三)细菌的培养细菌的培养 2.2.培养基的五大营养成分：培养基的五大营养成分：水水、无机盐无机盐、碳碳源源、氮源氮源、生长因子生长因子等营养物质，另外还等营养物质，另外还需要满足微生物生长对需要满足微生物生长对pH pH、氧气氧气、渗透渗透压压的要求的要求第九页，讲稿共四十三页哦不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方：不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方：细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌的配方：大肠杆菌的配方：酵母提取物酵母提取物0.5g蛋白胨蛋白胨0.5gNacl0.5g琼脂琼脂1g水水50ml第十
6、页，讲稿共四十三页哦3.3.培养基的类型培养基的类型按物理状态分：固体培养基按物理状态分：固体培养基和和液体培养基液体培养基。成分区别：是否加琼脂成分区别：是否加琼脂按功能分：选择培养基按功能分：选择培养基和和鉴别培养基鉴别培养基按成分分：天然培养基按成分分：天然培养基和和合成培养基合成培养基液体培养基：扩增细菌、工业生产液体培养基：扩增细菌、工业生产固体培养基：纯化（分离），鉴定、保藏菌种固体培养基：纯化（分离），鉴定、保藏菌种第十一页，讲稿共四十三页哦选择培养基选择培养基:从微生物群中选择具有特定表型从微生物群中选择具有特定表型的细胞的细胞.使之进行繁殖所用的培养基使之进行繁殖所用的培养基
7、,称为选择培称为选择培养基养基.加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物分离自养型微生物 第十二页，讲稿共四十三页哦n单个或少数细菌在单个或少数细菌在固体培养基固体培养基上大量繁殖时，上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的构的子细胞群体子细胞群体，叫做菌落，叫做菌落。n菌落是菌落是鉴定菌
8、种鉴定菌种的重要依据。的重要依据。4、菌落菌落第十三页，讲稿共四十三页哦二、二、无菌技术无菌技术1.1.无菌技术的概念无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。所有防止杂菌污染的方法。成功地培养微生物的关键。成功地培养微生物的关键。第十五页，讲稿共四十三页哦（）（）消毒定义：消毒定义：2.2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别（2 2）灭菌的定义：）灭菌的定义：是指杀灭病原微生物的方法。是指杀灭病原微生物的方法。是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽孢芽孢、孢子孢子）的方法
9、的方法第十六页，讲稿共四十三页哦a.煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6minb.b.巴氏消毒法：巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15minc.c.化学药剂消毒法化学药剂消毒法:用用75%75%酒精进行皮肤消毒酒精进行皮肤消毒;氯气消氯气消毒水源；高锰酸钾溶液；次氯酸钠溶液等毒水源；高锰酸钾溶液；次氯酸钠溶液等（3）常用消毒的方法：）常用消毒的方法：第十七页，讲稿共四十三页哦a a、灼烧灭菌、灼烧灭菌常用灭菌的方法：常用灭菌的方法：第十八页，讲稿共四十三页哦b b、干热灭菌：、干热灭菌：160-170
10、160-170 下加热下加热1-1-2h2h。c c、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下维下维持持15min.15min.第十九页，讲稿共四十三页哦1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和
11、吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。1第二十页，讲稿共四十三页哦二、大肠杆菌的培养和分离实验操作二、大肠杆菌的培养和分离实验操作（一）培养基的配置与灭菌（一）培养基的配置与灭菌取取2个个250ml的三角瓶中分别装入的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌纸包装后高压锅灭菌
12、15min。LB液体培养基液体培养基细菌的扩大培养细菌的扩大培养LB固体培养基固体培养基细菌的划线分离细菌的划线分离封口膜：既通气又不使杂菌进入第二十一页，讲稿共四十三页哦（二）倒平板（二）倒平板灭菌后的培养基在灭菌后的培养基在无菌超净台无菌超净台上倒入上倒入4个培养皿中，倒后立即置个培养皿中，倒后立即置于于水平水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。平面。第二十二页，讲稿共四十三页哦注意事项：注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到60左右左右时，才能用来倒平板时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒
13、：无菌超净台用灭菌及消毒：无菌超净台用紫外灯和过滤风紫外灯和过滤风灭菌；桌面及灭菌；桌面及人手用人手用酒精棉球酒精棉球消毒消毒3.操作时右手无名指和小指操作时右手无名指和小指夹住封口膜夹住封口膜,另外三指持三角瓶另外三指持三角瓶,左左手拿培养皿并打开上盖的一边手拿培养皿并打开上盖的一边,在在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁操作操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板冷凝后，要将平板倒置平板倒置,既可以使培养基表面的水分既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造
14、成污染成污染.第二十三页，讲稿共四十三页哦（三）大肠杆菌的扩大培养（三）大肠杆菌的扩大培养将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培灭菌后的液体培养基养基中中,使其在使其在37摇床上振荡培养摇床上振荡培养12小时。小时。注意事项注意事项:1.火焰旁火焰旁从斜面上用接种环取菌从斜面上用接种环取菌;2.取菌前取菌前接种环要接种环要用酒精灯用酒精灯灼烧灼烧灭菌灭菌,冷却后方能取菌冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原取菌后封口膜和棉塞复原.第二十四页，讲稿共四十三页哦1、划线分离法、划线分离法在无菌操作台上用接种环取菌种后在在无菌操作台上用接种环取菌种后在固体
15、培养基的平板上连续划线固体培养基的平板上连续划线.（四四）大肠杆菌的分离）大肠杆菌的分离第二十五页，讲稿共四十三页哦第二十六页，讲稿共四十三页哦不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。第二十七页，讲稿共四十三页哦一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。第二十八页，讲稿共四十三页哦第二十九页，讲稿共四十三页哦注意事项注意事项:1.接种环接种环只蘸一次菌
16、液只蘸一次菌液,但要在培养基的不但要在培养基的不同位置同位置连续划线多次连续划线多次。每次划线前接种环。每次划线前接种环都要灼烧灭菌。都要灼烧灭菌。2.划线划线首尾不能相接。首尾不能相接。3.划线后划线后,培养皿培养皿倒置培养倒置培养1224h第三十页，讲稿共四十三页哦分离后分离后,一个菌一个菌体便会形成一个体便会形成一个菌落菌落,这是这是消除消除污染杂菌的通污染杂菌的通用方法用方法,也是用也是用于于筛选高表达量筛选高表达量菌株菌株的最简便方的最简便方法之一。法之一。第三十一页，讲稿共四十三页哦 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种
17、环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接每次划线前灼烧接种环是为了种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。每次
18、划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第三十二页，讲稿共四十三页哦 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？是从上一次划线的末端开始划线？答：答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起划
19、线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第三十三页，讲稿共四十三页哦（五五）大肠杆菌分离后保存）大肠杆菌分离后保存1 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：甘油冷冻管藏法、长期保存：甘油冷冻管藏法第三十四页，讲稿共四十三页哦2、涂布分离法、涂布分离法:是指将培养的菌液稀
20、释一定的倍数是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释然后取一定量稀释液加在固体培养基上液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.第三十五页，讲稿共四十三页哦第三十六页，讲稿共四十三页哦划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。单菌落更易分开，但操作复杂。第三十七页，讲稿共四十三页哦1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?(1)(1)胆大心细，操作快捷。（胆大心细，操作快捷。
21、（2 2）注意灭菌操作原则，）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（灭菌彻底，降低环境污染概率。（3 3）注意微生物生）注意微生物生长条件，如长条件，如PHPH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜质，喜3737度；霉菌喜酸，喜糖，喜度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-3025-30度度第三十八页，讲稿共四十三页哦2.在培养后如何判断是否有杂菌污染在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）
22、显微镜观察其形态、大小显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法革兰氏染色法等。等。第三十九页，讲稿共四十三页哦3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气
23、凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。再分成单菌落，达不到分离目的。第四十页，讲稿共四十三页哦4.实验完成后实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃高压灭菌后再抛弃第四十一页，讲稿
24、共四十三页哦5.如果分离的是转基因的大肠杆菌如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通如何保证不被普通的大肠杆菌所污染的大肠杆菌所污染?转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的造的，通常加入了抗性基因的DNADNA序列，所以可序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。第四十二页，讲稿共四十三页哦【课堂练习课堂练习】例例1 1关微生物营养物质的叙述中，正确的是（关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A.A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量 C.C.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量D第四十三页，讲稿共四十三页哦