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1、关于植物基因克隆的工具酶第1页，讲稿共74张，创作于星期二基因工程中的工具酶：基因工程中的工具酶：应用于基因工程的各种应用于基因工程的各种酶的总称酶的总称，包括，包括核酸核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取、重组因选取、重组DNADNA制备制备等过程中所需要的酶。等过程中所需要的酶。第2页，讲稿共74张，创作于星期二第3页，讲稿共74张，创作于星期二一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别是一类能够识别双链双链DNA分子中的分子中的特定特定核苷酸序列核苷酸序列（4-8bp），并在识
2、别序列内或），并在识别序列内或附近特异附近特异切割双链切割双链DNA的核酸的核酸内切酶内切酶。限。限制酶天然存在于细菌体内。制酶天然存在于细菌体内。（Restriction endonuclease）第4页，讲稿共74张，创作于星期二（一）寄主控制的限制与修饰现象（一）寄主控制的限制与修饰现象（R/M体系）体系）任何物种都有排除异物保护自身的防御机制，如人的免疫任何物种都有排除异物保护自身的防御机制，如人的免疫系统和细菌的限制与修饰系统，即系统和细菌的限制与修饰系统，即限制酶与修饰酶限制酶与修饰酶组成组成的系统。的系统。早在早在20世纪世纪50年代初，有许多学者发现了限制与修年代初，有许多学者
3、发现了限制与修饰现象，当时被称作饰现象，当时被称作寄主控制的专一性寄主控制的专一性。噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率不同宿主中的转染频率可说明这一问题。可说明这一问题。第5页，讲稿共74张，创作于星期二这说明这说明K菌株和菌株和B菌株中存在一种限制系统，可排除菌株中存在一种限制系统，可排除外来的外来的DNA。10-4的存活率是由于宿主修饰系统作用的结果，此时限的存活率是由于宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。制系统还未起作用。第6页，讲稿共74张，创作于星期二宿主控制限制（宿主控制限制（host-control
4、ledrestriction）：菌体在某一株细菌的生长能力在转移到另一株细菌菌体在某一株细菌的生长能力在转移到另一株细菌宿主时，要受到一定限制。宿主时，要受到一定限制。实际就是限制酶降解外源实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的，维护宿主遗传稳定的保护机制。保护机制。第7页，讲稿共74张，创作于星期二宿主控制修饰（宿主控制修饰（host-controlled modification）：用作繁殖噬菌体的用作繁殖噬菌体的感染宿主感染宿主并不会产生并不会产生DNADNA降解，这是因降解，这是因为它具有宿主控制性修饰的作用。为它具有宿主控制性修饰的作用。甲基化甲基化是常见的修饰作用，通过甲
5、基化作用达到识别自是常见的修饰作用，通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。身遗传物质和外来遗传物质的目的。如如 A A：N6-N6-甲基腺嘌呤；甲基腺嘌呤；C C：5-5-甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶第8页，讲稿共74张，创作于星期二第9页，讲稿共74张，创作于星期二第10页，讲稿共74张，创作于星期二（二）限制酶的发现（二）限制酶的发现20世纪世纪60年代，人们就注意到年代，人们就注意到DNA在感染宿主后会被降解的现象，在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。从而提出限制性切酶和限制酶的概念。1968年，首次从年，首次从E.coli K中中分离到限制酶；分离到
6、限制酶；1970年，美国年，美国H.Smith偶然发现，流感嗜血杆菌能迅速降解外源的噬菌偶然发现，流感嗜血杆菌能迅速降解外源的噬菌体体DNA，其细胞提取液可降解，其细胞提取液可降解E.coli DNA，但不能降解自身，但不能降解自身DNA，从而找到从而找到Hind限制性内切酶限制性内切酶。从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。EcoR是应用最是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：5GAATTC33CTTAAG5第11页，讲稿共74张，创作于星期二据统计
7、：据统计：n1986年：年：615种限制酶，种限制酶，98种甲基化酶种甲基化酶n1998年：年：1000种细菌或古细菌中存在种细菌或古细菌中存在3000多种酶，且多种酶，且200多种特异性。多种特异性。n2006年：年：4583种酶，其中限制酶种酶，其中限制酶3773种，种，第12页，讲稿共74张，创作于星期二命名原则：命名原则：第一个字母（大写第一个字母（大写,斜体）：斜体）：该酶来源的微生物属名；该酶来源的微生物属名；第二、第三个字母（小写、斜体）：第二、第三个字母（小写、斜体）：微生物的种名；微生物的种名；若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的若该微生物有不同的变种和品系，再
8、加上该变种和品系的第一个字母第一个字母（大写）（大写）若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗罗马字母表示马字母表示。总之：限制酶由三部分构成（菌种名、菌系编号、分离顺序）总之：限制酶由三部分构成（菌种名、菌系编号、分离顺序）（三）限制性内切酶的命名（三）限制性内切酶的命名1973年年Smith和和Nathans提出有关限制酶命名规则的建议提出有关限制酶命名规则的建议第13页，讲稿共74张，创作于星期二n例如：例如：Hind前三个字母来自于菌种名称前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“”表示
9、菌系为型血清型；表示菌系为型血清型；“”表示表示分离到的第三个限制酶。分离到的第三个限制酶。nEcoRIEscherichia coliRInHindHaemophilusinfluensae dnSacI(II)Streptomycesachromagenes I()（三）限制性内切酶的命名（三）限制性内切酶的命名第14页，讲稿共74张，创作于星期二举举 例例EcoR IEscherichia属名属名Coli种类种类Ry13株系株系编号编号 若若种种名名头头2 2个个字字母母相相同同则则其其中中一一个个可可用用种种名名的的第第一一和和第第三三个个字字母。母。第15页，讲稿共74张，创作于星期
10、二 限制酶的生物学功能一般是限制酶的生物学功能一般是保护宿主不受外来保护宿主不受外来DNA的感染的感染，可降解外来的可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。，从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与一般来说，与限制酶伴生的修饰酶是甲基转移酶限制酶伴生的修饰酶是甲基转移酶，能保，能保护自身的护自身的DNA不被降解。它们与对应的限制酶识别相同的不被降解。它们与对应的限制酶识别相同的序列，但其作用不是切割序列，但其作用不是切割DNA，而是在两条链上对某个，而是在两条链上对某个碱基进行甲基化。限制酶和甲基转移组成限制和修饰系碱基进行甲基化。限制酶和甲基转移组成限制和修饰系统。统。（四）限制
11、性内切酶的种类（四）限制性内切酶的种类第16页，讲稿共74张，创作于星期二I：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子双链，但它随机切割核苷酸的顺序，无专一性。分子双链，但它随机切割核苷酸的顺序，无专一性。：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置固定位置上切割双上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，这种限制性这种限制性内切酶是内切酶是DNA重组技术中常用的工具酶。重组技术中常用的工具酶。：也有专
12、一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸不是旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸不是特异性的。这种限制性内切酶切割后产生的一定长度特异性的。这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，片段，具有各种单链末端。具有各种单链末端。（四）限制性内切酶的种类（四）限制性内切酶的种类第17页，讲稿共74张，创作于星期二性质性质酶酶酶酶酶酶结构与功能结构与功能三亚基多功能酶三亚基多功能酶单一功能的酶单一功能的酶二亚基双功能的酶二亚基双功能的酶限制与修饰限制与修饰酶蛋白酶蛋白同时
13、同时具有甲基具有甲基化作用化作用酶蛋白酶蛋白不不具有甲基化具有甲基化作用作用酶蛋白酶蛋白同时同时具有甲具有甲基化作用基化作用限制作用的辅限制作用的辅助因子助因子ATP,MgATP,Mg2+2+,SAM,SAMMgMg2+2+ATP,MgATP,Mg2+2+,SAM,SAM寄主特异性位寄主特异性位点序列点序列特异性特异性,非对称非对称序列序列特异性特异性,旋转对称旋转对称序列序列特异性特异性,非对称非对称序列序列切割位点切割位点在距寄主特异性位点在距寄主特异性位点至少至少1kb1kb的地方的地方位于寄主位于寄主特异性位点特异性位点或或其附近其附近在距寄主在距寄主特异性位特异性位点点3 3端端24
14、26bp2426bp处处切割方式切割方式随机随机切割切割特异特异切割切割特异特异切割切割甲基化作用位甲基化作用位点点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点在在DNADNA克隆中克隆中的用途的用途无无十分有用十分有用有用有用表表2-1限制性内切酶的类型及其主要特征限制性内切酶的类型及其主要特征第18页，讲稿共74张，创作于星期二 限制性内切酶以双链限制性内切酶以双链DNADNA为底物，识别特定的核苷酸为底物，识别特定的核苷酸序列，切断特定位置的磷酸二酯链，产生具有序列，切断特定位置的磷酸二酯链，产生具有3-OH3-OH和和5-P5-P的的
15、DNADNA片段。片段。（五）限制性内切酶作用机制（五）限制性内切酶作用机制第19页，讲稿共74张，创作于星期二限制性内切酶作用过程限制性内切酶作用过程点击播放点击播放第20页，讲稿共74张，创作于星期二（六）限制性内切酶的识别与切割（六）限制性内切酶的识别与切割1.1.在在DNADNA分子双链的特异性识别序列部位切割分子双链的特异性识别序列部位切割DNADNA分子产分子产生链的断裂生链的断裂2.2.识别由识别由4-84-8个（多数个（多数4-64-6个）个）核苷酸组成的特定的核苷酸核苷酸组成的特定的核苷酸序列序列3.3.识别碱基对的顺序呈识别碱基对的顺序呈回文结构回文结构（Palindrom
16、icPalindromic），切点），切点就在其内部。就在其内部。识识别别第21页，讲稿共74张，创作于星期二第22页，讲稿共74张，创作于星期二回文结构（回文结构（Palindromic）A B C C B AA B C C B AA B N B AA B N B A大多数识别位点具有大多数识别位点具有180180度旋转对称的结构形式，即度旋转对称的结构形式，即这些核苷酸对的顺序是回文结构。这些核苷酸对的顺序是回文结构。第23页，讲稿共74张，创作于星期二 限制性内切酶切断限制性内切酶切断DNA链上链上磷酸二酯键磷酸二酯键的位置一般的位置一般在识别序列内部，在识别序列内部，如如GGATCC，
17、ATCGAT；也有少数在识别序列的两端也有少数在识别序列的两端 如如GATC，CATG。切切割割注意：注意：环状环状DNA分子上，若某种限制性内切酶有分子上，若某种限制性内切酶有n个识个识别序列，别序列，则完全切割后可获得则完全切割后可获得n个片段个片段。线状线状DNA分子，若某种限制性内切酶有分子，若某种限制性内切酶有n个识别序列个识别序列，则完全切割后可获得则完全切割后可获得n+1个片段个片段。第24页，讲稿共74张，创作于星期二几种几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaem
18、ophilus influenzae Rd 第25页，讲稿共74张，创作于星期二EcoR IPst I5 C T G C A G33 G A C G T C.5不同核酸内切酶的特异识别位点不同核酸内切酶的特异识别位点5 G A A T T C 33 C T T A A G 5第26页，讲稿共74张，创作于星期二A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A DNAABCDDNAHindHind切割位点切割位点核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用第27页，讲稿共74张，创作于星期二酶生物来源识别序列黏/平末端EcoR I大肠杆菌GAATTC黏末
19、端BamH I淀粉芽孢杆菌GCATCC黏末端Bal II枯草芽孢杆菌AGATCT黏末端Pvu I普通变形菌CGATCG黏末端Pvu II普通变形菌CAGCTG平末端Hind III流感嗜血杆菌RdAAGCCT黏末端Hinf I流感嗜血杆菌RfGANTC黏末端Sau3 A金黄色葡萄球菌GATC黏末端Alu I藤黄节杆菌AGCT平末端Taq I水声栖热菌TCGA黏末端Hae III埃及嗜血菌GGCC平末端Not I豚鼠耳炎诺卡氏菌GCGGCCGC黏末端Sfi I镶边链霉菌GGCCNNNNNGGCC黏末端最常用的限制性内切酶的识别序列最常用的限制性内切酶的识别序列第28页，讲稿共74张，创作于星期二
20、切切割割方方式式平头末端（平头末端（bluntendorflushend）经酶切所形成的末端具有经酶切所形成的末端具有互补碱基对完好互补碱基对完好的末端，的末端，称为称为平头末端平头末端。第29页，讲稿共74张，创作于星期二粘性末端（粘性末端（cohesive endcohesive end）切切割割方方式式 大多数大多数型限制性内切酶结合并切割的型限制性内切酶结合并切割的DNADNA序列是一种序列是一种回文序列回文序列，经切割一端产生，经切割一端产生5 5-磷酸磷酸突出的末端，另一端产生突出的末端，另一端产生3 3-OH-OH突突出的末端，即出的末端，即DNADNA片段双链的片段双链的两个末
21、端两个末端含有含有几个几个等长核苷酸碱基互补配对等长核苷酸碱基互补配对的单链末端，的单链末端，称为称为粘性末端粘性末端。第30页，讲稿共74张，创作于星期二第31页，讲稿共74张，创作于星期二部部分分常常用用的的限限制制性性内内切切酶酶第32页，讲稿共74张，创作于星期二第33页，讲稿共74张，创作于星期二第34页，讲稿共74张，创作于星期二第35页，讲稿共74张，创作于星期二有一些限制酶的识别顺序不是对称结构有一些限制酶的识别顺序不是对称结构CCGCTCGGCGAGAccBSIBssSICTCGTGGAGCAC第36页，讲稿共74张，创作于星期二同裂酶（同裂酶（isoschizomersis
22、oschizomers）概念概念用途用途有一些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有一些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，所以可以用来研究有所差别，所以可以用来研究DNA甲基化作用。甲基化作用。KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstICCGCGGSacICCGCGG有一些来源不同的限制性酶识别的是有一些来源不同的限制性酶识别的是相同相同的核苷酸的核苷酸靶序列，这类酶称为靶序列，这类酶称为同裂酶同裂酶。第37页，讲稿共74张，创作于星期二识别位点的序列相同识别位点的序列相同同裂酶（同裂酶（Isoschizomers)完全同裂酶（同序同切酶）完全同裂酶（同序同切酶
23、）识别位点和切点完全相同。识别位点和切点完全相同。如如Hind 和和Hsu I。Hind5-AAGCTT-33-TTCGAA-5HsuI5-AAGCTT-33-TTCGAA-5第38页，讲稿共74张，创作于星期二XmaI5-CCCGGG-33-GGGCCC-5SmaI5-CCCGGG-33-GGGCCC-5识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。如如Xma I 和和 Sma I。不完全同裂酶（同序异切酶）：不完全同裂酶（同序异切酶）：第39页，讲稿共74张，创作于星期二用途用途 如：限制酶如：限制酶Hpa和和Msp是一对同裂酶，共同的是一对同裂酶，共同的靶序列是靶序列是CCGG。当
24、其靶序列中含有一个。当其靶序列中含有一个5-甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶（CCGG，*号表示甲基化的碱基），号表示甲基化的碱基），Hpa不能够切不能够切割它，而割它，而Msp对于这个核苷酸的甲基化作用的反应则对于这个核苷酸的甲基化作用的反应则是是中性中性的，它不管的，它不管C残基甲基化与否都残基甲基化与否都能够切割能够切割。*现已研究现已研究发现发现，许多动物，许多动物DNA中中90%以上以上的甲基，都是的甲基，都是在序列在序列CG处以处以5-甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶的形式出现。所以，通过比较的形式出现。所以，通过比较Hpa和和Msp的的DNA消化产物就可以检测出消化产物就可以检测出甲基化的存在。甲基化的
25、存在。第40页，讲稿共74张，创作于星期二同尾酶（同尾酶（isocaudamerisocaudamer）概念概念与同裂酶对应的一类限制性酶，它们虽然来源与同裂酶对应的一类限制性酶，它们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，这类酶称为的粘性末端，这类酶称为同尾酶同尾酶。常用的限制酶常用的限制酶BamH、Bcl、Bgl、Sau3A和和Xho就是一组同尾酶，它们切割就是一组同尾酶，它们切割DNA后都形成由后都形成由GATC 4个个核苷酸组成的核苷酸组成的粘性末端。粘性末端。举例举例第41页，讲稿共74张，创作于星期二识别的序列不同
26、，但能切出相同的粘性末端。识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho 等等 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 BamH IBcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U U代表嘌呤；代表嘌呤；代表嘌呤；代表嘌呤；Y Y代表嘧啶。代表嘧啶。代表嘧啶。代表嘧啶。第42页，讲稿共74张，创作于星期二用途用途由于同尾酶切割由于同尾酶切割DNA后产生的是后产生的是粘性末端粘性末端，因此，因此，可以通过粘性末端之间的互补作用而彼此可以通过粘性
27、末端之间的互补作用而彼此连接连接起来，起来，这在这在基因克隆实验基因克隆实验中是很有用处的。中是很有用处的。同尾酶（同尾酶（isocaudamerisocaudamer）由由一对同尾酶一对同尾酶分别产生的分别产生的粘性末端粘性末端共价结合形成的共价结合形成的位位点点，特称为，特称为杂种位点（杂种位点（hybrid site）第43页，讲稿共74张，创作于星期二5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。？5-G 3-CCTAG GATCT-3 A-5 BamH I
28、Bgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5 BamH IBgl Sau 3A第44页，讲稿共74张，创作于星期二（七）（七）型型限制性内切限制性内切酶的反应条件酶的反应条件第45页，讲稿共74张，创作于星期二（八）影响限制性内切酶活性的因素（八）影响限制性内切酶活性的因素酶的纯度酶的纯度DNA样品的纯度样品的纯度DNA的甲基化程度的甲基化程度酶切反应的温度和时间酶切反应的温度和时间DNA分子的结构分子的结构限制性内切核酸酶的反应缓冲液限制性内切核酸酶的反应缓冲液第46页，讲稿共74张，创作于星期二高质量的限制性核酸内切酶，要求高质量的限制性核酸内切酶，要求:不存在其他核酸内切酶或外切酶
29、的污染不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染;长时间酶解不出现识别顺序特异性的下降长时间酶解不出现识别顺序特异性的下降;酶解的酶解的DNA片段连接后能重新被识别和切割等片段连接后能重新被识别和切割等.酶的纯度酶的纯度第47页，讲稿共74张，创作于星期二1.DNA制剂中可能抑制限制性内切酶活性的物质制剂中可能抑制限制性内切酶活性的物质:蛋白质、酚、氯仿、酒精蛋白质、酚、氯仿、酒精乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTA）十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS）高浓度的盐离子等高浓度的盐离子等 DNADNA样品的纯度样品的纯度第48页，讲稿共74张，创作于星期二2.提高限制性内切酶对低浓度提高限制性内切酶
30、对低浓度DNA制剂反应效率的方制剂反应效率的方法法增加内切酶的用量，平均每微克底增加内切酶的用量，平均每微克底 物物DNADNA可高达可高达1010单位甚至更多些；单位甚至更多些；扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑 制因素被相应地稀释；制因素被相应地稀释；延长酶催化反应的保温时间。延长酶催化反应的保温时间。第49页，讲稿共74张，创作于星期二 DNADNA的甲基化的甲基化1.原核生物的限制原核生物的限制-修饰系统的组成成分是：修饰系统的组成成分是：甲基化酶甲基化酶：对自身：对自身DNA起修饰作用，从而使限起修饰作用，从而使限制性内切核酸酶不能识别，保护自制性内
31、切核酸酶不能识别，保护自身身DNA免受降解。免受降解。限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶：破坏入侵的外源破坏入侵的外源DNADNA，防御防御异源遗传信息进入体内。异源遗传信息进入体内。因此，甲基化作用直接影响限制性内切酶的活性因此，甲基化作用直接影响限制性内切酶的活性第50页，讲稿共74张，创作于星期二2.2.从大肠杆菌寄主细胞中分离而来的质粒从大肠杆菌寄主细胞中分离而来的质粒DNADNA，通常都混，通常都混有有两种两种作用于特定核苷酸序列的作用于特定核苷酸序列的甲基化酶：甲基化酶：dam甲基化酶：催化甲基化酶：催化GATC序列中的腺嘌序列中的腺嘌呤残基甲基化。呤残基甲基化。dcm甲基化酶：催化
32、甲基化酶：催化CCAGG或或CCTGG中中胞嘧啶残基甲基化。胞嘧啶残基甲基化。第51页，讲稿共74张，创作于星期二3.基于基因工程基于基因工程从以上知识可知：从正常大肠杆菌菌株中分离出来的质从以上知识可知：从正常大肠杆菌菌株中分离出来的质粒粒DNADNA，只能被限制性内切核酸酶局部消化，甚至完全，只能被限制性内切核酸酶局部消化，甚至完全不被消化。不被消化。因此，在基因工程中，为了避免产生上述问题，通因此，在基因工程中，为了避免产生上述问题，通常使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒常使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNADNA。第52页，讲稿共74张，创作于星期二 酶切反应的温度酶切
33、反应的温度DNA酶切反应的温度是影响限制性内切核酸酶活性的酶切反应的温度是影响限制性内切核酸酶活性的另一个另一个重要因素。重要因素。不同的核酸内切酶，具有不同的最适温度，不同的核酸内切酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有很大的变动范围。而且彼此之间有很大的变动范围。但但，大多数限制性核酸内切酶的标准，大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度都是反应温度都是37。第53页，讲稿共74张，创作于星期二酶酶反应温度（反应温度（）ApaApaBanBanBstEBstEMaeMaeMaeMaeMaeMaeSmaSmaTaqTaq30305050606045455050555525256565表表2-2部
34、分限制性核酸内切酶的最适反应温度部分限制性核酸内切酶的最适反应温度第54页，讲稿共74张，创作于星期二 DNADNA分子结构分子结构DNA分子的不同的构型对限制性内切核酸酶的活性也分子的不同的构型对限制性内切核酸酶的活性也有很大的影响。有很大的影响。某些核酸内切酶切割某些核酸内切酶切割超螺旋超螺旋的质粒的质粒DNA或病或病毒毒DNA所需要的所需要的酶量酶量，要比消化，要比消化线性线性DNA高高出许多倍，最高的可达出许多倍，最高的可达20倍倍。第55页，讲稿共74张，创作于星期二某些限制性内切核酸酶，对于同一某些限制性内切核酸酶，对于同一DNA分分子子上不同位置的识别序列，切割效率明显不同。上不
35、同位置的识别序列，切割效率明显不同。DNADNA分子结构分子结构原因可能是侧翼序列的核苷酸成分的差异造的。原因可能是侧翼序列的核苷酸成分的差异造的。一般来说，一种限制性内切核酸酶对其不同识别一般来说，一种限制性内切核酸酶对其不同识别位点切割速率的差别最多不会超过位点切割速率的差别最多不会超过1010倍倍。第56页，讲稿共74张，创作于星期二 限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.缓冲液的主要成分缓冲液的主要成分Tris-Cl：使反应混合物的使反应混合物的pH恒定在酶活性所要恒定在酶活性所要求的求的最佳数值最佳数值范围内。对绝大数限制范围内。对绝大数限制酶来说，酶来说，最佳
36、最佳pH=7.4。MgCl2：保证酶活性的保证酶活性的正常正常发挥。发挥。NaCl或或KCl：同上。同上。第57页，讲稿共74张，创作于星期二-巯基乙醇：巯基乙醇：防止限制酶的氧化（但也可能防止限制酶的氧化（但也可能 有利于潜在污染杂质的稳定性）。有利于潜在污染杂质的稳定性）。牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSABSA）：对某些限制酶是必需：对某些限制酶是必需 的，它是一种中性蛋白，可防止酶的，它是一种中性蛋白，可防止酶 在低浓度蛋白质溶液中变性。在低浓度蛋白质溶液中变性。限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.缓冲液的主要成分缓冲液的主要成分第58页，讲稿共74张，创作于星
37、期二2.缓冲液的分类缓冲液的分类不同酶对缓冲液的离子强度要求不同，据此缓冲不同酶对缓冲液的离子强度要求不同，据此缓冲液可分为如下三种：液可分为如下三种：低盐缓冲液（低盐缓冲液（L）：10mmol/LNaCl中盐缓冲液（中盐缓冲液（M）：50mmol/LNaCl高盐缓冲液（高盐缓冲液（H）：100 100 mmol/LNaCl 限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液第59页，讲稿共74张，创作于星期二 限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.3.星号活性星号活性（staractvity）限制性内切核酸酶的识别位点是在特定的消化条件限制性内切核酸酶的识别位点是
38、在特定的消化条件下测定的，当下测定的，当条件改变条件改变时，有些酶的时，有些酶的识别位点识别位点也随之也随之改变改变，可能切割一些与特异识别序列相可能切割一些与特异识别序列相类似类似的序列，这种现象称的序列，这种现象称为为星号活性星号活性。概念概念第60页，讲稿共74张，创作于星期二 限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.3.星号活性星号活性（staractvity）概念（以概念（以EcoR为例）为例）EcoR在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割GAATTC，但但在在甘油甘油浓度浓度超过超过5%（V/V）时，也可切割时，也可切割NAATTN（其其中中N=A、T、C
39、、G），用），用 EcoR*表示表示。第61页，讲稿共74张，创作于星期二 限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.3.星号活性（星号活性（star actvitystar actvity）诱发星号活性产生的常见原因诱发星号活性产生的常见原因高浓度甘油高浓度甘油高浓度内切酶高浓度内切酶低离子强度低离子强度 高高pH值值含有机溶剂含有机溶剂用用Mn2+取代取代Mg2+第62页，讲稿共74张，创作于星期二 酶反应的终止酶反应的终止终止酶反应的方法有：终止酶反应的方法有：65保温保温10min。（只对此温度敏感的酶。（只对此温度敏感的酶，如，如EcoRI）用饱和酚、氯仿抽提用饱和
40、酚、氯仿抽提DNA方法纯化。方法纯化。加入终止反应液，多为电脉上样液，主要成份为加入终止反应液，多为电脉上样液，主要成份为50甘油，甘油，100mM EDTA(pH=8.0),1SDS和和0.1溴溴酚兰（不同厂家生产的有一定区别）等。酚兰（不同厂家生产的有一定区别）等。第63页，讲稿共74张，创作于星期二n若消化后的若消化后的DNA不需要进行后续的实验操作，不需要进行后续的实验操作，用终止用终止液终止反应。液终止反应。n有些厂家在内切酶包装中，会同时附上有些厂家在内切酶包装中，会同时附上10 loadingbuffer（1%SDS；50%甘油；甘油；0.05%溴酚蓝），使用添加溴酚蓝），使用添
41、加反应液量的反应液量的1/10，即可停止反应，进行电泳。，即可停止反应，进行电泳。n若消化后的若消化后的DNA需要进行后续的实验操作，用热失活法或需要进行后续的实验操作，用热失活法或酚酚/氯仿抽提去除内切酶。氯仿抽提去除内切酶。酶反应的终止酶反应的终止第64页，讲稿共74张，创作于星期二目前国际主流的限制性内切酶厂家目前国际主流的限制性内切酶厂家nNew England Labs（美国）（美国）nTakara（日本）（日本）nFermentas（立陶宛）（立陶宛）nSibenzyme（俄罗斯）（俄罗斯）nPromega（美国）（美国）第65页，讲稿共74张，创作于星期二酶切位点的分析软件酶切位点的分析软件nDNASTAR nPrimer 5.0第66页，讲稿共74张，创作于星期二Primer5.0软件分析酶切位点软件分析酶切位点第67页，讲稿共74张，创作于星期二第68页，讲稿共74张，创作于星期二第69页，讲稿共74张，创作于星期二第70页，讲稿共74张，创作于星期二DNASTAR 软件分析酶切位点软件分析酶切位点第71页，讲稿共74张，创作于星期二第72页，讲稿共74张，创作于星期二第73页，讲稿共74张，创作于星期二感感谢谢大大家家观观看看第74页，讲稿共74张，创作于星期二