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1、关于核酸电泳第1页，讲稿共34张，创作于星期二天然天然DNA的制备的制备一般地说。总DNA主要是指基因组DNA(genomic，c DNA)，即细胞核内的染色体DNA分子。核DNA分子呈极不对称的线状结构一条染色体为一个DNA分子。高等植物核核DNA大约含有106 bp其长度与直径的比例极不对称使其对机械力十分敏感。虽然目前可以成功地测定出它的一级结构。但仍难以分离出它的完整分子。第2页，讲稿共34张，创作于星期二1.天然天然DNA的来源的来源 (1)染色体染色体DNA (2)病毒与噬菌体病毒与噬菌体 (3)质粒质粒DNA (4)线粒体与叶绿体线粒体与叶绿体第3页，讲稿共34张，创作于星期二2
2、.DNA的提取的提取细胞的破碎细胞的破碎破碎的手段：破碎的手段：物理方式：超声波法、匀浆法、液氮破碎法物理方式：超声波法、匀浆法、液氮破碎法:容易导致容易导致DNA链的断裂链的断裂.对于细胞破碎较困难的植物材料，可以辅加蛋白酶对于细胞破碎较困难的植物材料，可以辅加蛋白酶K，在酶的存在，在酶的存在下共同破碎细胞。下共同破碎细胞。超生波液氮第4页，讲稿共34张，创作于星期二总总DNA的提取方法：的提取方法：去除去除糖糖、脂类脂类、蛋白蛋白等，得到的就是等，得到的就是核酸核酸DNARNA第5页，讲稿共34张，创作于星期二总总DNA的提取方法：的提取方法：去除去除多糖多糖、脂类脂类、蛋白蛋白等，得到的
3、就是等，得到的就是核酸核酸去除多糖：去除多糖：CTAB、PVP、高盐溶液等、高盐溶液等去除脂类：去除脂类：SDS、CTAB等等去除蛋白：去除蛋白：SDS、蛋白酶、酚氯仿等、蛋白酶、酚氯仿等DNA第6页，讲稿共34张，创作于星期二质粒质粒DNA的提取的提取第7页，讲稿共34张，创作于星期二破坏细胞壁破坏细胞壁溶菌酶、强碱和十二烷基磺酸钠溶菌酶、强碱和十二烷基磺酸钠(SDS)裂解细胞膜裂解细胞膜十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠(SDS)、TritonX-100蛋白质及其它杂质的去除蛋白质及其它杂质的去除SDS使蛋白形成不溶物，沉淀出来使蛋白形成不溶物，沉淀出来高浓度盐离子高浓度盐离子(KCl)使变性蛋
4、白、多糖、细胞碎屑等沉淀出来使变性蛋白、多糖、细胞碎屑等沉淀出来细菌线形染色体细菌线形染色体DNA的去除的去除强热、碱强热、碱处理时，细菌线性染色体处理时，细菌线性染色体DNA变性，当快速降温、加入酸中变性，当快速降温、加入酸中和时，已变性的细菌线性染色体和时，已变性的细菌线性染色体DNA变性不能快速复性，与其它杂质变性不能快速复性，与其它杂质缠绕而沉淀出来缠绕而沉淀出来质粒质粒DNA双链可快速恢复原状双链可快速恢复原状,重新形成超螺旋分子重新形成超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相并以溶解状态存在于液相中。中。第8页，讲稿共34张，创作于星期二3.DNA的浓缩的浓缩(1)乙醇乙醇(2)异丙醇异
5、丙醇(3)聚乙二醇聚乙二醇(PEG600)第9页，讲稿共34张，创作于星期二工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好 第10页，讲稿共34张，创作于星期二RNA的提取分离的提取分离第11页，讲稿共34张，创作于星期二核酸电泳核酸电泳第12页，讲稿共34张，创作于星期二1.应与进行普通微生物实验的区域分离好应与进行普通微生物实验的区域分离好2.使用标有使用标有“无无RNA酶酶”的商品试管的商品试管,吸头吸头,溶液和水溶液和水.通常新的无通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶酶 3.双蒸水双蒸水(ddH2O)和溶液应该用和溶液应该用RNA酶的抑制剂酶的抑制剂DEP
6、C(焦碳酸二焦碳酸二乙酯乙酯)进行处理进行处理:每每100mL溶液或水中加入溶液或水中加入0.1mL DEPC原液原液,放在放在摇床上充分混匀并在摇床上充分混匀并在37下作用数小时下作用数小时.然后将溶液高压灭菌然后将溶液高压灭菌15min使使DEPC失活失活 4.分离分离RNA以前以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 烘烤烘烤4h以以灭活核酶灭活核酶.如有可能如有可能,将其他设备也灭菌处理将其他设备也灭菌处理 前期准备前期准备:第13页，讲稿共34张，创作于星期二1.在在Trizol试剂的保护下，匀浆组织，静置裂解细胞释放内含试剂的保护下，匀浆组织，静置裂
7、解细胞释放内含RNA，Trizol试剂对试剂对RNA有保护作用，能抑制有保护作用，能抑制RNA酶的活性，酶的活性，并且同时有裂解细胞的作用。并且同时有裂解细胞的作用。2.将匀浆液中加入苯酚，去除裂解液中的脂类，蛋白和将匀浆液中加入苯酚，去除裂解液中的脂类，蛋白和DNA，离，离心后取出上清液，里面含有心后取出上清液，里面含有RNA，而杂志留在苯酚中。，而杂志留在苯酚中。3.在上清液中加入等体积异丙酮，混匀后，静置片刻，离心，将在上清液中加入等体积异丙酮，混匀后，静置片刻，离心，将RNA沉淀于管底。弃上清，用沉淀于管底。弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，离心。去上清，乙醇洗涤沉淀，离心。去上清，将沉淀
8、在真空干燥器中烘干。将沉淀在真空干燥器中烘干。第14页，讲稿共34张，创作于星期二核酸电泳核酸电泳第15页，讲稿共34张，创作于星期二带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定各种生物大分子在一定pH条件下可以解离成带电荷的离条件下可以解离成带电荷的离子。在电场中会向相反的电极移动。子。在电场中会向相反的电极移动。人们采用各种材料作为支持人们采用各种材料作为支持电泳介质电泳介质创造出许多新方法其创造出许多新方法其中以中以琼脂糖琼脂糖和和聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳最为突出。为支持介
9、质的凝胶电泳最为突出。自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来按分子自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来按分子量大小分离量大小分离DNA的凝胶电泳技术已经发展成为一种分析的凝胶电泳技术已经发展成为一种分析鉴定鉴定重组重组DNA分子分子及及蛋白质与核酸相互作用蛋白质与核酸相互作用的重要实验手的重要实验手段段第16页，讲稿共34张，创作于星期二第17页，讲稿共34张，创作于星期二凝胶电泳的原理：凝胶电泳的原理：当一种分于被放置在电场当中时、它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。
10、也就是说电场强度越大电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快。反之则较慢。电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等,降低了对流运动故已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异。以及所带的净电荷的多寡。便可以通过电泳将蛋白质或核园分子混合初中的各种成分被此分离开来。第18页，讲稿共34张，创作于星期二1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳3.脉冲电泳凝胶电泳脉冲电泳凝胶电泳第19页，讲稿共34张，创作于星期二琼脂糖琼脂糖是一种
11、从红色海藻产物琼脂中提取而来的线性多糖聚合物。当琼脂糖加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质琼脂糖由1,3连接的吡喃型-D-半乳糖与1,4连接的3,6脱水吡喃型-L-半乳糖组成。琼脂糖分子呈随机线团状，凝结初期由于氢键的作用形成双链分子，而后再发生双链分子间的连接直至最后固化。由于链间的连接是靠氢键的作用，所以一切会破坏氢键形成的因素都会影响凝胶的形成。1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.第20页，讲稿共34张，创
12、作于星期二凝胶的分辨能力凝胶的分辨能力凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小浓度越高，孔隙越小其分辨能力也就越强：浓度降低孔隙就增大其分辨力也就随之减弱。凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为70bp-80kb之间；而要分辨较小分子旦的DNA片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨能力为6-1000bp之间。第21页，讲稿共34张，创作于星期二电泳时电泳时DNA迁移的影响因素迁移的影响因素1.DNA分子质量的影响分子质量的影响2.DNA构型的影响构型的影响如：如：质粒质粒超螺旋超螺旋DNA线状线状DNA开环开环DNA3.胶浓度的影响胶浓度的影响4.电场强度的影响电场强度
13、的影响5.EB的影响的影响6.电泳缓冲液的影响电泳缓冲液的影响7.碱基组成与电泳温度的影响碱基组成与电泳温度的影响EP第22页，讲稿共34张，创作于星期二电泳缓冲液电泳缓冲液1.TAE(Tris-乙酸乙酸)2.TBE(Tris-硼酸硼酸)3.TPE(Tris-磷酸磷酸)TBE与与TPE缓冲容量高缓冲容量高，DNA分离效果好，但分离效果好，但TPE在在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使容易使DNA沉淀沉淀.TBE会引起高电渗现象。会引起高电渗现象。TAE缓冲容量低，缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的缓冲液中的EDTA可
14、螯合可螯合二价二价阳离子，从而抑制阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止酶的活性，防止PCR扩增产物降解扩增产物降解.电泳电压电泳电压一般电压为一般电压为1-10V/cm。对大分子的分离可用电压。对大分子的分离可用电压5V/cm以下以下。电泳过程最好。电泳过程最好在低温条在低温条件下进行。件下进行。第23页，讲稿共34张，创作于星期二2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质(低于100道尔顿)、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度
15、仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N-亚甲双丙烯酰胺(甲叉双丙烯酰胺)参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.注意：注意：丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺都具有神经毒性都具有神经毒性都具有神经毒性都具有神经毒性，能够经过皮肤及呼吸道进入体内，会因多次积蓄而中毒；故操作时要极其小心，需戴手套各面罩。第24页，讲稿共34张，创作于星期二虽然聚丙烯酰胺凝胶的灌制比琼脂糖凝胶繁锁，但以下几种优点是琼脂糖凝胶所不具备的：1.分辨率极
16、高；2.比琼脂精凝胶的载样量大；3.回收的DNA样品纯度极高，可用于要求非常严格的实验，如转基因动物实验；4.在聚丙烯酰胺凝胶分子的交联网状结构中，带有酰胺侧链的C-C聚合物不带或少带离子侧链基因；5.聚丙烯酰胺凝胶无色透明。比琼脂糖凝胶的紫外线吸收低、抗腐蚀性强、机械强度高、韧性好。第25页，讲稿共34张，创作于星期二根据分离根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.2.将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角.3.按表3配制所需%浓
17、度凝胶的毫升数.4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止.5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10角，可减少液体泄漏的机会.6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE缓冲液.7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡.9.接好电极，电压为1-8V/c
18、m，进行电泳.10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，1530min后取出水洗紫外仪下观察结果.12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可用银染.第26页，讲稿共34张，创作于星期二同同浓浓度丙度丙烯酰烯酰胺和胺和DNA的的 有效分离范有效分离范围见围见表表丙烯酰胺(%)有效分离范围(bp)溴酚兰*二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.04020030701
19、5.025150156020.0101001245*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).第27页，讲稿共34张，创作于星期二DNA染色染色:a.溴化乙锭溴化乙锭(Ethidiumbromide，EB)在凝放电泳中，加入溴化乙锭染料对核酸分子染色之后(凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB)。将电泳标本放置在紫外光下观察便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位即使每条DNA带中仅含有0.05ug的微量DNA也可以被清晰地段现出来。溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料可以插入列DNA或RNA分子的碱基之间。并在302nm波长的紫外光照射下有
20、最大红色荧光(590nm)发出。EBEB的突出缺点：的突出缺点：的突出缺点：的突出缺点：为中度毒性的强诱变剂(302nm透照，254nm外照)第28页，讲稿共34张，创作于星期二电泳载样缓冲液电泳载样缓冲液(Loadingbuffer):核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.指示剂一般
21、与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液载样缓冲液.载样缓冲液的作用有:增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内;在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置;使样品呈色，使加样操作更方便.第29页，讲稿共34张，创作于星期二b.银染色银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.第30页，讲稿共34张，创作于星期二c.SYBRGreenIA Aminorgroovebindin
22、gdyeminorgroovebindingdyeInitial PhaseExponential PhasePlateau Phase第31页，讲稿共34张，创作于星期二3.脉冲电泳凝胶电泳脉冲电泳凝胶电泳(Pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE)在电场的作用下DNA可进入较小的琼脂糖凝胶孔中，大的分子只能进入大的胶孔，但需要较长的时间方能找到可进入的胶孔，所以泳动轨迹弯曲，速度缓慢。大于30kb和DNA分子在电泳中只能头尾牵引进入胶孔，需定期改变电场方向使大分子通过凝胶孔。每改变一次大的伸展的DNA分子重新定向，在新的方向上通过凝胶。通过不断交替改变电场方向，
23、选择恰当的脉冲时间等条件，可将3510000kb的DNA分子在凝胶中予以分辨。像大肠杆茵这样的原核生物,其染色体基因组DNA的长度超过4000kb。哺乳动物主要组织相容性基因座(locus)所占的DNA长度亦达数千kb。由此可见,运用普通的凝胶电泳技术显然是无法分离如此超大分子量的DNA分子的。1984年,D.C.Schwartz和C.R.Cantor发明的脉冲电场凝胶电泳(PFGE)技。可以成功地用来分离整条染色体这样的超大分子量的DNA分子。第32页，讲稿共34张，创作于星期二在标准的脉冲电场凝胶电泳中、头一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成在标准的脉冲电场凝胶电泳中、头一个脉冲的电场方向与
24、核酸移动方向成45度夹度夹角，而下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧亦成角，而下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧亦成45度夹角。度夹角。由于加压在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小及作用时间都在交替地变换着，使得由于加压在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小及作用时间都在交替地变换着，使得DNA分子能分子能够随时地调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量较小的够随时地调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量较小的DNA分子相比、分子相比、分子量较大的分子量较大的DNA分子需要更多次地更换其构型和方位，以使其可以按新的方向游动。分子需要更多次地更换其构型和方位，以使其可以按新的方向游动。因此，在琼脂糖介质中的迁移速率显得更慢一些，从而达到了分离超大分子量因此，在琼脂糖介质中的迁移速率显得更慢一些，从而达到了分离超大分子量DNA分子的目的。分子的目的。第33页，讲稿共34张，创作于星期二02.10.2022感感谢谢大大家家观观看看第34页，讲稿共34张，创作于星期二