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1、关于青霉素酰化酶的分离纯化第1页，此课件共97页哦青霉素n青霉素是常见抗生素之一。来源于点青霉、产黄青霉等真菌。对革兰氏阳性菌的生长有抑制作用青霉素第2页，此课件共97页哦青霉素的分类第3页，此课件共97页哦青霉素的代谢途径-氨基己二酸半胱氨酸缬氨酸-氨基己二酰半胱氨酰缬氨酸异青霉素N青霉素青霉素ACVSIPNSAT第4页，此课件共97页哦nAT是一系列不同的酶。不同的AT催化不同的酰基转移反应生成不同的青霉素n添加苯乙酸相应的AT催化它与异青霉素N反应生成青霉素Gn添加苯氧乙酸时，相应的AT催化它与异青霉素N反应生成青霉素V第5页，此课件共97页哦青霉素酰化酶n1950年，日本科学家发现产黄
2、青霉和米曲霉的菌丝可以分解青霉素得苯乙酸和另一种有机物（后被证实为6-APA）n经研究，这一反应由青霉素酰化酶催化n除了丝状真菌外，一些细菌和酵母中也检测到青霉素酰化酶的活性第6页，此课件共97页哦青霉素酰化酶的结构n青霉素酰化酶的结构差异较大。n大肠杆菌（Escherichia coli）青霉素G酰化酶有一个亚基和一个亚基n球形芽胞杆菌（Bacillus sphaericus）的青霉素酰化酶是一个四聚体第7页，此课件共97页哦第8页，此课件共97页哦第9页，此课件共97页哦催化的反应青霉素酰化酶RCOOH+青霉素6-APA第10页，此课件共97页哦分类n按照底物的不同，可以将青霉素酰化酶分为
3、青霉素G酰化酶、青霉素V酰化酶和氨苄西林酰化酶第11页，此课件共97页哦应用n制备-内酰胺类抗生素中间体（6-APA）n半合成新的-内酰胺抗生素n手性药物n基团保护第12页，此课件共97页哦当前青霉素酰化酶的一些研究方向n蛋白质工程n固定化n分离纯化第13页，此课件共97页哦传统的分离纯化方法n硫酸铵沉降n葡聚糖凝胶色谱n离子交换色谱n电泳第14页，此课件共97页哦n据我们组阅读的文献，传统方法分离青霉素酰化酶的回收率大部分在30%至50%n有必要开发新型提纯工艺第15页，此课件共97页哦新型分离纯化方法一、色谱法1.扩张床吸附色谱2.整体柱色谱3.疏水性电荷诱导色谱4.一步离子交换色谱完成分
4、离纯化第16页，此课件共97页哦二、固定化金属亲和膜分离法三、其它方法1.双水相萃取2.高通量筛选辅助设计分离纯化工艺第17页，此课件共97页哦n新方法提纯青霉素酰化酶的回收率可达到90%第18页，此课件共97页哦n让我们一起分享这些奇妙的分离纯化方法第19页，此课件共97页哦膜分离n膜分离技术是指在分子水平上不同粒径分子的混合物在通过半透膜时，实现选择性分离的技术 第20页，此课件共97页哦n传统的膜分离包括：微滤膜（MF）、超滤膜（UF）、纳滤膜（NF）、反渗透膜（RO）等 第21页，此课件共97页哦亲和膜分离n亲和膜（affinity membrane）：利用亲和配基（染料、烷基、金属离
5、子等）修饰的滤膜。n亲和膜分离原理：是以亲和膜为亲和吸附介质纯化目标产物的分离方法，是亲和色谱的变型，又称膜亲和色谱第22页，此课件共97页哦亲和膜的优势n具备膜分离和亲和色谱双重功能，提高了分离纯化能力n可以支持高流速操作，解决了色谱太耗时间的缺点n易于放大第23页，此课件共97页哦亲和膜的制备方法一般方法n膜材料成膜活化配基偶联，n膜材料活化配基偶联成膜，第24页，此课件共97页哦分离过程n亲和吸附洗脱亲和膜再生 第25页，此课件共97页哦固定化金属亲和膜n用固定于膜上的金属离子（如Cu2+）为配基的亲和膜即固定化金属亲和膜。如果金属离子为Cu2+，那么该膜称为固定化Cu2+亲和膜n固定化
6、金属亲和膜可以用于许多物质的分离。青霉素酰化酶是其中之一。目前研究较多的是以Cu2+为配基的亲和膜。第26页，此课件共97页哦固定化Cu2+亲和膜的分离原理n具有选择透过性的膜可截留大分子，都过小分子n固定于膜上的Cu2+可以通过和青霉素酰化酶表面的组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等带负电荷残基的相互作用使其被吸附于膜上，再通过解析获得被提纯的青霉素酰化酶第27页，此课件共97页哦固定化Cu2+亲和膜的制备nYi-Miao Ke等人以亚氨基二乙酸（IDA）为螯合剂，Cu2+为被螯合的离子制成亲和膜。n制备工艺第28页，此课件共97页哦结果1.对Cu2+的螯合量增加至75.50.25 mol/disc2
7、.提纯后酶活增加至1.8 U/disc第29页，此课件共97页哦膜表面共价结合的物质对膜效能的影膜表面共价结合的物质对膜效能的影响响n膜表面与膜共价结合的材料对分离效能也有影响nYung-Chuan Liu等研究了间隔臂（）的数量对膜效能的影响，即n值对膜效能的影响第30页，此课件共97页哦第31页，此课件共97页哦n结果表明，用1,8-diaminooctane做间隔臂，即n=8时，青霉素酰化酶纯化的比活度提高2.73倍，回收率为70.27%第32页，此课件共97页哦青霉素酰化酶分离过程nYung-Chuan Liu等研究发现，最佳上样条件为：4,pH=8.5，0.5 M NaCl,每单位区
8、域上含 32.04 mol Cu2+n最佳的洗脱条件为：pH=6.8，1M NH4 Cl,0.5 M NaCl。第33页，此课件共97页哦PGA原液100ml1.2ml/min72ml washing buffer63ml elution buffer不能被吸附的蛋白质被吸附蛋白质被吸附蛋白质；不能被吸附的蛋白质；Cu2+；配位键第34页，此课件共97页哦结果第35页，此课件共97页哦n该操作工艺使青霉素酰化酶纯化的比活度提高了9.11倍n该操作工艺的回收率为90.25%第36页，此课件共97页哦双功能膜纯化和固定PGAnChih-I Chen等通过实验，将吸附于固定化Cu2+亲和膜的青霉素酰
9、化酶与膜表面物质共价结合，制备成固定化酶第37页，此课件共97页哦工艺流程PGA1812hpH 10.0,18,76hEDTA 青霉素酰化酶；Cu2+；配位键；共价键第38页，此课件共97页哦第39页，此课件共97页哦原初膜与固定化酶后的膜表面电镜结构第40页，此课件共97页哦结果n结果表明，在2个月内，在使用26次内酶活可以保留96.3%第41页，此课件共97页哦色谱n原理：色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配系数会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。第42页，此课件共97页哦色
10、谱分类n色谱可分为传统色谱和新型色谱，传统色谱有：1.吸附色谱2.离子交换色谱3.疏水色谱4.亲和色谱5.反向色谱6.凝胶色谱第43页，此课件共97页哦新型色谱包括以下3种色谱n扩张床吸附色谱n整体柱色谱n疏水性电荷诱导色谱第44页，此课件共97页哦扩张床吸附色谱n流化床：将大量固体颗粒悬浮于运动的流体之中，从而使颗粒具有流体的某些表观特征，这种流固接触状态称为固体流态化，即流化床。n固定床：在进行多相过程的设备中，若有固相参与，且处于静止状态时，则设备内的固体颗粒物料层，称为固定床 n扩张床：一种特殊的流化床。该流化床中液相、固相返回程度低第45页，此课件共97页哦第46页，此课件共97页哦
11、流化床固定床扩张床扩张床流化床、扩张床、固定床之间的关系第47页，此课件共97页哦扩张床吸附色谱的原理n当料液从色谱柱下端流入时，填料上浮。至上浮速度与沉降速度一致时，填料最终处于悬浮状态。此时能被填料吸附的物质附着于填料上，不被吸附的随着料液从色谱柱上端流出。当所有不被吸附的物质都流出后，开始从上向下对填料进行洗脱，将被吸附物质解吸。第48页，此课件共97页哦扩张床吸附色谱的操作平衡上样洗涤洗脱再生第49页，此课件共97页哦扩张床吸附色谱操作示意图第50页，此课件共97页哦扩张床吸附色谱图第51页，此课件共97页哦扩张床吸附色谱纯化青霉素酰化酶nL.M.Pinotti等以阴离子树脂Strea
12、mline SP XL为填料，利用扩张床吸附色谱分离大肠杆菌（E.coli）培养液和匀浆中的青霉素酰化酶。结论结论n培养液中青霉素酰化酶回收率为91.0%n匀浆中青霉素酰化酶回收率55.0%第52页，此课件共97页哦整体柱色谱n传统色谱柱：色谱柱中的填料为大孔球形填料n整体柱：又称为棒状柱、连续床层，是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相 第53页，此课件共97页哦ABA 传统色谱柱；B 整体柱第54页，此课件共97页哦n在形态上，整体柱与电泳凝胶类似第55页，此课件共97页哦整体柱的优势n介质均匀，分辨率高n可在高流速下操作n可直接在柱内聚合、交联（与SDS-PAGE
13、凝胶配制类似）n使用寿命长，稳定性好n分辨率、吸附容量、使用流速可以通过改变制备过程中单体溶液组成来调节（类似于配制不同浓度的电泳凝胶）第56页，此课件共97页哦整体柱分类n无机介质整体柱：硅胶等n有机聚合物整体柱：聚丙烯酰胺类、聚苯乙烯类等第57页，此课件共97页哦整体柱色谱分离青霉素酰化酶nRustem Kecili等构建poly(EGDMA-MAAP）整体柱纯化Penicillium chrysogenum(NRRL)的青霉素酰化酶和Penicillium Purpurogenum的青霉素酰化酶。第58页，此课件共97页哦整体住填料的分子结构第59页，此课件共97页哦填料的电镜图第60页
14、，此课件共97页哦结论第61页，此课件共97页哦疏水性电荷诱导色谱n疏水性电荷诱导色谱：疏水性电荷诱导色谱是一种通过可离子化的对偶式配基对pH依赖性，来分离生物大分子的新型液-固吸附性色谱技术。其吸附是通过温和疏水作用，并在近生理条件下发生，不需邮寄溶剂或其他盐类的加入。解吸是通过调节流动相的pH值，使配基与目的产物带上相同电荷，当静电斥力大于疏水性相互作用时，洗脱便开始了。第62页，此课件共97页哦第63页，此课件共97页哦疏水性电荷诱导色谱纯化青霉素酰化酶nD.Coulon等以4-MEP为填料，利用疏水性电荷诱导色谱分离青霉素酰化酶第64页，此课件共97页哦传统色谱在分离青霉素酰化酶中的应
15、用n与新型色谱一样，从传统色谱出发可以开发出好的分离青霉素酰化酶的工艺第65页，此课件共97页哦拟亲和色谱n拟亲和层析法：指用固定的配体选择性吸附一些酶或其它蛋白的层析技术。第66页，此课件共97页哦拟亲和色谱分离青霉素酰化酶nRustem Kecili等以Poly(EGDMA-MAAP)为配基，进行拟亲和色谱纯化青霉素酰化酶。结论结论n青霉素酰化酶纯化倍数为23.2n青霉素酰化酶回收率为93%第67页，此课件共97页哦一步离子交换纯化青霉素酰化酶n传统的分离纯化工艺一般需要两步或两步以上操作。而每次操作都会有产物损伤，因此如何减少分离步骤是提高产率的一条思路。nValerie Orr等提出了
16、一个只需一步离子交换色谱即可完成对青霉素酰化酶分离纯化的工艺。如下表，他们采用一种电导率低的培养基培养能产生青霉素酰化酶的大肠杆菌 第68页，此课件共97页哦实验方法n开发合适的培养基培养大肠杆菌至适当时间后取出适量培养基，离心除去细胞。将适量上清液上样于离子交换柱（Q Sepharose TM Fast Flow Column）探索最佳工艺。用280nm紫外检测。收集各区段进行SDS-PAGE检测。第69页，此课件共97页哦 有图可见，青霉素酰化酶没有吸附到色谱柱上而杂蛋白大部分被色谱柱吸附 第70页，此课件共97页哦结论n纯化的青霉素酰化酶的酶活为16.3U/mgn青霉素酰化酶的纯度提高了
17、3倍第71页，此课件共97页哦其它方法n离子交换膜色谱n双水相萃取n高通量筛选辅助设计分离纯化工艺第72页，此课件共97页哦膜色谱技术n膜色谱是将液相色谱与膜分离融合于一起的新型生化分离技术，具有选择性高、分离速度快、能耗低、易放大等特点。n膜色谱可分为四类：亲和膜色谱，离子交换膜色谱，疏水作用膜色谱，多级膜色谱。第73页，此课件共97页哦离子交换膜色谱n离子交换膜色谱：离子交换膜色谱主要是利用膜介质表面的离子交换基团与目标蛋白之间的离子交换作用进行分离的根据离子交换基团的性质，可分为强阳离子型、弱阳离子型、强阴离子型、弱阴离子型。第74页，此课件共97页哦离子交换膜色谱的特点n操作条件较温和
18、n使用寿命长n选择性差第75页，此课件共97页哦离子交换膜色谱分离青霉素酰化酶nValerie Orr等开发了集膜分离与离子交换色谱于一体的离子交换膜，用来分离青霉素酰化酶。第76页，此课件共97页哦部分实验结果A 离子交换膜的洗脱曲线；B 各洗脱区段的SDS-PAGE检测第77页，此课件共97页哦结论n青霉素酰化酶的产量达到19U/mgn青霉素酰化酶的回收率达到72%第78页，此课件共97页哦双水相萃取n原理：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（aqueous two-phase system,ATPS）。可形成双水相的双
19、聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。生物分子的分配系数取决与溶质于双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用 第79页，此课件共97页哦双水相萃取的优势n含水量高（70%90%），适合分离水溶性的蛋白质，不易引起变性n易于放大n无有机溶剂残留第80页，此课件共97页哦双水相萃取分离青霉素酰化酶nOscar Aguilar等研究了双水相萃取提取青霉素酰化酶n研究发现，在PEG1450-phosphate,TLL 48.5%(w/w),Vr=1.0,pH of 7.0 and 35%(w/w)条件下，青霉素酰化酶
20、的回收率达到97%，纯化了3.5倍。第81页，此课件共97页哦高通量筛选n高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在同一时间检测数以千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的技术体系，它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息，并从中找到有价值的信息 第82页，此课件共97页哦n现在的高通量检测仪器兼容的微孔板密度已经由最初的 96 孔增加到384 孔,部分仪器甚
21、至可以使用 1536 孔板进行测量,大幅度提高了筛选通量。光学检测技术也由单一的紫外-可见光检测扩大到化学发光检测、荧光检测和各种光学传感技术,为高通量检测开辟了较广泛的应用领域.第83页，此课件共97页哦n高通量筛选分析主要包括均相分析和细胞分析,均相分析技术中应用较多的有亲合闪烁分析(SPA)、荧光分析(FA)等技术。第84页，此课件共97页哦荧光检测(FA)n荧光材料在一定条件下每个分子能释放数千个光子,使理论上的单一分子水平检测成为可能。这种特性以及可采用多种荧光模式,使得荧光检测技术(FA,Fluorescence Assay)成为高通量筛选必不可少的方法第85页，此课件共97页哦闪
22、烁接近检测n高产量的荧光分子被附到带有受体的固体上,通过放射性配体引起成键反应。同时,仍存留于溶液中的未成键的放射性配体被水分子抑制,而与荧光受体成键的配体的放射线被其周围的荧光分子吸收。因此,活性分子仅以荧光量分析而没有任何额外步骤就被简单的筛选出来。第86页，此课件共97页哦高通量筛选辅助设计纯化工艺n开发一个合适的提取工艺需要花费时间。如何提高研发效率是一个待解决的问题nJin Zhou等基于96孔板开发出高通量筛选技术，用于辅助设计青霉素酰化酶的分离纯化工艺第87页，此课件共97页哦n所有的筛选进程（平衡，梯度洗脱等）在96孔板中进行。n利用96孔板技术，高效检测每次分离纯化操作后获得
23、的酶活，根据实验结果提出适当的放大规模的纯化工艺第88页，此课件共97页哦96孔板第89页，此课件共97页哦n根据96孔板筛选，提出放大工艺：疏水作用色谱Phenyl 01离子交换色谱DEAE A25青霉素酰化酶第90页，此课件共97页哦放大工艺与96孔板结论比较第91页，此课件共97页哦结论第92页，此课件共97页哦That is all.Thank you.第93页，此课件共97页哦第94页，此课件共97页哦第95页，此课件共97页哦制备6-APAn临床上直接应用的天然青霉素是青霉素G和青霉素V，其它青霉素均为对6-APA进行修饰得到的半合成青霉素。因此高效制备6-APA是生产半合成青霉素工艺中重要的一环。6-APA第96页，此课件共97页哦感感谢谢大大家家观观看看第97页，此课件共97页哦