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1、关于大关于大肠杆菌的分离和培养杆菌的分离和培养第一页，讲稿共三十六页哦 指结构简单指结构简单,形体微小的单细胞、多细胞或无细形体微小的单细胞、多细胞或无细胞结构的低等生物。胞结构的低等生物。一、微生物一、微生物90%90%以上的微生物是对人类有利的。以上的微生物是对人类有利的。微生物的类群微生物的类群病毒病毒细菌细菌蓝细菌蓝细菌放线菌放线菌酵母酵母霉菌霉菌原生动物原生动物病毒病毒病毒病毒原核生物原核生物原核生物原核生物真菌真菌真菌真菌原生动物原生动物原生动物原生动物第二页，讲稿共三十六页哦 细菌细胞由外向里依细菌细胞由外向里依次有次有:鞭毛和菌（纤）毛鞭毛和菌（纤）毛荚膜荚膜细胞壁细胞壁细胞膜
2、细胞膜细胞质细胞质拟核区拟核区(类核区类核区)1 1、细菌的构造、细菌的构造图图图图1-3 1-3 细菌的结构细菌的结构细菌的结构细菌的结构繁殖方式：分裂繁殖（繁殖方式：分裂繁殖（20min分裂一次）分裂一次）第三页，讲稿共三十六页哦2、菌落：n单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做细胞群体，叫做菌落菌落。n菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。第四页，讲稿共三十六页哦菌落细菌的菌落特征细菌的菌落特征因种而异因种而异 第五页，讲稿共三十六
3、页哦n碳源碳源n氮源氮源n生长因子生长因子n无机盐无机盐n水水微生物需要的五大类营养要素物质微生物需要的五大类营养要素物质3 3、培养基、培养基 培养基（培养液）是培养基（培养液）是人工方法配制而成的，是人工方法配制而成的，是微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质。第六页，讲稿共三十六页哦1 1）培养基的成分）培养基的成分（a a）细菌培养基：）细菌培养基：特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化钠特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化钠 酸碱度：中性偏碱酸碱度：中性偏碱（b b）霉菌培养基：）霉菌培养基：特殊成分：无机物或添加蔗糖的豆芽汁特殊成分：无机物或添加蔗糖的豆芽汁 酸碱度：中性偏
4、酸酸碱度：中性偏酸第七页，讲稿共三十六页哦2 2）培养基的种类）培养基的种类（1 1）按物理性质分）按物理性质分:a.a.固体培养基固体培养基 通常加通常加琼脂琼脂，作为凝固剂，作为凝固剂 （凝固剂的要求：不被微生物利用，又可使培养基固（凝固剂的要求：不被微生物利用，又可使培养基固化，且不影响培养基中的其他营养物被细菌吸收）化，且不影响培养基中的其他营养物被细菌吸收）作用：作用：分离（纯化）细菌、计数、保留菌种分离（纯化）细菌、计数、保留菌种等等 b.b.液体培养基液体培养基 不加琼脂等凝固剂其它成分与固体培养基相同不加琼脂等凝固剂其它成分与固体培养基相同 作用：作用：培养细菌培养细菌第八页，
5、讲稿共三十六页哦液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长第九页，讲稿共三十六页哦固体培养基：菌落固体培养基：菌落第十页，讲稿共三十六页哦（2 2）根据）根据化学成分化学成分分分n合成培养基合成培养基成分明确成分明确n天然培养基天然培养基成分不明确成分不明确第十一页，讲稿共三十六页哦（3 3）按培养基的用途分类）按培养基的用途分类 na a基础培养基（基础培养基（LBLB培养基）培养基）:含有一般细菌生长繁殖需要含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是上面提及的天的基本的营养物质。最常用的基础培养基是上面提及的天然培养基中的牛肉膏蛋白
6、胨培养基。然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。nb b营养培养基（加富培养基）营养培养基（加富培养基）:在基础培养基中加入某在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血液、血清或生长因子等。用以培养些特殊营养物质，如血液、血清或生长因子等。用以培养对营养要求高的微生物。对营养要求高的微生物。第十二页，讲稿共三十六页哦c c c c、选择培养基、选择培养基、选择培养基、选择培养基在培养基中加入某种化学物质在培养基中加入某种化学物质在培养基中加入某种化学物质在培养基中加入某种化学物质,以以以以抑制不需要的微生物的生长抑制不需要的微生物的生长抑制不需要的微生物的生长抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生
7、物促进所需要的微生物促进所需要的微生物促进所需要的微生物的生长的生长的生长的生长,如如如如n n尿素固体培养基可以分离以尿素为氮源的微生尿素固体培养基可以分离以尿素为氮源的微生尿素固体培养基可以分离以尿素为氮源的微生尿素固体培养基可以分离以尿素为氮源的微生物。物。物。物。d d d d、鉴别培养基、鉴别培养基、鉴别培养基、鉴别培养基在培养基中加入某种指示剂或化学在培养基中加入某种指示剂或化学在培养基中加入某种指示剂或化学在培养基中加入某种指示剂或化学药品药品药品药品,用以用以用以用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类的微生物,如如如如n n伊红和美蓝伊红和
8、美蓝伊红和美蓝伊红和美蓝,和大肠杆菌的代谢产物结合和大肠杆菌的代谢产物结合和大肠杆菌的代谢产物结合和大肠杆菌的代谢产物结合,使菌使菌使菌使菌落呈深紫色落呈深紫色落呈深紫色落呈深紫色,并带有金属光泽并带有金属光泽并带有金属光泽并带有金属光泽,可以用来鉴别大肠可以用来鉴别大肠可以用来鉴别大肠可以用来鉴别大肠杆菌杆菌杆菌杆菌第十三页，讲稿共三十六页哦二、无菌操作技术二、无菌操作技术1 1、概念、概念 无菌操作泛指无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有在培养微生物的操作中，所有防防止杂菌污染止杂菌污染的方法。的方法。无论是随后将要学到的无论是随后将要学到的倒平倒平板板、平板划线平板划线操作，还是操作，
9、还是平板稀释涂布法平板稀释涂布法，其操，其操作中的每一步都需要做到作中的每一步都需要做到“无菌无菌”，即防止杂，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。可能成功地培养微生物。第十四页，讲稿共三十六页哦2 2、无菌技术包括：、无菌技术包括：（1 1）对实验操作空间、操作者的衣着）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行和手进行 清洁和消毒清洁和消毒 ；（2 2）将培养器皿、接种用具和培养基）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行等器具进行 灭菌灭菌 ；（3 3）为避免周围微生物污染，实验操）为避免周围微生物污染，实验操作应在作应在
10、 酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近 进行；进行；（4 4）避免已灭菌处理的材料用具）避免已灭菌处理的材料用具与与 周围物品周围物品 相接触。相接触。第十五页，讲稿共三十六页哦（1 1）消毒定义：消毒定义：利用化学或物理方法，杀死利用化学或物理方法，杀死大部份致病大部份致病微生物微生物的过程。的过程。3 3、消毒与灭菌的概念及两者的区别、消毒与灭菌的概念及两者的区别 （2 2）灭菌的定义：）灭菌的定义：以化学或物理方法消灭以化学或物理方法消灭所有微生物所有微生物，包，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到达到完全无菌完全无菌的过程。的过程。灭菌与消毒技
11、术是微生物有关工作中最灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。普通也是最重要的技术。第十六页，讲稿共三十六页哦（3 3）具体无菌处理方法）具体无菌处理方法：（a a）消毒：）消毒：1 1 1 1）对接种室、接种箱或超净工作台先用）对接种室、接种箱或超净工作台先用）对接种室、接种箱或超净工作台先用）对接种室、接种箱或超净工作台先用 紫外线紫外线 进行进行进行进行物理消毒，然后用物理消毒，然后用物理消毒，然后用物理消毒，然后用 酒精酒精 增强消毒效果。增强消毒效果。增强消毒效果。增强消毒效果。2 2 2 2）实验操作者的双手使用）实验操作者的双手使用）实验操作者的双手使用）实验操作
12、者的双手使用 酒精酒精 进行消毒。进行消毒。进行消毒。进行消毒。3 3 3 3）日常生活经常用到的是煮沸消毒法。）日常生活经常用到的是煮沸消毒法。）日常生活经常用到的是煮沸消毒法。）日常生活经常用到的是煮沸消毒法。4 4 4 4）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法。）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法。）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法。）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法。第十七页，讲稿共三十六页哦 巴氏消毒法是法国科学家巴斯德创建的一种巴氏消毒法是法国科学家巴斯德创建的一种食品保鲜方法，最早是为了延长法国葡萄酒的保食品保鲜方法，最早是为了延长法国葡萄酒的保质期。这是一种能
13、将绝大多数的细菌杀死的低温质期。这是一种能将绝大多数的细菌杀死的低温消毒方法。消毒方法。牛奶消毒也用巴氏消毒法。牛奶消毒也用巴氏消毒法。具体措施：牛奶在具体措施：牛奶在62.862.8摄氏度下摄氏度下3030分钟。分钟。优点：最大限度地保持了牛奶的品质，颜色，优点：最大限度地保持了牛奶的品质，颜色，味道和营养。味道和营养。第十八页，讲稿共三十六页哦(b)(b)灭菌：灭菌：1 1）灼烧灭菌）灼烧灭菌 接种环、玻璃刮刀接种环、玻璃刮刀 试管口试管口2 2）高压蒸气灭菌：）高压蒸气灭菌：1kg/cm1kg/cm2 2压力、压力、121121、15min15min培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液
14、管、培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、三角三角三角三角刮刀、接种环、刮刀、接种环、刮刀、接种环、刮刀、接种环、镊子、无菌水、培养基镊子、无菌水、培养基镊子、无菌水、培养基镊子、无菌水、培养基高压蒸汽灭菌不会破坏培养基的营养成分。高压蒸汽灭菌不会破坏培养基的营养成分。第十九页，讲稿共三十六页哦三、分离细菌方法三、分离细菌方法1 1、划线分离法（、划线分离法（P20P20）（视频）（视频）1 1）灼烧接种环；）灼烧接种环；2 2）接种环接种环冷却后，蘸取带菌培养物冷却后，蘸取带菌培养物 3 3）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养 基上划线。基上划线。划线
15、的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。个菌落。第二十页，讲稿共三十六页哦第二十一页，讲稿共三十六页哦第二十二页，讲稿共三十六页哦2 2、涂布分离法、涂布分离法1)1)稀释菌液稀释菌液 （10-5 10-7倍）倍）用无菌吸管吸取用无菌吸管吸取用无菌吸管吸取用无菌吸管吸取1ml1ml1ml1ml细菌培养液加入另一个盛有细菌培养液加入另一个盛有细菌培养液加入另一个盛有细菌培养液加入另一个盛有9ml9ml9ml9ml无菌无菌无菌无菌水的试管中，混合均匀，以此制成
16、水的试管中，混合均匀，以此制成水的试管中，混合均匀，以此制成水的试管中，混合均匀，以此制成10101010-1-1-1-1倍的稀释液。倍的稀释液。倍的稀释液。倍的稀释液。3)3)涂布涂布 用无菌吸管取用无菌吸管取用无菌吸管取用无菌吸管取0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的稀释度不同的菌液，加在培养皿的稀释度不同的菌液，加在培养皿的稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将固体培养基上。再将固体培养基上。再将固体培养基上。再将玻璃刮刀玻璃刮刀玻璃刮刀玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，放在酒精灯火焰上灼烧，放在酒精灯火焰上灼烧，放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后
17、，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。到整个平面上。到整个平面上。到整个平面上。4)4)培养培养 将培养皿倒置，在将培养皿倒置，在将培养皿倒置，在将培养皿倒置，在37373737恒温箱中培养恒温箱中培养恒温箱中培养恒温箱中培养2448h2448h。第二十三页，讲稿共三十六页哦第二十四页，讲稿共三十六页哦第二十五页，讲稿共三十六页哦1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？他
18、外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒）需要消毒。第二十六页，讲稿共三十六页哦四、大肠杆菌的培养和分离四、大肠杆菌的培养和分离1 1、
19、大肠杆菌、大肠杆菌（1 1）特性：）特性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 （2 2）用途：）用途：基因工程技术中被广泛采用的工具基因工程技术中被广泛采用的工具2 2、培养：、培养：LB LB液体培养基液体培养基 扩大培养扩大培养 LBLB固体培养基固体培养基 分离分离第二十七页，讲稿共三十六页哦3 3、分离、分离培养基灭菌培养基灭菌制作平板制作平板扩大培养扩大培养划线分离划线分离菌种保存菌种保存将将LB液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌灭菌将灭菌后冷却到将灭菌后冷却到60的的LB固体培养基倒入固体培养基倒入灭菌过的培养皿中，制作平
20、面培养基灭菌过的培养皿中，制作平面培养基.将大肠杆菌从斜面接种到将大肠杆菌从斜面接种到LB液体培养基液体培养基中，中，然后在然后在37摇床中震荡培养摇床中震荡培养12h。用接种环取震荡培养后的菌液，并在用接种环取震荡培养后的菌液，并在固体培固体培养基养基上划线，然后将划线后的培养皿上划线，然后将划线后的培养皿倒置倒置与与37的恒温培养箱中培养的恒温培养箱中培养1224h，观察划线，观察划线末端的菌落生长情况末端的菌落生长情况.用接种环取单菌落，用划线法接种于斜面上，用接种环取单菌落，用划线法接种于斜面上，在在37的恒温培养箱中培养的恒温培养箱中培养24h，再放入，再放入4的冰箱中保存的冰箱中保
21、存。第二十八页，讲稿共三十六页哦倒平板技术倒平板技术倒平板技术倒平板技术第二十九页，讲稿共三十六页哦微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养第三十页，讲稿共三十六页哦微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养第三十一页，讲稿共三十六页哦菌种的保存菌种的保存接种到固体斜面培养基接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于，菌落长成后置于44冰箱保存。冰箱保存。第三十二页，讲稿共三十六页哦 1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到60 60 左右时，才能用来左右时，才能用来倒平板。
22、你用什么办法来估计培养基的温度？倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可进行倒平板了。度下降到刚刚不烫手时，就可进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。第三十三页，讲稿共三十六页哦3.3.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为皿底之间的部位，这个
23、平板还能用来培养微生物吗？为什么？什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第三十四页，讲稿共三十六页哦 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接可能存在的微生物污染培养物；每次
24、划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第三十五页，讲稿共三十六页哦感谢大家观看第三十六页，讲稿共三十六页哦