多底物酶促反应动力学讲稿.ppt-淘文阁

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1、关于多底物酶促反应动力学第一页，讲稿共五十页哦国际酶学委员会把酶六大类反应对应于底物的分类如下：第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学底物数酶分类作用类型占酶总数%1单底物异构酶A=B52单向单底物裂合酶A=B+C123假单底物水解酶A-B+H2O=A-OH+BH264双底物氧化还原酶AH2+B=A+BH227A2+B3+=A3+B2+基团转移A+BX=AX+B245三底物连接酶A+B+ATP=AB+ADP+Pi6A+B+ATP=AB+AMP+Ppi6.1 酶促反应按底物数的分类酶促反应按底物数的分类第二页，讲稿共五十页哦

2、单底物反应动力学指1,3,2的正向反应(约40%)其余多底物反应多为多底物反应(约60%)第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学 6.2 多底物反应基本命名法多底物反应基本命名法1963年由Cleland建议建立的1)按底物和酶结合次序为A、B、C表示2)按产物在酶上释放次序为P、Q、R表示3)稳态物（包括酶）以E、F、G表示非中心复合物：非中心复合物：指酶活性中心没有全部被底物占居ENAD+ENADHEAEP第三页，讲稿共五十页哦中心复合物中心复合物：指酶活性中心全部被底物占居命名：（EAB-EPQ）E:稳态酶，EAB和E

3、PQ:中心过渡态中间物第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第四页，讲稿共五十页哦1)有序顺序反应：xxxxxxx-底物、产物规定：反应历程OOOOOOO-酶存在形式第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学 EAB只能来自EA，而不是EB，A是一个领先底物（第一底物），B是随后底物（第二底物）有其顺序性。6.3 多底物酶促反应的表示方法、命名和举例多底物酶促反应的表示方法、命名和举例第五页，讲稿共五十页哦第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多

4、底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学 2.异形有序反应：酶的形式有改变，其速度方程不同于上述的速度方程。A BPQEEA(EAB-FPQ)FQF第六页，讲稿共五十页哦还有其酶促反应，中心过渡态络合物形成很慢，而分中心过渡态络合物形成很慢，而分解速度很快。解速度很快。被称为TheorellChance反应：即形成中间物的速度极慢而分解速度极快。ABPQEEAEQE 例子：NAD+乙醇乙醛NADHEE-NAD+E-NADHEE：为马肝醇脱氢酶第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第七页，讲稿共五十页哦为

5、什么有顺序性？被认为酶上与第二底物结合位点原先在酶结构内部(中间)，第二底物无法与之结合。由于第一底物结合改变了酶原有结构，暴露了酶结构上第二底物结合位点，使酶上第二个结合位点能够顺利地与B结合。A,B的结合是在酶的不同位点上。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第八页，讲稿共五十页哦2.随机顺序反应（随机顺序反应（Randan BiBi）：第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学 AABABEAB-EPQPQQPEEE-AE-BE-QE-P例子A第九页

6、，讲稿共五十页哦第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学3.乒乓机制：特点：特点：1不形成三元络合物，底物不同时与酶结合。2在全部底物与酶结合前，已经有一种放出来。由于底物、产物一进一出，所以像打乒乓一样，叫乒乓机制。APBQE(EAEP)F(EB-EQ)E第十页，讲稿共五十页哦谷丙转氨酶的作用：谷氨酸-酮戊二酸丙酮酸丙氨酸E(E-谷氨酸-F-酮戊二酸)F(F-丙酮酸-F-丙氨酸)E 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学 7.4 多底物动力学机制判别多

7、底物动力学机制判别：因为是双底物反应，所以需要加以判别多底物动力学机制属哪类机制，用三种方法。1)底物动力学方法2)产物抑制动力学方法3）同位素交换方法第十一页，讲稿共五十页哦底物动力学方法底物动力学方法：有序顺序机制推导法是用图象法推出。在稳态条件下推出的双底物反应速度公式：VABV=KmBA+KmAB+KiaKmB+AB是底物A与酶E结合的解离常数。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第十二页，讲稿共五十页哦解释公式中几个常数：解释公式中几个常数：多底物反应中，一底物的米氏常数可随着另一底物浓度变化而变化。KmAB：

8、指底物B浓度达饱和，底物A的米氏常数。在底物B低于饱和浓度时，测得随底物B而变化的A的各个Km，称为表观米氏常数KmKmBA:指底物A浓度达饱和，底物B的米氏常数。在底物A低于饱和浓度时，测得随底物A而变化的B的各个Km，称为表观米氏常数Km 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第十三页，讲稿共五十页哦1KmBAKmABKiaKmBAB=+vVmABVmABVmABVmAB 1 KmB KmA Kia KmB 1 =+v VmB VmA VmAB Vm 1KmA11当B=,=+VVmAVm 1KmB11当A=,=+VV

9、mBVm 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第十四页，讲稿共五十页哦具体实验方法：以A、B双底物反应作为例子，可将底物B固定在几个不同浓度下。固定在某一B浓度时，测不同A浓度对反应速度影响；也可固定A在某一浓度，测定不同B浓度对反应速度影响，再分别作双倒数图。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第十五页，讲稿共五十页哦Lineweaver-Burk双倒数作图：双倒数作图：当固定几个不同的B浓度或者几个不同的A浓度时，作1/A-1/v和1/B-1/

10、v的关系图，得到如下图。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第十六页，讲稿共五十页哦直线的交点在坐标的左侧，这是顺序机制的特点。直线的交点在坐标的左侧，这是顺序机制的特点。且交点可在横坐标的的上方、下方或者线上且交点可在横坐标的的上方、下方或者线上。1.在横坐标上面横坐标上面，表明固定底物B或A与酶结合不影响可变底物A或B的Km，即B或A浓度大小互不影响各自的Km,说明表观Kmapp=Km,KmA=Kia,KmB=Kib 2.在横坐标下方横坐标下方，表明可变底物A的表观Km随 B的增加而增加，KmAKia，KmBK

11、ib 3.在横坐标上方横坐标上方，表明可变底物A的表观Km随着B的增加而减少，KmA表明可变底物A的表观Km随着B增加而增加，KmAKia,KmBKib 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第十七页，讲稿共五十页哦且交点在1/A上截距可计算出来。设有两个固定浓度B1,B2,有两个相应的1/v1,1/v2,而且在交点处的截距相等第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第十八页，讲稿共五十页哦1KmBKmAKiaKmB1=+vVmBVmAVmABVm1

12、1KmAKiaKmBKmB=(+1+)v1VmAAB1B111KmAKiaKmBKmB=(+1+)v2VmAAB2B21/v1=1/v2Kia/AB1+1/B1)=(Kia/AB2+1/B2)Kia/A(1/B1-1/B2)=(1/B1-1/B2)1/A=-1/Kia 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第十九页，讲稿共五十页哦1/A=1/Kia斜率斜率,截距都可用此法取得。截距都可用此法取得。问题问题：从作图看出，从直线方程取得的是复合未知数，要用二次作图法求出KmA，KmB，Vm。斜率斜率=KsAKmB/Vm截距=Km

13、A/Vm截距=KmA/KmBKsA 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第二十页，讲稿共五十页哦1/V的截距斜率=KmB/Vm截距=1/KmB截距=1/Vm上面的方法只能判别顺序机制中的有序和有序和快速平衡的随机机制快速平衡的随机机制，但是无法区分有序和随机机制，只能通过其他方法来判别。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第二十一页，讲稿共五十页哦乒乓机制速度方程和动力学常数：乒乓机制速度方程和动力学常数：求解动力学方程用KingAltman图象法

14、推出。通过平衡学说推出的方程：经过双倒数后，1KmABKmBAAB=+vVmABVmABVmAB1KmAKmB1=+vVmAVmBVm 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第二十二页，讲稿共五十页哦1KmA11KmB=+(1+)y=ax+bvVmAVmB当A无穷大时变成单底物反应的米氏方程。上式一项可去除，与A无关，为单底物米氏方程。为y=ax+b的直线方法,其双倒数方程：1 KmB 1 1 当当A=,=+V Vm B Vm当B无穷大时变成单底物反应的米氏方程。上式一项可去除，与B无关，为单底物米氏方程。1 KmA 1

15、1 当当B=,=+V Vm A Vm 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第二十三页，讲稿共五十页哦乒乓机制动力学双倒数作图：用上述双倒数作图法，如能获得下图的用上述双倒数作图法，如能获得下图的两组平行线两组平行线，即乒乓机制的特征。，即乒乓机制的特征。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第二十四页，讲稿共五十页哦但有时当直线延长相当距离会出现相交而不能确定是否乒乓机制，也可能是顺序机制。如测定逆向反应的动力学也同样获得两组平行线，或证实其半反应中

16、有同位素交换即可获得进一步确定。双倒数作图法产生的复合函数，为两个未知数，只能通过二次作图，求KmA,KmB,Vm 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第二十五页，讲稿共五十页哦第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第二十六页，讲稿共五十页哦第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第二十七页，讲稿共五十页哦上述方法适用：顺序机制中有序机制及快速平衡的随机机制，但不能区别顺序机制

17、还是随机机制。需要进一步使用其他方法才能把它们区别开来。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第二十八页，讲稿共五十页哦产物抑制动力学方法是其中之一产物抑制动力学方法是其中之一产物抑制动力学方法是其中之一产物抑制动力学方法是其中之一。产物抑制：产物抑制：是鉴别多底物反应属有序、随机还是乒乓机制起重要作用。特点：方法简便。特点：方法简便。特点：方法简便。特点：方法简便。A+B=P+Q，采用几个P浓度或不加P，测每个P浓度或不加P时不同A（固定B）及不同B（固定A）对反应速度的影响，再以Q代替P，重复以上实验。最后以实验结果作

18、双倒数图，不同P时，1/A对1/v或1/B对1/v，及不同Q时，1/A对1/v或1/B对1/v作图。看看看看P P、QQ的抑制方式是竞争性还是非竞争性和反竞争性，的抑制方式是竞争性还是非竞争性和反竞争性，的抑制方式是竞争性还是非竞争性和反竞争性，的抑制方式是竞争性还是非竞争性和反竞争性，然后综合分析来判别。然后综合分析来判别。然后综合分析来判别。然后综合分析来判别。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第二十九页，讲稿共五十页哦Cleland分析大量动力学数据，总结两条重要规则：1.浓度变化的底物和一种形式的酶结合，抑制性

19、产物和另一种形式的酶结合。2.双倒数作图,只有纵坐标截距变化纵坐标截距变化。2.a)浓度变化的底物和抑制性产物都结合在同一个酶上。双倒数作图则产生斜率变化。则产生斜率变化。b)浓度变化的底物所结合的酶形式和抑制性产物结合的酶形式间可在酶的反应历程中通过可逆变化而互相联接。双倒数作图产生斜产生斜率变化率变化。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第三十页，讲稿共五十页哦Cleland分析大量动力学数据，总结两条重要规则两条重要规则：应用Cleland方法方法的关键：看产物是否抑制和抑制方式，取决于抑制性产物是P或Q中的哪一个

20、？如浓度变化的底物是那一个，A或B？同样，与另一个固定浓度的底物是否饱和有关。实验结果与判断结果一致。全部实验结果与判断结果一致。全部结果列表于下。结果列表于下。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第三十一页，讲稿共五十页哦判别乒乓机制问题：APBQE(EAEP)F(EB-EQ)EGlu-酮戊二酸丙酮酸AlaE(E-Glu-F-酮戊二酸)F(F-丙酮酸-F-Ala)E 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第三十二页，讲稿共五十页哦第六章第六章第六

21、章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第三十三页，讲稿共五十页哦Cleland判断有序和随机机制，判断有序和随机机制，其反应历程如下其反应历程如下：第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第三十四页，讲稿共五十页哦第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第三十五页，讲稿共五十页哦规律总结如下：规律总结如下：1 A固定底物，固定底物，B变化底物，变化底物，p=0,Q=常数常数2 A固定底物，固定底物，

22、B变化底物，变化底物，p=常数常数,Q=01 B固定底物，固定底物，A变化底物，变化底物，p=0,Q=常数常数2 B固定底物固定底物,A变化底物，变化底物，p=常数常数,Q=0 第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第三十六页，讲稿共五十页哦3.同位素交换法同位素交换法下面简单阐述同位素交换法在研究多底物动力学上的应用。先举一个例子：蔗糖磷酸化酶葡萄糖-1-P+果糖=蔗糖+H3PO4这个反应是可逆反应。在没有果糖时，G-1-P可以与32P标记的KH232PO4发生交换，表明有下面的反应：Suc磷酸化酶G-1-P+32Pi=

23、G-1-32P+Pi研究认为，这种现象是蔗糖磷酸化酶的乒乓机制造成,转移葡萄糖基。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第三十七页，讲稿共五十页哦第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第三十八页，讲稿共五十页哦反应1没有果糖，加入G-1-32P，产生32P反应2如果有EG存在，没有G-1-P，可以通过2方式的Fru发生交换。下面是一个通式：第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第

24、三十九页，讲稿共五十页哦当一个底物不存在，另一个底物可与其相应产物发生同位素交换，这是乒乓机制的特点。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学标记的被转移的基团G外，Y或者Gy不存在，标记的X和GX一样可以发生同位素交换；当没有X或者GX时，标记的Y和GY也可以发生同位素交换。也可区分有序和随机机制也可区分有序和随机机制同位素交换对于顺序机制来说，必须两个底物都结合到酶的中心复合物上。所以一个底物不存在，另一个底物就不可能和产物发生同位素交换。这就是与乒乓机制不同的地方。且可区分有序和随机机制第四十页，讲稿共五十页哦方法

25、：在酶促反应达到化学平衡情况下，加入不足以改变平衡的极少量放射性底物，由于化学平衡是一个动态平衡，虽然底物的浓度、产物的浓度保持恒定，但是加入的标记底物必定有变为产物的可能性。加入标记物测混合物中标记产物放射性强度,算出同位素交换速度keq=kf/kr=PQ/AB再测定不同非标记底物浓度对交换速度的影响看高浓度的非标记底物能否抑制标记底物的同位素交换。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第四十一页，讲稿共五十页哦可以看出是否是有序还是随机机制#为保持两者比值恒定，改变任何一个非标记底物的同时，也要改变另一个非标记底物的浓

26、度。KfPQKeq=KrAB正方向v=KfAB，反方向v=KrPQ在有序机制中，一个基团转移的有序双双反应，其底物与酶的结合和产物放出有四种可能性。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第四十二页，讲稿共五十页哦第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学有序机制：四种可能可以写成如下第四十三页，讲稿共五十页哦如标记在X上，形成X*或者GX*，可引起X*和GX或GX*和X的同位素交换，用GX*=X*来表示。如标记在Y上，可有Y*=GY*的交换，标在G上，可

27、有G*X和GY*的交换。所以有内内、外外、内外三种途径GXYE=EGX=(EGXY=EXGY)=EGYX如标记在X*-GX*，Y*-GY*，*G-GX(*GY)第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第四十四页，讲稿共五十页哦举一个有序机制例子。如以乳酸、丙酮酸为浓度变化而比值恒定的非标记底物对（内-内），测定这一对不同浓度的内底物对外底物对（NAD+-NADH）间发生的同位素交换和内底物对之间的同位素交换情况。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第四

28、十五页，讲稿共五十页哦第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学结果：高浓度乳酸-丙酮酸，可抑制NAD+-NADH（外-外）之间同位素交换速度（以平衡反应速度表示），以平衡反应速度表示），却不抑制乳酸-丙酮酸（内-内）之间的同位素交换。这就是有序机制的证明。GXYE=EGX=(EGXY=EXGY)=EX=EGyX第四十六页，讲稿共五十页哦GXYE=EGX=(EGXY=EXGY)=EX=EGyX1上述反应达到平衡2加标记的X*或GX*,再测GX*=X*交换3当非标记的GX、X浓度恒定，而非标记的Y、GY为低浓度时，有利于标记的

29、EGX*或EX*变成标记的中心复合物标记的中心复合物（EGX*Y、EX*GY）后者为有序机制中必经中间物（即三元络合物），所以促进GX*、X*的交换4当Y、GY高浓度时，EGX、EX明显下降，并降低E的浓度，使EGX、EX、E浓度下降，甚至到0，这时GX*、X*就不能形成中间三元络合物，GX*、X*间同位素交换降低，结果完全被抑制。第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第四十七页，讲稿共五十页哦结论：结论：高浓度非标记内底物对(Y、GY)抑制标记外底物对(X*或GX*)间同位素交换，即有序机制有序机制。第六章第六章第六章第

30、六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学同理，加入GY*,测定G*Y=G*X，而改变非标记GX、X浓度，即只降低E而不降低EGX、EX浓度，所以也不影响G*X和G*Y的交换。有序机制只能通过上述四条途径中的一条有序机制只能通过上述四条途径中的一条随机机制随机机制：1.上述四条途径都可以走，一条途径的内底物是另一条的内底物，无内外之分2.所以不受任何底物对的抑制。第四十八页，讲稿共五十页哦第六章第六章第六章第六章多底物多底物多底物多底物酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学第四十九页，讲稿共五十页哦2022/10/2感谢大家观看第五十页，讲稿共五十页哦

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