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1、血红蛋白的提取与分离第1页，此课件共39页哦 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1.1.1.1.主要概念：主要概念：主要概念：主要概念：凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.2.2.2.主要原理：主要原理：主要原理：主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用
2、机理缓冲溶液的组成和作用机理3.3.3.3.课题重点：课题重点：课题重点：课题重点：凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法 学习目标学习目标第2页，此课件共39页哦(一）蛋白质一）蛋白质占细胞干重的占细胞干重的5050以上，细胞中含量最多的有机物。以上，细胞中含量最多的有机物。2.2.组成元素组成元素C C、HH、OO、N N1.1.含量含量3 3.相对分子质量相对分子质量高分子化合物高分子化合物氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别。空间结构千差万别。4.4.蛋白质结构的多样性蛋白质结构的多样
3、性第3页，此课件共39页哦(二）蛋白质的提取二）蛋白质的提取1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小分子的形状和大小、所带、所带电荷的性电荷的性质和多少质和多少、溶解度溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。分离不同种类的蛋白质。第4页，此课件共
4、39页哦 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。（三）（三）凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2.2.凝胶：凝胶：根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大的大 小，利用小，利用具有具有网状结构网状结构的凝胶的的凝胶的分子筛分子筛作用，来进行分离。作用，来进行分离。1.1.概念：概念：3.3.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理分子筛效应：分子筛效应：当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对
5、分子量较小的相对分子量较小的蛋蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢移动速度较慢;而而相对分子量相对分子量较大的较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移移动速度较快动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。第6页，此课件共39页哦4.4.凝胶色谱法分离蛋白质的凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程原理和具体过程
6、第7页，此课件共39页哦第8页，此课件共39页哦 在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱外加少量强酸或强碱的影的影响使原来溶液响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混合溶液。不变的混合溶液。能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，维持的影响，维持PHPH基基本不变。本不变。通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使使用比例用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PH
7、PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察便于观察(红色红色红色红色)和科学研究和科学研究(活性活性活性活性)。（四）缓冲溶液（四）缓冲溶液 1.1.概念概念:2.2.作用作用:3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:4.4.在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是:_,:_,其目的是其目的是:磷酸缓冲液磷酸缓冲液第9页，此课件共39页哦（五）电泳（五）电泳（五）电泳（五）电泳1.1.概念概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理原理在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电在电场的作用下
8、，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。极移动。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的在一定的PHPH下，这些基团会下，这些基团会带上正电或负电带上正电或负电。第10页，此课件共39页哦电泳利用了待分离样品中各种分子电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异带电性质的差异以及以及分子本身的大分子本身的大小小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。的分离。第11页，此课件共39页哦3.3.类型类型琼脂糖凝胶电泳
9、和聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。4.4.实例实例 由单体丙烯酰胺和交联剂由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺在甲叉双丙烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的作用下聚合交联成三维网状结构三维网状结构的凝胶。的凝胶。十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。应用应用聚丙稀酰胺凝胶聚丙稀酰胺凝胶第12页，此课件共39页哦蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少静电荷的多少以以及及分子的大小分子的大小等因素。
10、等因素。原理原理 SDS SDS作用作用为了消除为了消除静电荷对迁移率的影响静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入SDSSDS。第13页，此课件共39页哦样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤第14页，此课件共39页哦血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（9090）两个两个a a肽链肽链两个两个 肽链肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团成分成分(1)(1)(1)(1)血液组成血液组
11、成血液组成血液组成第15页，此课件共39页哦第16页，此课件共39页哦 每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一一分子氧或一分子二氧化碳，分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而呈红色。而呈红色。组成及作用组成及作用 猪、牛、羊或其他猪、牛、羊或其他脊椎动物脊椎动物的血液来分离血红蛋白。的血液来分离血红蛋白。选材选材第17页，此课件共39页哦(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤洗涤红细胞目的洗涤红细胞目的 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过
12、少。洗涤次数过少。洗涤操作洗涤操作A.A.采集血样采集血样B.B.低速短时间离心低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果）一同沉淀达不到分离的效果）（二）操作过程（二）操作过程第18页，此课件共39页哦采集得到哺乳动物的血采集得到哺乳动物的血第19页，此课件共39页哦初次离心后的结果初次离心后的结果第20页，此课件共39页哦3次洗涤后的结果第21页，此课件共39页哦C.C.吸取血浆：上层透明的黄色血浆；吸取血浆：上层透明的黄色血浆；D.D.盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9
13、0.9的氯化钠溶液洗涤；的氯化钠溶液洗涤；E.E.低速离心（低速短时间）；低速离心（低速短时间）；F.F.重复重复4 4、5 5步骤三次，直至上步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。清液中已没有黄色，表明洗涤干净。第22页，此课件共39页哦(2)(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放 加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积，原血液体积，再加再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置于磁力搅置于磁力搅拌器上充分搅拌拌器上充分搅拌1010分钟分钟（加速细胞破裂）（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。磁力搅拌器磁力搅拌器第23页，此课件共39页哦搅拌器转子搅拌器转子第24页，此
14、课件共39页哦搅拌器正在工作搅拌器正在工作第25页，此课件共39页哦(3)(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液 将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min2000r/min的的速度离心速度离心10 min10 min。第26页，此课件共39页哦甲苯层（无色透明）甲苯层（无色透明）白色薄层固体白色薄层固体红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次第27页，此课件共39页哦 用用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液
15、体层的红色透明液体 分离：分离：第28页，此课件共39页哦取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml300ml的物的物质的量浓度为质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小小时。时。(4)(4)透析透析除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。过程过程透析目的透析目的第29页，此课件共39页哦第30页，此课件共39页哦2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作（1 1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作第31页，此课件共39页哦（2 2
16、）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择凝胶的选择A A、材料、材料“GG”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.57.5克克B B、代表意义：、代表意义：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）第32页，此课件共39页哦 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶凝胶浸泡于浸泡于蒸馏水或洗蒸馏水或洗脱液脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶的前处理凝胶的前处理凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装
17、填方法A A、固定、固定B B、装填、装填将色谱柱处置固定在支架上将色谱柱处置固定在支架上 将凝胶悬浮液将凝胶悬浮液一次性的一次性的装填入色谱柱内，装填时装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱轻轻敲动色谱柱，柱，使使凝胶填装均匀。凝胶填装均匀。第33页，此课件共39页哦第34页，此课件共39页哦样品加入与洗脱样品加入与洗脱正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动。第35页，此课件共39页哦开始进行层析开始进行层析第36页，此课件共39页哦收集得到的纯化后的蛋白收
18、集得到的纯化后的蛋白第37页，此课件共39页哦思考：思考：让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。1.1.在血红蛋白的整个过程中用磷酸缓冲液处理的目的是什么？在血红蛋白的整个过程中用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2.2.与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这对你进行蛋白质得分离与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这对你进行蛋白质得分离有什么意义？有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程颜色来判断什么
19、时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。非常直观，大大简化了实验操作。第38页，此课件共39页哦血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。3.3.描述血红蛋白分离的完整过程。描述血红蛋白分离的完整过程。第39页，此课件共39页哦