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1、重组导入受体细胞第1页，此课件共23页哦1.DNA导入细菌的方法导入细菌的方法2.DNA导入酵母的方法导入酵母的方法3.DNA导入植物细胞的方法导入植物细胞的方法4.DNA导入动物细胞的方法导入动物细胞的方法第2页，此课件共23页哦转化转化转染转导接合转移1.重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞（1）大肠杆菌）大肠杆菌重组质粒重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为达的过程称之为转化（转化（transformation)。转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且
2、适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。化学诱导感受态法化学诱导感受态法 电转化电转化感受态细胞（感受态细胞（competence cell）是指处于能吸收周围环境中是指处于能吸收周围环境中DNA分子分子的生理状态的细胞。的生理状态的细胞。第3页，此课件共23页哦I.化学诱导感受态法化学诱导感受态法 原理：原理：E.coli 细胞处于细胞处于0，CaCl2的低渗溶液中，细的低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜形成液晶结构，转化混合物中胞膨胀成球形，细胞膜形成液晶结构，转化混合物中的的DNA形成抗形成抗DNase的羟基的羟基-钙磷酸
3、复合物粘附于细胞钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经表面，经42短时间热冲击处理，液晶结构被扰动而短时间热冲击处理，液晶结构被扰动而使细胞膜出现间隙，促使使细胞膜出现间隙，促使DNA复合物进入细胞，在丰复合物进入细胞，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。培养基平板上，可选出所需的转化子。第4页，此课件共23页哦 Ca Ca2+2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到处理的感受态细胞，其转化率一般能达到10106
4、610108 8转转化子化子/gDNAgDNA。化学法简单、快速、稳定、重复性好，感受态细菌可以在化学法简单、快速、稳定、重复性好，感受态细菌可以在-7070保存，但转化保存，但转化DNADNA大小有限制，不同物种需要不同的诱大小有限制，不同物种需要不同的诱导方法。导方法。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),(R,M),它可以容忍外源它可以容忍外源DNADNA分子进入体内并稳定地遗传分子进入体内并稳定地遗传给后代。给后代。第5页，此课件共2
5、3页哦培养大肠杆培养大肠杆菌菌OD600至至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心收集菌离心收集菌用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬4离心收集菌离心收集菌4离心收集菌离心收集菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬感受态细胞制备感受态细胞制备 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌，且制备感受态菌必须使用对数生长期的菌，且必须在冰冷的条件下制备必须在冰冷的条件下制备。CaCl2处理充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。处理充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在储存感受态菌要在
6、-70以下，使用感受态菌时必须迅速融化，融化后一以下，使用感受态菌时必须迅速融化，融化后一般不能再次冻存使用般不能再次冻存使用第6页，此课件共23页哦10ng质粒质粒DNA100 L感受态菌感受态菌冰上混合，冰上混合，静置静置10分钟分钟42C 1分钟分钟冰浴冰浴2min，加，加入入1mL LB培养培养基基37摇摇1小时小时10-100 L转化液涂转化液涂含抗菌素的平板含抗菌素的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA转化过程转化过程第7页，此课件共23页哦II.II.电转化电转化 可以转化大分子可以转化大分子DNADNA（50Kb)50Kb)，胞壁较厚的物种需要制备原生质体后电，胞壁较厚的物种需要制
7、备原生质体后电转化转化电穿孔转化法最早用于将电穿孔转化法最早用于将DNA导入真核细胞，导入真核细胞，1988年，年，Dower等人等人成功地应用该法进行了大肠杆菌的转化。成功地应用该法进行了大肠杆菌的转化。原理原理:利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electroporation),形成可逆的瞬间通道，从而促进外源形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效的有效吸收。吸收。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每微克参数的影响，
8、通过优化这些参数，每微克DNA可以得到可以得到1091010转化转化子。子。电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会提高，但受体细胞存电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会提高，但受体细胞存活率会降低。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致活率会降低。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50%70%细菌死亡时，转化效率达到最高。细菌死亡时，转化效率达到最高。第8页，此课件共23页哦LB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，4离心离心集菌集菌冰冷的水重悬冰冷的水重悬菌体菌体4 离心集菌离心集菌冰冷的水重悬菌冰冷的水重悬菌体体4 离心收集离心收集
9、菌体菌体少量冰冷的水重少量冰冷的水重悬悬细胞分装成细胞分装成50 L电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质粒质粒DNA混合、冰浴混合、冰浴加入加入1mLSOC培培养液养液37C中速震荡中速震荡60分分钟钟涂布涂布转化转化细胞制备：细胞制备：电转化：电转化：第9页，此课件共23页哦用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备要容易，当细菌生长用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备要容易，当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗低盐缓冲液充分清洗降低细胞降低细胞悬浮液的离子强度，并用
10、悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为甘油重悬细胞，使其细胞浓度为31010个个ml，分装，在干冰上速冻后置于，分装，在干冰上速冻后置于-70贮存。每小份细胞融解后即贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达可用于转化，有效期达6个月以上个月以上一般电穿孔转化须一般电穿孔转化须在低温下（在低温下（04）进行）进行，转化效率要比在室温下操，转化效率要比在室温下操作提高约作提高约100倍。倍。由于细菌细胞相对较小，因此与由于细菌细胞相对较小，因此与 DNA导入真核细胞时相比，大肠杆导入真核细胞时相比，大肠杆菌的电转化要求有更高的场强，而反应体积则相对要小，以菌的电转化要求有更高
11、的场强，而反应体积则相对要小，以2040l为宜。为宜。第10页，此课件共23页哦磷酸钙磷酸钙-DNA共沉淀法共沉淀法：简称磷酸沉淀法，属于转染法，能把外源基：简称磷酸沉淀法，属于转染法，能把外源基因与因与噬菌体噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，但转染效率的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，但转染效率远远不如体外包装法（转导）。远远不如体外包装法（转导）。HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和酸钙和DNA的沉淀。的沉淀。细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，几乎的能力，几
12、乎所有的双链所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞。都可以通过这种方法导入细胞。对数生长期的细菌和重组对数生长期的细菌和重组噬菌体磷酸钙噬菌体磷酸钙-DNA沉淀混合，先置沉淀混合，先置0冰浴冰浴3060分钟，分钟，再放再放45中水浴中水浴5分钟，使细菌迅速发生热休克，以利外源分钟，使细菌迅速发生热休克，以利外源DNA的进入。随后涂布的进入。随后涂布琼脂平皿，培养后观察并选取含有重组琼脂平皿，培养后观察并选取含有重组DNA的细菌。的细菌。转染转染磷酸钙磷酸钙-DNA共沉淀法共沉淀法HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸羟乙基哌嗪乙磺酸;N-(2-羟乙基羟乙基)哌嗪哌嗪-N-2-乙烷磺酸乙烷磺酸 第
13、11页，此课件共23页哦第12页，此课件共23页哦（2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌 Spizzen Spizzen感受态转化感受态转化 原生质体转化原生质体转化 电转化电转化枯草芽孢杆菌可以形成自然感受态，在对数生长后期由信息素激枯草芽孢杆菌可以形成自然感受态，在对数生长后期由信息素激发一种二元信号传导系统的调节，激活一系列感受态相关基因的发一种二元信号传导系统的调节，激活一系列感受态相关基因的表达。表达。Spizzen Spizzen 在在19581958年发现这一现象并发展了感受态转化的方法年发现这一现象并发展了感受态转化的方法.基本步骤：基本步骤：细胞在较为丰富的培养基中培养至对数生长后
14、期，然细胞在较为丰富的培养基中培养至对数生长后期，然后转接到营养贫瘠的培养基中，可使其形成感受态（一般非常短后转接到营养贫瘠的培养基中，可使其形成感受态（一般非常短暂）暂）I.SpizzenI.Spizzen感受态转化感受态转化第13页，此课件共23页哦在枯草芽孢杆菌中，转化的过程包括外源在枯草芽孢杆菌中，转化的过程包括外源DNA的吸附、断裂、吸收降解和重组的吸附、断裂、吸收降解和重组（或形成独立的复制单元，如质粒）几个阶段：（或形成独立的复制单元，如质粒）几个阶段：吸附：吸附：这一过程发生在感受态细胞的表面，是一个非共价结合的过程。在枯草这一过程发生在感受态细胞的表面，是一个非共价结合的过程
15、。在枯草芽孢杆菌的感受态细胞表面平均约有芽孢杆菌的感受态细胞表面平均约有50个个DNA吸附位点，这些位点对双链吸附位点，这些位点对双链DNA有非常大的亲和力有非常大的亲和力双链双链DNA的断裂的断裂：在吸附发生后的：在吸附发生后的30秒内，秒内，DNA被核酸酶随机断裂，其平均长被核酸酶随机断裂，其平均长度约为度约为7kb。DNA的降解和吸收：的降解和吸收：在断裂发生之后，双链在断裂发生之后，双链DNA的一条链被完全降解，另一条链穿的一条链被完全降解，另一条链穿过细胞壁和细胞膜后进入胞内。过细胞壁和细胞膜后进入胞内。合成双链并环化：合成双链并环化：变成双链后依靠同源区环化。自身无同源区段（重复序
16、列）的变成双链后依靠同源区环化。自身无同源区段（重复序列）的DNA，转化效率极低。对于质粒单体，需要体外酶切、连接成质粒多聚体才能高，转化效率极低。对于质粒单体，需要体外酶切、连接成质粒多聚体才能高效转化。效转化。103105个个/g DNA缺点：缺点：对于生长差别较大的菌株需要重新确定转接培养时间；酶切后质粒无法转化。对于生长差别较大的菌株需要重新确定转接培养时间；酶切后质粒无法转化。由于需要借助同源重组来重新环化质粒，对于由于需要借助同源重组来重新环化质粒，对于recArecA缺陷菌株转化效率非常低缺陷菌株转化效率非常低第14页，此课件共23页哦 原理：用溶菌酶等处理消化部分细胞壁，制备原
17、生质体，在原理：用溶菌酶等处理消化部分细胞壁，制备原生质体，在PEP(聚乙二醇）等促溶剂作用下使细胞膜形成小孔，胞外聚乙二醇）等促溶剂作用下使细胞膜形成小孔，胞外DNA通过小孔通过小孔进入胞内进入胞内,然后在再生培养基上筛选转化子。然后在再生培养基上筛选转化子。II.原生质体转化原生质体转化 优点：优点：不需要质粒有自身同源区，因此对于单体质粒的转化效率也很高不需要质粒有自身同源区，因此对于单体质粒的转化效率也很高（106个个/微克微克DNA）缺点：缺点：转化效率随质粒分子量变大而减小；部分抗生素在再生培养基失去筛选转化效率随质粒分子量变大而减小；部分抗生素在再生培养基失去筛选作用（例如卡那霉
18、素在作用（例如卡那霉素在DM3培养基中无效）培养基中无效）不适用于革兰氏阴性菌不适用于革兰氏阴性菌III.电转化电转化 原理、步骤和大肠杆菌电转化一样，但转化效率很低原理、步骤和大肠杆菌电转化一样，但转化效率很低(106个个/微克微克DNA)第15页，此课件共23页哦2.酵母菌的转化方法酵母菌的转化方法（1）原生质体转化法）原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在转化法。在Ca2+和和PEG的存在下，转化细胞可达存活的原生质的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的球总数的1%-5%。但是操作周期长（再生需。
19、但是操作周期长（再生需46天），而且转天），而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。化效率受到原生质再生率的严重制约。酵母原生质转化法一个显著特点是，一个受体细胞可同时接酵母原生质转化法一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质占转化子总数的纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质占转化子总数的25%-33%。酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因插入外源基因的酵母载体的酵母载体PEG（聚乙二醇）（聚乙二醇）CaCl2使细胞壁具有通使细胞壁具有通透性，允许透性，允许DNA进入。进入。转化转化第16页，此课件共23页哦（2）碱
20、金属离子介导的酵母菌转化）碱金属离子介导的酵母菌转化 酿酒酵母经碱金属离子（如酿酒酵母经碱金属离子（如Li+等）、等）、PEG热休克处理后，也可高热休克处理后，也可高效吸收质粒效吸收质粒DNA，而且具有以下特性：，而且具有以下特性：吸收线性吸收线性DNA的能力明显大于环状的能力明显大于环状DNA，二者相差，二者相差80倍倍,共转化现象较共转化现象较为罕见。为罕见。（3）电转化法）电转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较大的负作用。，它对受电击的细胞
21、具有较大的负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率高达且转化率高达105转化子转化子/gDNA。酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的酵母载体插入外源基因的酵母载体感受态感受态40%PEG 4000第17页，此课件共23页哦其他导入技术：其他导入技术：接合转移接合转移在质粒转移过程中，利用供体细胞可与受体细胞发生接合作用而将在质粒转移过程中，利用供体细胞可与受体细胞发生接合作用而将质粒导入受体细胞的方法，供体细胞和受体细胞可以为不同微生物：质粒导入受体细胞的方法，供体细胞和受体细胞
22、可以为不同微生物：例如大肠杆菌和链霉菌例如大肠杆菌和链霉菌供体细胞含有辅助质粒，辅助质粒为可转供体细胞含有辅助质粒，辅助质粒为可转移的接合型质粒，含有与接合转移有关的移的接合型质粒，含有与接合转移有关的基因（基因（tratra），这类质粒一般也是广宿主质粒。），这类质粒一般也是广宿主质粒。而重组质粒一般不含而重组质粒一般不含tratra基因，但有基因，但有bombom基因，基因，可以被诱动转移；一般是穿梭载体，保证在供可以被诱动转移；一般是穿梭载体，保证在供体菌（体菌（E.coliE.coli）和受体菌（例如根瘤菌或链霉菌）和受体菌（例如根瘤菌或链霉菌）中均能复制。中均能复制。将含辅助质粒的细
23、胞、含重组质粒的供体细将含辅助质粒的细胞、含重组质粒的供体细胞与受体细胞三者共同培养，便可实现重组胞与受体细胞三者共同培养，便可实现重组质粒导入受体细胞，称为质粒导入受体细胞，称为三亲杂交接合转移三亲杂交接合转移第18页，此课件共23页哦三亲杂交接合转移三亲杂交接合转移重组质粒从大肠杆菌转重组质粒从大肠杆菌转移到土壤农杆菌移到土壤农杆菌第19页，此课件共23页哦叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆菌土壤农杆菌浸泡浸泡看护培养基看护培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗3.导入植物细胞导入植物细胞（1）叶盘法（叶盘法（leaf disk)第20页，此课件共23页哦植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维
24、素酶和果纤维素酶和果胶酶胶酶DNA混合入电击缓混合入电击缓冲液冲液1-2kV,3-25 F电击电击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化（2）.电击法（电击法（electroporation)第21页，此课件共23页哦又称又称高速微型子弹射击法（高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)以冷压缩气体为动力将吸附以冷压缩气体为动力将吸附DNA的金属微粒打入细胞内，完成的金属微粒打入细胞内，完成基因转移，适合各种细胞（微生物、动植物）。基因转移，适合各种细胞（微生物、动植物）。快速、简便、安全、高效。还可以导入细胞（如内生菌）、蛋快速、简便、安全、高效。还可以导入
25、细胞（如内生菌）、蛋白、细胞器、细胞核等。白、细胞器、细胞核等。DNA1.2 m钨弹头钨弹头吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入（3）.基因枪法（基因枪法（gene gun）第22页，此课件共23页哦原理（略）原理（略）4.导入动物细胞导入动物细胞（1）.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法在磷酸钙在磷酸钙-DNA沉淀物种，两种物理上毫无联系的沉淀物种，两种物理上毫无联系的DNA分子混合物往分子混合物往往能侵染同一个细胞往能侵染同一个细胞该方法经常用于两种该方法经常用于两种DNA同时转化一个宿主细胞的过程同时转化一个宿主细胞的过程(也称为也称为共转化）共转化）。在基因工程实验中。在基因工程实验中,时常需要用没有选择表型的质粒作时常需要用没有选择表型的质粒作转化转化,然后在宿主菌中筛选出这种质粒。这时可采用有选择标记的另然后在宿主菌中筛选出这种质粒。这时可采用有选择标记的另一质粒与之共转化一质粒与之共转化,通过后者进行筛选。这项技术常用于哺乳类细胞的通过后者进行筛选。这项技术常用于哺乳类细胞的实验，效率高达实验，效率高达15%。第23页，此课件共23页哦