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1、关于单基因病诊断详解第一页，讲稿共五十八页哦遗传病的诊断遗传病的诊断(Diagnosis of Hereditary Disease)可以分为产前诊断、症状前诊断和现可以分为产前诊断、症状前诊断和现症病人诊断三种类型。遗传病的诊断是开展遗症病人诊断三种类型。遗传病的诊断是开展遗传咨询和防治工作的基础。传咨询和防治工作的基础。第二页，讲稿共五十八页哦遗传病的诊断方法遗传病的诊断方法普遍性诊断原则普遍性诊断原则 是指与一般疾病相同的诊断方是指与一般疾病相同的诊断方法，即通过对病史、症状、体症、实验室检查和其他法，即通过对病史、症状、体症、实验室检查和其他诊断技术所获得的资料进行归纳分析，同时排除拟
2、诊诊断技术所获得的资料进行归纳分析，同时排除拟诊疾病，然后确立诊断。疾病，然后确立诊断。遗传学的特殊诊断遗传学的特殊诊断 主要是指染色体检查、性染色主要是指染色体检查、性染色质检查、特异性酶和蛋白质以及代谢中间产物的生化分质检查、特异性酶和蛋白质以及代谢中间产物的生化分析、析、DNARNA以及家系分析、皮肤纹理分析、携带者的以及家系分析、皮肤纹理分析、携带者的检出等等。检出等等。第三页，讲稿共五十八页哦一一 病史、家族史和体症病史、家族史和体症1.病史病史由于遗传病多有家族聚集现象，所以病史由于遗传病多有家族聚集现象，所以病史的采集的准确性非常重要。除关注一般病史外，的采集的准确性非常重要。除
3、关注一般病史外，主要着重于患者的家族史、婚姻史和生育史。主要着重于患者的家族史、婚姻史和生育史。第四页，讲稿共五十八页哦(1)家族史家族史 2.家族史家族史采集家族史时应该特别注意因患者或代述人采集家族史时应该特别注意因患者或代述人由于文化程度、记忆能力、思维能力、判断能力以由于文化程度、记忆能力、思维能力、判断能力以及精神状态而使症状、体症的描述不够准确、全面及精神状态而使症状、体症的描述不够准确、全面，或者因为患者、代述人提供假材料等都会影响家，或者因为患者、代述人提供假材料等都会影响家族史的准确性。族史的准确性。着重了解结婚年龄、次数、配偶健康状况以着重了解结婚年龄、次数、配偶健康状况以
4、及是否近亲结婚等。及是否近亲结婚等。第五页，讲稿共五十八页哦 3.生育史生育史着着重重了了解解生生育育年年龄龄、子子女女数数目目、健健康康状状况况、有有无无流流产产、死死产产、早早产产史史等等。如如有有新新生生儿儿死死亡亡或或患患儿儿，则则除除询询问问父父母母及及家家庭庭成成员员上上述述情情况况外外，还还应应该该了了解解患患儿儿有有无无产产伤伤、窒窒息息，妊妊娠娠早早期期母母体体有有无无患患病病毒毒性性疾疾病病和和接接触触过过致致畸畸因因素素，如如服服用用过过致致畸畸药药物物或或接接触触过过电电离离辐辐射射或或有有害害化学物质等。化学物质等。第六页，讲稿共五十八页哦4.症状和体症症状和体症遗传
5、病除和其他疾病有相同的体症之外，往往有其遗传病除和其他疾病有相同的体症之外，往往有其本身的本身的特异性症候群特异性症候群，为诊断提供初步的线索。，为诊断提供初步的线索。苯丙酮尿症：苯丙酮尿症：智力发育不全，特殊腐臭尿液智力发育不全，特殊腐臭尿液半乳糖血症：半乳糖血症：智力发育不全伴有白内障，肝硬智力发育不全伴有白内障，肝硬化。化。第七页，讲稿共五十八页哦1.由于大多数遗传病在婴儿和儿童时期即可有体症由于大多数遗传病在婴儿和儿童时期即可有体症和症状出现，故除观察外貌特征外，还应该注意和症状出现，故除观察外貌特征外，还应该注意身体发育情况：诸如体重增长速度，智力增进、身体发育情况：诸如体重增长速度
6、，智力增进、性器官以及第二性症发育、肌肉的张力、婴儿啼性器官以及第二性症发育、肌肉的张力、婴儿啼哭的声音等情况。哭的声音等情况。2.由于有遗传异质性，若欲作出病因诊断，单凭体由于有遗传异质性，若欲作出病因诊断，单凭体症、症状资料是非常困难的，一定要进行必要的症、症状资料是非常困难的，一定要进行必要的实验室检查。实验室检查。诊断中应该注意的问题诊断中应该注意的问题第八页，讲稿共五十八页哦二、系谱分析二、系谱分析系谱系谱(Pedigree)：将患者家族的所有成员将患者家族的所有成员及其发病情况按照一定格式排绘制成的图解，就及其发病情况按照一定格式排绘制成的图解，就成为系谱。成为系谱。系谱分析系谱分
7、析(Pedigree Analysis)：对某种性对某种性状或者疾病的多个系谱状或者疾病的多个系谱 进行综合研究，从而进行综合研究，从而得出这种性状或者疾病的遗传方式，称之为得出这种性状或者疾病的遗传方式，称之为系谱分析。系谱分析。第九页，讲稿共五十八页哦一例并指症的系谱一例并指症的系谱第十页，讲稿共五十八页哦一例多指（趾）的系谱一例多指（趾）的系谱12 2341567123456第十一页，讲稿共五十八页哦一例一例-地中海贫血的系谱地中海贫血的系谱12213456789812345679101112设：贫血基因 0 正常基因 A A 0A 0A 0A A重型贫血重型贫血轻型贫血0 0A 0 第
8、十二页，讲稿共五十八页哦12113764510912412813163421535610111213 1415一例白化病的系谱一例白化病的系谱第十三页，讲稿共五十八页哦一例甲型血友病的系谱21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 91第十四页，讲稿共五十八页哦2一例抗维生素D性佝偻病的系谱1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 91设：致病基因XA 正常基因XaXA XaXaYXAYXAXaXAY第十五页，讲稿共五十八页哦进行系谱分析应注意的问题进行系谱分析应注意的问题1.系谱的系统性、完整性、可靠性。去伪存真。系谱的
9、系统性、完整性、可靠性。去伪存真。2.分析显性遗传病时应注意延迟显性、不规则显性、分析显性遗传病时应注意延迟显性、不规则显性、外显不全等。外显不全等。3.分析性连锁遗传病时应注意与从性和限性遗传相区分析性连锁遗传病时应注意与从性和限性遗传相区别。别。4.要注意显隐性的相对性。因为同一种遗传病采用不同要注意显隐性的相对性。因为同一种遗传病采用不同观察指标会得出不同的结论。观察指标会得出不同的结论。5.注意新的基因突变。注意新的基因突变。第十六页，讲稿共五十八页哦HbA HbA HbA HbS HbS HbS 正常人正常人 携带着携带着 患者患者（致死）（致死）无无 有有（50%）有有（全部）（全
10、部）无无 有有（生存力强）（生存力强）-基因型基因型 疾疾 病病（隐性）（隐性）镰形细胞镰形细胞（显性）（显性）抗抗 疟疟 疾疾（显性）（显性）第十七页，讲稿共五十八页哦三、生物化学检查三、生物化学检查基因突变引起的单基因病往往表现在酶和蛋白质的质与量的改变或者缺如。因此酶和蛋白质的定量分析是诊断单基因病和先天性代谢性的主要方法。第十八页，讲稿共五十八页哦1.代谢产物的检出代谢产物的检出酶的缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而导致代谢底酶的缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而导致代谢底物、中间产物、终产物、旁路代谢产物发生改变。因此，物、中间产物、终产物、旁路代谢产物发生改变。因此，检测某些代谢常物的
11、质和量的改变，可以间接反映出酶的检测某些代谢常物的质和量的改变，可以间接反映出酶的变化而作出诊断。变化而作出诊断。苯丙酮尿症苯丙酮尿症：血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。粘多糖病粘多糖病：尿中的硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素。尿中的硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素。DMD：血清中的磷酸肌酸酶活性。血清中的磷酸肌酸酶活性。第十九页，讲稿共五十八页哦2.酶和蛋白质的分析酶和蛋白质的分析基因突变导致的单基因病主要是特定的基因突变导致的单基因病主要是特定的蛋白质、酶的质和量改变的结果。因此对蛋白质、酶的质和量改变的结果。因此对酶的活性和蛋白质含量的测定是确定某些酶的活性和蛋白质含量的测定是
12、确定某些单基因病的主要方法。单基因病的主要方法。第二十页，讲稿共五十八页哦检测材料的主要来源有：检测材料的主要来源有：特定的组织和细胞，特定的组织和细胞，如肝细胞、皮肤成纤维细胞，肾，肠粘膜细胞等。如肝细胞、皮肤成纤维细胞，肾，肠粘膜细胞等。注意的问题：一种酶的缺乏不一定在所有组织注意的问题：一种酶的缺乏不一定在所有组织中都能够检测出来。例如苯丙氨酸羟化酶必须用肝中都能够检测出来。例如苯丙氨酸羟化酶必须用肝组织活检，而血细胞中无法得到。组织活检，而血细胞中无法得到。第二十一页，讲稿共五十八页哦上上海海：19811987年年对对284,396名名新新生生儿儿进进行行PKU筛筛查查，查查出出PKU
13、患患儿儿15名名，高高苯苯丙丙氨氨酸酸血血症症4名。名。生物化学检查生物化学检查 苯丙酮尿症苯丙酮尿症,PKU酶活性检查酶活性检查 PAH 肝细胞肝细胞血液滤片法血液滤片法 Guthrie test 血液血液FeCl3显色反应显色反应 苯丙酮酸苯丙酮酸 尿液尿液第二十二页，讲稿共五十八页哦四、基因诊断四、基因诊断基因分析，即基因诊断基因分析，即基因诊断(Gene Diagnosis)：是利用是利用DNA 分析技术直接从基因水平分析技术直接从基因水平(DNA or RNA)检测遗传病检测遗传病的基因缺陷。的基因缺陷。这种方法和传统的诊断方法主要差别在于直接从这种方法和传统的诊断方法主要差别在于直
14、接从基因型推断表型，可以越过基因产物，直接检测基因基因型推断表型，可以越过基因产物，直接检测基因的结构而作出诊断，改变了传统的表型诊断方式，所的结构而作出诊断，改变了传统的表型诊断方式，所以又称为以又称为逆向诊断逆向诊断(Reverse Diagnosis)。第二十三页，讲稿共五十八页哦第二十四页，讲稿共五十八页哦19781978年，年，Kan YW 镰状细胞贫血镰状细胞贫血镰状细胞贫血镰状细胞贫血症状前诊断症状前诊断症状前诊断症状前诊断 外周静脉血外周静脉血外周静脉血外周静脉血产产产产 前前前前 诊诊诊诊 断断断断 孕早期的绒毛细胞孕早期的绒毛细胞孕早期的绒毛细胞孕早期的绒毛细胞 孕中期的羊
15、水胎儿脱落细胞孕中期的羊水胎儿脱落细胞孕中期的羊水胎儿脱落细胞孕中期的羊水胎儿脱落细胞 母亲外周血中的胎儿有核红细胞母亲外周血中的胎儿有核红细胞母亲外周血中的胎儿有核红细胞母亲外周血中的胎儿有核红细胞植入前诊断植入前诊断植入前诊断植入前诊断 受精卵卵裂细胞受精卵卵裂细胞受精卵卵裂细胞受精卵卵裂细胞基因诊断基因诊断第二十五页，讲稿共五十八页哦基因诊断的优点基因诊断的优点1.材料容易获得，不受细胞类型的限制；材料容易获得，不受细胞类型的限制；2.不受基因表达的时空限制。不受基因表达的时空限制。3.不受年龄的限制；不受年龄的限制；4.可以于发病前做出诊断；可以于发病前做出诊断；5.方便有效，迅速准确
16、，携带者也可以有效检出。方便有效，迅速准确，携带者也可以有效检出。第二十六页，讲稿共五十八页哦 基基因因诊诊断断的的难难点点：对对大大多多数数疾疾病病尚尚未未找找到到合合适适的的基基因因诊诊断断方方法法，另另外外由由于于遗遗传传异异质质性性、基基因因突突变变的的多多样样性性，一一种基因诊断方法对同一疾病往往有很大差异。种基因诊断方法对同一疾病往往有很大差异。基基因因诊诊断断的的对对象象：一一般般是是指指单单基基因因病病和和某某些些有有主主基基因因改改变变的的多多基基因因病病。至至1997年年，发发现现人人类类单单基基因因病病遗遗传传病病已达已达8587种，现已达到种，现已达到15988种种第二
17、十七页，讲稿共五十八页哦进行基因诊断必须具备的条件：进行基因诊断必须具备的条件：(1)致病基因的染色体定位已明确致病基因的染色体定位已明确(2)致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚(3)致病基因与致病基因与DNA多态存在连锁关系多态存在连锁关系根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术第二十八页，讲稿共五十八页哦基因诊断方法基因诊断方法 目前常用的基因诊断方法目前常用的基因诊断方法:(1)聚合酶链反应聚合酶链反应DNA扩增法扩增法 (2)限制性酶谱限制性酶谱Southern印迹杂交直接分析法印迹杂交直接分析法 (3)限制性片
18、段长度多态性限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析法连锁分析法 (4)寡核苷酸探针寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)检测法检测法 (5)DNA测序测序 (6)基因芯片基因芯片第二十九页，讲稿共五十八页哦（一）（一）聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）是在体外特异和）是在体外特异和迅速地扩增特定靶迅速地扩增特定靶DNA序列的方法序列的方法第三十页，讲稿共五十八页哦PCR的原理：的原理：1.为可选择性扩增为可选择性扩增,要要有特异引物有特异引物2.要有前身物、聚合酶要有前身物、聚合酶和离
19、子和离子3.是链式反应，每一是链式反应，每一周期经过变性、复周期经过变性、复性和延伸三步性和延伸三步4.一周期后一周期后DNA倍增倍增第三十一页，讲稿共五十八页哦 PCR的过程：的过程：变性（92-95；1分钟）复性（40-60；1分钟）延伸（72；1.5分钟）第三十二页，讲稿共五十八页哦 5 3 3 5 变性变性 5 3 3 5 特异引物特异引物 复性复性 5 3 5 3 3 5 3 5 DNA聚合酶聚合酶 延伸延伸 3 5 5 3 PCR第三十三页，讲稿共五十八页哦 以以 地贫基因诊断为例地贫基因诊断为例 由由于于中中国国人人地地贫贫80%以以上上为为东东南南亚亚型型缺缺失失型型（-SEA
20、/）,该该突突变变的的缺缺失失范范围围约约20kb基基因因片片段段。因因此此，采采用用跨跨越越断断裂裂点点PCR法法（gap-PCR）,一一次次即即可可诊诊断出各种基因型。断出各种基因型。PCR的应用的应用第三十四页，讲稿共五十八页哦第三十五页，讲稿共五十八页哦1 21 2第三十六页，讲稿共五十八页哦Multi-PCR第三十七页，讲稿共五十八页哦PCR-SSCP19891989年年，Orita等等建建立立的的PCRPCR产产产产 物物物物 单单单单 链链链链DNA凝胶电泳技术。凝胶电泳技术。1 2 3 4 5a b1：正常人；：正常人；2,4,5：纯合体患者；：纯合体患者；3：杂合体：杂合体(
21、2的弟弟的弟弟)左为泳动变位模式：左为泳动变位模式：a 正常人；正常人；b 纯合体患者纯合体患者第三十八页，讲稿共五十八页哦PCR-SSCPGAAGAGTGTTATCTCCAC第三十九页，讲稿共五十八页哦第四十页，讲稿共五十八页哦 PCR-DHPLCDHPLC（变性高效液相色谱）（变性高效液相色谱）进行基因突变检测的原理进行基因突变检测的原理 DHPLC进进行行基基因因突突变变检检测测是是基基于于异异源源双双链链的的形形成和不同的双链与吸附拄的结合牢固程度不同。成和不同的双链与吸附拄的结合牢固程度不同。第四十一页，讲稿共五十八页哦 一一个个杂杂合合子子个个体体，PCR产产物物一一定定含含有有野
22、野生生型型和和突突变变型型两两种种DNA，并并且且两两者者的的比比例例为为1:1，将将PCR产产物物进进行行变变性性复复性性过过程程，杂杂交交会会形形成成同同源源双双链链和和异异源源双双链链，同同样样，当当把把野野生生型型和和突突变变型型PCR产产物物混混合合后后，进进行行变变性性复复性性过过程程，杂杂交交后后会会出现四种情况。出现四种情况。第四十二页，讲稿共五十八页哦 异异源源双双链链由由于于碱碱基基对对不不匹匹配配，在在部部分分变变性性的的温温度度条条件件下下，就就会会在在不不匹匹配配的的碱碱基基对对处处部部分分解解链链，由由于于单单链链DNA带带负负电电荷荷减减少少，结结合合力力弱弱，因
23、因此此，异异源源双双链链比比同同源源双双链链先先洗洗脱脱出出来来，根根据据柱柱子子保保留留时时间间的的不同将同源双链和异源双链分离，出现不同的检测峰。不同将同源双链和异源双链分离，出现不同的检测峰。第四十三页，讲稿共五十八页哦 DHPLC的特点：的特点：1）快速分离DNA分子，一般进行基因突变检测，一个样品约需8.8分钟 2）自动化操作系统 3）准确测定DNA片段大小 4）基因突变检出率高，达95-100%5）经济、操作简便、PCR产物无须进行纯化处理即可用于突变检测 第四十四页，讲稿共五十八页哦（二）分子杂交（二）分子杂交第四十五页，讲稿共五十八页哦 Southern印迹杂交印迹杂交 (So
24、uthern blot hybridization)原理原理:DNA碱基的替换和数目的改变可导致限碱基的替换和数目的改变可导致限制性酶切片段长度改变制性酶切片段长度改变 1.点突变至酶切位点消失或出现新切点点突变至酶切位点消失或出现新切点 2.较大片段碱基缺失较大片段碱基缺失 3.串联重复数目较大的改变串联重复数目较大的改变 4.较大片段碱基重复较大片段碱基重复第四十六页，讲稿共五十八页哦限制酶的识别序列与切割：限制酶的识别序列与切割：绝大多数绝大多数型限制酶的识别序列都是型限制酶的识别序列都是 回文结构回文结构,即以双即以双对称轴按对称轴按5 3方向阅读时方向阅读时,其碱基顺序在双链上相同其
25、碱基顺序在双链上相同 BamH识别GGATCC 5-GGATCCATGGAACCGTAGCGGATCCTAGT-3 3-CCTAGGTACCT TGGCATCGCCTAGGATCA-5 Bgl识别AGATCT 5-AGATCTTACATTGGCATCGAGATCTTAGT-3 3-TCTAGAATGTAACCGTAGCTCTAGAATCA-5第四十七页，讲稿共五十八页哦 探针的种类和标记 杂交探针杂交探针 DNA cDNAcDNA 寡核苷酸寡核苷酸基因组基因组DNADNA 或或PCRPCR产物产物 mRNAmRNA 逆转录逆转录 化学合成化学合成 双链双链 0.1-20kb0.1-20kb 双
26、链双链 0.1-10kb0.1-10kb 单链单链 15-150bp15-150bp缺口平移，随缺口平移，随机引物，机引物，PCRPCR缺口平移，随缺口平移，随机引物，机引物，PCRPCR类型类型来源来源特征特征标记标记 末端标记末端标记第四十八页，讲稿共五十八页哦 探针标记(probe labeling)同位素标记:32P,35S,3H 非同位素标记:生物素，地高辛标记方法标记方法:缺口平移 双链探针标记 随机引物 PCR 寡核苷酸标记:5末端标上标记物第四十九页，讲稿共五十八页哦1限制性酶谱直接分析法：限制性酶谱直接分析法：应用专一性基因探针和限制性内切酶，经应用专一性基因探针和限制性内切
27、酶，经 Southern印迹杂交直接检测致病基因存在印迹杂交直接检测致病基因存在 原理：原理：限限制制性性内内切切酶酶能能识识别别 DNA中中特特定定核核苷苷酸酸顺顺序序，在在正正常常情情况况下下某某种种限限制制性性内内切切酶酶所所切切出出的的片片段段长长度度是是固固定定的的，当当基基因因发发生生突突变变后后,核核苷苷酸酸顺顺序序发发生生改改变变,导导致致限限制制性性内内切切酶酶的的酶酶切切位位点点改改变变，从从而而使使片片段段长长度发生改变。度发生改变。第五十页，讲稿共五十八页哦直接分析法直接分析法镰状细胞贫血镰状细胞贫血镰状细胞贫血镰状细胞贫血(HbS)(HbS)：第第6 6位密码子位密码
28、子AT T A A A A A A S S S S S SMstMstMstMst:CCTNAGG:CCTNAGG:CCTNAGG:CCTNAGG 1.2 Kb1.2 Kb 0.2Kb 0.2Kb1.40 Kb1.40 Kb1.20 Kb1.20 Kb0.20 Kb0.20 Kb A A A A:CCTGAGGAG:CCTGAGGAG:CCTGAGGAG:CCTGAGGAG S S S S:CCTG:CCTG:CCTG:CCTGT T T TGGAGGGAGGGAGGGAG第五十一页，讲稿共五十八页哦/-/-/-第五十二页，讲稿共五十八页哦RFLP连锁分析连锁分析Neurofibroma,NF
29、Neurofibroma,NF1 1 RFLP RFLP连锁分析连锁分析连锁分析连锁分析1 21 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 84.7 kb3.0 kb?第五十三页，讲稿共五十八页哦 ASO点杂交点杂交(ASO dot hybridization)(ASO:allele-specific oligonucleotide)能鉴定一对等位基因中单一核苷酸的差别能鉴定一对等位基因中单一核苷酸的差别原理：原理：1.点突变时突变点的碱基被替换点突变时突变点的碱基被替换 2.设计分别与正常和点突变序列互补的探针设计
30、分别与正常和点突变序列互补的探针 3.单一碱基的不配对足以导致异源杂交链的结合不稳单一碱基的不配对足以导致异源杂交链的结合不稳定定 4.严格的洗脱条件下严格的洗脱条件下,只有完全互补的异源杂交链能保留而显只有完全互补的异源杂交链能保留而显示杂交信号示杂交信号 第五十四页，讲稿共五十八页哦ASO斑点杂交斑点杂交19861986年年年年，胡胡胡胡流流流流清清清清等等等等基基基基于于于于点点点点突突突突变变变变原原原原理理理理，用用用用寡寡寡寡核核核核苷酸探针进行基因诊断。苷酸探针进行基因诊断。苷酸探针进行基因诊断。苷酸探针进行基因诊断。正常探针正常探针正常探针正常探针突变探针突变探针突变探针突变探针PKUPKU，ARAR第五十五页，讲稿共五十八页哦A A ASO(N probe)5CTCCTGAGGAGA 3S ASO(M probe)5CTCCTGTGGAGAA 3221331待测待测DNADNA杂交反应 AA 正常正常A S 杂合子杂合子ASO斑点杂交鉴定镰型细胞贫血突变斑点杂交鉴定镰型细胞贫血突变A S杂合子杂合子S S纯合子纯合子第五十六页，讲稿共五十八页哦DNA测序用四种不同颜色荧光素分别标记A，T，G，C核苷酸碱基，经过测序反应，标记的碱基代替原有碱基，通过标记碱基发出的荧光颜色确定待测DNA样本的序列。第五十七页，讲稿共五十八页哦感谢大家观看第五十八页，讲稿共五十八页哦