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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-dateSDS-PAGE电泳标准操作流程SDS-PAGE电泳标准操作流程SDS-PAGE电泳标准操作规程1、目的 建立SDS-PAGE电泳的标准操作规程,确保电泳操作有序进行，保证电泳的安全性、有效性。2.范围与职责 适用SDS-PAGE电泳操作岗位。配制岗位操作人员对本标淮实施负责，QA检查员、生产主管负责监督。3.程序：3.1. 制胶3.1.1组装胶架 将洁净、无水的玻片
2、对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。3.1.2 分离胶的配置 3.1.2.1 10%分离胶配方如下表：10%胶蒸馏水30%Acr-Bis(29:1)1.5M Tris-Hcl PH 8.810%SDS10%AP(过硫酸铵)TEMED5 ml1.3 ml1.7 ml1.9 ml0.05 ml0.05 ml0.007ml3.1.2.2 灌胶 混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。 3.12.3液封 在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观
3、察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。3.1.3浓缩胶的配置 3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：5%胶蒸馏水30%Acr-Bis(29:1)0.5M Tris-Hcl PH 6.810%SDS10%AP(过硫酸铵)TEMED2 ml1.4 ml0.33 ml0.25ml0.02 ml0.02 ml0.02 ml3.1.3.2插入制胶梳 混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。3.2. 电泳3.2.1 安装电泳槽 将制备好的凝胶板取下，
4、小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly电泳缓冲液。3.2.2 样品处理 对于蛋白样品直接取80l的样品，依次加上20l 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。3.2.3 加样 用移液枪取处理过的样品溶液10l，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中
5、。3.2.4 电泳 将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。3.2.5剥离胶 把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。3.4.脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。3.5.拍照 将脱色后的胶置于透明文件夹中，
6、把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。4. 注意事项4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%胶；50KD-30KD选用12%胶；30KD-10KD选用15%胶。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。5. 异常情况处理：操作过程中设备发生不正常或故障时，应及时告知负责人，及时处理。-