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1、2013年年生命科学学院生命科学学院 贾洪涛贾洪涛适用于适用于2011级生物技术本科级生物技术本科Linyi UniversityLinyi University关于酶的固定修饰与改造第一页，讲稿共一百零五页哦游离酶的缺点游离酶的缺点1.1.酶是蛋白质，在水溶液中（细胞外）稳定性差酶是蛋白质，在水溶液中（细胞外）稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）；（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）；2.2.不能回收，一般不能反复使用，常使产物中混不能回收，一般不能反复使用，常使产物中混杂酶蛋白，不易与产物分离，不利于产物的提纯杂酶蛋白，不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制；和精制；3.3.酶活性不够高；
2、酶活性不够高；4.4.分离纯化困难；分离纯化困难；5.5.具有抗原性。具有抗原性。第二页，讲稿共一百零五页哦第一节第一节 固定化酶与固定化细胞固定化酶与固定化细胞一、一、酶的固定化酶的固定化二、二、细胞的固定化细胞的固定化三、三、辅酶的固定化辅酶的固定化第三页，讲稿共一百零五页哦一、酶的固定化一、酶的固定化（一）概念及其优缺点（一）概念及其优缺点 固定化酶固定化酶(immobilized enzyme):(immobilized enzyme):是指将水溶是指将水溶性酶经过化学或物理手段处理，固定在载体上，在性酶经过化学或物理手段处理，固定在载体上，在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续
3、使一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的（不溶于水）酶。用的（不溶于水）酶。水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术固定化技术固定化技术第四页，讲稿共一百零五页哦酶固定化的基本要求酶固定化的基本要求 尽可能的尽可能的保持保持酶的酶的活性和专一性活性和专一性；固定化载体应该与酶固定化载体应该与酶结合结合较为较为牢固牢固，不与底，不与底物、产物发生反应，物、产物发生反应，达到多次回收和反复使用达到多次回收和反复使用；酶固定化后产生的酶固定化后产生的位阻位阻应该应该较小较小，不妨碍酶不妨碍酶与底物接近与
4、底物接近；成本成本尽可能尽可能低低。第五页，讲稿共一百零五页哦固定化酶的优缺点固定化酶的优缺点优点：优点：（1 1 1 1）可多次使用；）可多次使用；）可多次使用；）可多次使用；（2 2 2 2）可以装塔连续化生产（反应）；）可以装塔连续化生产（反应）；（3 3）不溶于水，易于与产物分离，纯化简单；）不溶于水，易于与产物分离，纯化简单；（4 4 4 4）稳定性好，提高产物质量；）稳定性好，提高产物质量；）稳定性好，提高产物质量；）稳定性好，提高产物质量；（5 5）提供了研究酶动力学的良好模型。）提供了研究酶动力学的良好模型。）提供了研究酶动力学的良好模型。）提供了研究酶动力学的良好模型。（6
5、6）应用范围广。）应用范围广。缺点：缺点：缺点：缺点：（1 1 1 1）首次投入成本高；）首次投入成本高；）首次投入成本高；）首次投入成本高；（2 2 2 2）大分子底物较困难；）大分子底物较困难；）大分子底物较困难；）大分子底物较困难；（3 3 3 3）固定化过程中往往会引起酶的失活。）固定化过程中往往会引起酶的失活。第六页，讲稿共一百零五页哦（二）酶固定化的方法（二）酶固定化的方法固定化方法固定化方法吸附法吸附法吸附法吸附法共价结合共价结合共价结合共价结合（偶联）法（偶联）法（偶联）法（偶联）法交联法交联法交联法交联法包埋法包埋法包埋法包埋法网格型网格型网格型网格型微囊型微囊型微囊型微囊型
6、离子交离子交离子交离子交换吸附换吸附换吸附换吸附物理物理物理物理吸附法吸附法吸附法吸附法 无载体无载体无载体无载体固定法固定法固定法固定法多方法多方法多方法多方法联用联用联用联用第七页，讲稿共一百零五页哦第八页，讲稿共一百零五页哦第九页，讲稿共一百零五页哦第十页，讲稿共一百零五页哦第十一页，讲稿共一百零五页哦各类固定化方法的特点比较各类固定化方法的特点比较比较项目比较项目吸附法吸附法共价结合法共价结合法 交联法交联法包埋法包埋法物理吸附共价键结合离子键结合 制备难易制备难易易易难难易易 较难较难较难较难固定化程度固定化程度弱弱强强中等中等 强强强强活力回收率活力回收率较高较高低低高高 中等中等
7、高高载体再生载体再生可能可能不可能不可能可能可能 不可能不可能不可能不可能费用费用低低高高低低 中等中等低低底物专一性底物专一性不变不变可变可变不变不变 可变可变不变不变适用性适用性酶源多酶源多较广较广广泛广泛 较广较广小分子底物、小分子底物、药用酶药用酶第十二页，讲稿共一百零五页哦1.1.吸附法吸附法 根据吸附剂的特点分根据吸附剂的特点分:物理吸附法和离物理吸附法和离子交换吸附法子交换吸附法（1 1）物理吸附法）物理吸附法（physical adsortionphysical adsortion）：）：通过酶与载体之间的范德华力、氢键、疏通过酶与载体之间的范德华力、氢键、疏水作用力等将酶与载
8、体联系起来的方法。水作用力等将酶与载体联系起来的方法。第十三页，讲稿共一百零五页哦吸附法吸附法作用力：作用力：范德华力、氢键、疏水作用力范德华力、氢键、疏水作用力选择载体的原则：选择载体的原则：有机载体和无机载体。有机载体和无机载体。要有巨大的比表面积；要有巨大的比表面积；要有活泼的表面；要有活泼的表面；便于装柱进行连续反应。便于装柱进行连续反应。常用载体：常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、骨胶原、纤维素、骨胶原、火棉胶、淀粉火棉胶、淀粉等。等。第十四页，讲稿共一百零五页哦吸附法的类型吸附法的类型根据吸
9、附剂的特点分根据吸附剂的特点分:物理吸附法和离子交换吸附法物理吸附法和离子交换吸附法物理吸附法和离子交换吸附法物理吸附法和离子交换吸附法（2 2 2 2）离子交换吸附）离子交换吸附）离子交换吸附）离子交换吸附(结合结合结合结合)法法法法（ion bindingion bindingion bindingion binding）：通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体上的固定化方法。相载体上的固定化方法。相载体上的固定化方法。相载体上的固
10、定化方法。作用力：作用力：作用力：作用力：离子键离子键离子键离子键 常用载体：常用载体：常用载体：常用载体：DEAE-CelluloseDEAE-Cellulose （二乙氨乙基二乙氨乙基-纤维素）纤维素）；DEAE-dextran gel DEAE-dextran gel DEAE-dextran gel DEAE-dextran gel（二乙氨乙基二乙氨乙基-葡聚糖凝胶）葡聚糖凝胶）；CM-cellulose CM-cellulose CM-cellulose CM-cellulose（羧甲基纤维素；（羧甲基纤维素；carboxymethyl cellulosecarboxymethyl
11、cellulosecarboxymethyl cellulosecarboxymethyl cellulose）。）。第十五页，讲稿共一百零五页哦吸附法的优缺点吸附法的优缺点优点：优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。条件温和，操作简便，酶活力损失少。条件温和，操作简便，酶活力损失少。条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：缺点：结合力弱，易解吸附。结合力弱，易解吸附。结合力弱，易解吸附。结合力弱，易解吸附。第十六页，讲稿共一百零五页哦2.2.包埋法包埋法定义：定义：将酶或含酶菌体用物理的将酶或含酶菌体用物理的方法包埋在各种具有特定网状结方法包埋在各种具有特定网状结构（多孔）载体（高聚物）中
12、，构（多孔）载体（高聚物）中，使酶固定化的方法称为包埋法。使酶固定化的方法称为包埋法。第十七页，讲稿共一百零五页哦包埋法的类型包埋法的类型分为：分为：凝胶包埋法和微胶囊包埋法凝胶包埋法和微胶囊包埋法（1 1 1 1）凝胶包埋法（网格型包埋法）：）凝胶包埋法（网格型包埋法）：将将将将酶包埋在交联的水不溶的高分子凝胶细微酶包埋在交联的水不溶的高分子凝胶细微酶包埋在交联的水不溶的高分子凝胶细微酶包埋在交联的水不溶的高分子凝胶细微网格中。网格中。网格中。网格中。常用的凝胶可分为天然凝胶和人工常用的凝胶可分为天然凝胶和人工凝胶。凝胶。如海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、琼如海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡
13、拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶。胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶。第十八页，讲稿共一百零五页哦凝胶包埋法的种类凝胶包埋法的种类聚丙烯酰胺凝胶包埋法：聚丙烯酰胺凝胶包埋法：将酶包埋在聚将酶包埋在聚丙烯酰胺凝胶中。丙烯酰胺凝胶中。海藻酸钙包埋法：海藻酸钙包埋法：凝胶包埋法常用的凝胶包埋法常用的载体有利用海藻提取物海藻酸钠制成凝胶。载体有利用海藻提取物海藻酸钠制成凝胶。琼脂糖凝胶包埋法：琼脂糖凝胶包埋法：利用熔化的琼脂在利用熔化的琼脂在温度低于温度低于5050凝固的特性来包埋酶。凝固的特性来包埋酶。第十九页，讲稿共一百零五页哦使用的
14、多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点凝胶凝胶包埋包埋条件条件酶活性酶活性强度强度天然凝胶琼脂;海藻酸钙;角叉菜胶;明胶温和不变差合成凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合反应部分失活高第二十页，讲稿共一百零五页哦（2）微胶囊包埋法（）微胶囊包埋法（半透膜包埋法半透膜包埋法）微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。透膜微胶囊内的方法。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm25nm。半透膜孔径小于酶分子孔径，半透膜孔径小于酶分子孔径，半透膜孔径小于酶分子孔径，半透膜孔径小于酶分子孔径，小于半透膜孔径的小
15、分子小于半透膜孔径的小分子小于半透膜孔径的小分子小于半透膜孔径的小分子底物和产物底物和产物底物和产物底物和产物可以自由进出，被称为可以自由进出，被称为“人工细胞人工细胞人工细胞人工细胞”。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的防止酶的防止酶的防止酶的脱落脱落脱落脱落，防止防止防止防止微囊外的微囊外的微囊外的微囊外的环境直接接触环境直接接触，从而增加了酶的，从而增加了酶的，从而增加了酶的，从而增加了酶的稳定性稳定性。常用于常用于制造微胶囊制造微胶囊的材料有的材料有的材料有的材料有聚酰
16、胺聚酰胺聚酰胺聚酰胺、火棉胶火棉胶火棉胶火棉胶、醋醋酸纤维素酸纤维素等。等。等。等。第二十一页，讲稿共一百零五页哦（3）纤维素包埋法）纤维素包埋法 常用于大规模生产。通过多孔常用于大规模生产。通过多孔喷丝头形成中空纤维，将酶包埋在喷丝头形成中空纤维，将酶包埋在纤维内。纤维内。第二十二页，讲稿共一百零五页哦包埋法的优缺点包埋法的优缺点 优点：优点：在于它是一种反应条件温和、很少改变酶在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。结构但是又较牢固的固定化方法。缺点：缺点：只有小分子底物和产物可以通过高聚物网只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶
17、并不架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。适合。这是由于这是由于高聚物网架高聚物网架会对会对大分子大分子物质产生物质产生扩扩散阻力散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。降低。第二十三页，讲稿共一百零五页哦3.3.共价结合（偶联法）共价结合（偶联法）（Covalent binding or covalent coupling）共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。（1 1 1 1）原理：）原理：）原理：
18、）原理：酶蛋白分子上的酶蛋白分子上的酶蛋白分子上的酶蛋白分子上的功能基团与载体（固相支持物）表面上功能基团与载体（固相支持物）表面上功能基团与载体（固相支持物）表面上功能基团与载体（固相支持物）表面上的反应基团之间以的反应基团之间以的反应基团之间以的反应基团之间以共价键共价键共价键共价键的作用而实现的作用而实现的作用而实现的作用而实现结合结合结合结合的固定化方法。的固定化方法。的固定化方法。的固定化方法。（借助（借助（借助（借助共价键共价键共价键共价键将酶的将酶的将酶的将酶的非活性必需侧链基团非活性必需侧链基团非活性必需侧链基团非活性必需侧链基团和载体的和载体的和载体的和载体的功能基团功能基团
19、功能基团功能基团进行进行进行进行偶连偶连偶连偶连）。）。）。）。（2 2 2 2）载体选择的要求：）载体选择的要求：）载体选择的要求：）载体选择的要求：尽量选择尽量选择尽量选择尽量选择亲水性强亲水性强亲水性强亲水性强的载体；的载体；的载体；的载体；载体载体载体载体结构疏松结构疏松结构疏松结构疏松，表面积大表面积大表面积大表面积大，有一定的，有一定的，有一定的，有一定的机械强度机械强度机械强度机械强度；载体必须有在载体必须有在载体必须有在载体必须有在温和条件温和条件温和条件温和条件下与酶下与酶下与酶下与酶共价结合共价结合共价结合共价结合的功能基团；的功能基团；的功能基团；的功能基团；载体载体载体
20、载体没有或很少有没有或很少有没有或很少有没有或很少有非专一性非专一性非专一性非专一性吸附吸附吸附吸附；载体载体载体载体容易获得容易获得容易获得容易获得，能，能，能，能反复使用反复使用反复使用反复使用。第二十四页，讲稿共一百零五页哦共价结合（偶联法）共价结合（偶联法）（3 3）酶蛋白可以形成共价键的基团：）酶蛋白可以形成共价键的基团：）酶蛋白可以形成共价键的基团：）酶蛋白可以形成共价键的基团：游离氨基、游离羧基、游离氨基、游离羧基、游离氨基、游离羧基、游离氨基、游离羧基、巯基、巯基、巯基、巯基、咪唑基、咪唑基、咪唑基、咪唑基、酚基、酚基、酚基、酚基、羟羟羟羟基、基、基、基、甲硫基、甲硫基、甲硫基
21、、甲硫基、吲哚基、二硫键。吲哚基、二硫键。吲哚基、二硫键。吲哚基、二硫键。酶蛋白酶蛋白N N末端的末端的-氨基氨基氨基氨基或赖氨酸残基的或赖氨酸残基的-氨基氨基氨基氨基。酶蛋白酶蛋白C C末端的末端的-羧基羧基羧基羧基、天门冬氨酸残基的、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的羧基以及谷氨酸残基的-羧基羧基。半胱氨酸残基的半胱氨酸残基的半胱氨酸残基的半胱氨酸残基的巯基巯基。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基羟基。组氨酸残基的组氨酸残基的咪唑基咪唑基。色氨酸残基的色氨酸残基的吲哚基吲哚基。苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环苯环苯环苯环。第二十五页，讲稿共一百
22、零五页哦共价结合（偶联法）共价结合（偶联法）（4 4）常用的载体：）常用的载体：天然天然高分子、高分子、人工人工合成的合成的高聚物高聚物、无机无机载载体。体。亲水亲水载体优于载体优于疏水疏水载体。载体。天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素、琼脂糖、葡聚糖凝胶纤维素、琼脂糖、葡聚糖凝胶；亲和亲和性好，性好，机械性能差机械性能差。合成聚合物：合成聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、尼龙聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、尼龙；机械机械性能好，性能好，但但有有疏水结构疏水结构。第二十六页，讲稿共一百零五页哦共价结合（偶联法）共价结合（偶联法）（5 5 5 5）载体活化（偶联）的方法：）载体活化（偶联）的方法：）载体
23、活化（偶联）的方法：）载体活化（偶联）的方法：溴化氰法：溴化氰法：溴化氰法：溴化氰法：即即用溴化氰将用溴化氰将用溴化氰将用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物活化生成亚氨基碳酸酯衍生物活化生成亚氨基碳酸酯衍生物活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。子上的氨基偶联，制成固定化酶。叠氮法：叠氮法：叠氮法：叠氮法：即即载体活化生成叠氮化合物载体活化生成叠氮化合物载体活化生成叠氮化合物载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基，再与酶分子上的相应基团偶联
24、成固定化酶。团偶联成固定化酶。烷基化反应法：烷基化反应法：烷基化反应法：烷基化反应法：以以卤素为功能团的载体卤素为功能团的载体卤素为功能团的载体卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的可与酶蛋白分子上的氨基、氨基、氨基、氨基、巯基、酚基等巯基、酚基等巯基、酚基等巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。重氮法：重氮法：重氮法：重氮法：重氮法是重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接相连接相连接相连接而固定化的方法，是
25、共价键法中使用最多的一种。而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。硅烷化法：硅烷化法：硅烷化法：硅烷化法：可在二氧化硅表面引入氨基，活化的表面可以利用一些可在二氧化硅表面引入氨基，活化的表面可以利用一些中间分子（如二氯硫化碳）进一步和酶分子发生连接反应。中间分子（如二氯硫化碳）进一步和酶分子发生连接反应。第二十七页，讲稿共一百零五页哦4.4.交联法交联法 交联法（交联法（交联法（交联法（cross-linkingcross-linkingcross-linkingcross-linking）是利用）是利用）是利用）是利用双功能或多功能双功能或多功能双功能或多功能双功能或多功能试剂试剂试剂试
26、剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行体间进行体间进行体间进行交联反应交联反应交联反应交联反应，形成网状结构的酶固定化方法。，形成网状结构的酶固定化方法。，形成网状结构的酶固定化方法。，形成网状结构的酶固定化方法。由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和如氨基、酚基、巯基和如氨基、酚基、巯基和如氨基、酚基、巯基和咪唑基咪唑基咪唑基咪唑基，参与此反应，所以酶的活性中心构造酶的活性中心构造酶的活性中心构造酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。但
27、是尽可能地降低交联尽可能地降低交联尽可能地降低交联尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间剂浓度和缩短反应时间剂浓度和缩短反应时间剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。此法与共价结合此法与共价结合此法与共价结合此法与共价结合（偶联）（偶联）（偶联）（偶联）法利用的均法利用的均法利用的均法利用的均是共价键，不同之处是什么？是共价键，不同之处是什么？是共价键，不同之处是什么？是共价键，不同之处是什么？交联法不使用载体交联法不使用载体！第二十八页，讲稿共一百零五页哦交联法常用试剂交联法常用试剂 戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、N,N-N,N-乙烯马来亚胺、双重氮联苯
28、胺和乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺和N,N-N,N-乙烯双顺乙烯双顺丁烯二酰亚胺等。丁烯二酰亚胺等。其中应用最广泛的是其中应用最广泛的是戊二醛戊二醛，它的它的两个两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成形成席夫席夫碱碱(shiff base)(shiff base)，从而使酶分子之间相互交，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。联形成固定化酶。第二十九页，讲稿共一百零五页哦共价交联法的四种形式共价交联法的四种形式（1 1）酶）酶直接直接交联法：交联法：（2 2）酶）酶辅助蛋白辅助蛋白交联：交联：当可得到的酶量有限，可以使用当可得到的酶量有限，可以使用第二第二个个“载
29、体载体”蛋白蛋白来增加蛋白质浓度，从而使来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。酶与惰性蛋白共交联的方法。第三十页，讲稿共一百零五页哦共价交联法的四种形式共价交联法的四种形式（3 3）吸附交联法：）吸附交联法：此法先将此法先将酶吸附在硅胶、藻土、氧化铝、球状酚醛酶吸附在硅胶、藻土、氧化铝、球状酚醛酶吸附在硅胶、藻土、氧化铝、球状酚醛酶吸附在硅胶、藻土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上树脂或其他大孔型离子交换树脂上树脂或其他大孔型离子交换树脂上树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功再用戊二醛等双功再用戊二醛等双功再用戊二醛等双功能试剂交联能试剂交联能试剂交联能试
30、剂交联，用此法所得固定化酶也可称为，用此法所得固定化酶也可称为壳状壳状固定固定化酶。化酶。（4 4）载体交联法：）载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体载体，而其中的，而其中的另一部分功能基团偶联酶蛋白另一部分功能基团偶联酶蛋白。第三十一页，讲稿共一百零五页哦四种固定化酶制备方法的特点小结四种固定化酶制备方法的特点小结指标指标物理吸附物理吸附包埋法包埋法共价结合法共价结合法共价交联法共价交联法物理吸附法物理吸附法离子吸附法离子吸附法制备制备易易易易较难较难难难较难较难结合程度结合程度弱弱中等中等强强强强强强酶活力回收酶活力回收高，易
31、流失高，易流失高高高高中中中中底物专一性底物专一性无变化无变化无变化无变化无变化无变化有变化有变化有变化有变化再生再生可能可能可能可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能固定化费用固定化费用低低低低中中高高中中第三十二页，讲稿共一百零五页哦（三）固定化酶的评价（三）固定化酶的评价(一一一一)固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶(细胞细胞细胞细胞)的活力测定的活力测定的活力测定的活力测定 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才
32、能用于测定固定化酶。进后才能用于测定固定化酶。进后才能用于测定固定化酶。进后才能用于测定固定化酶。(二二二二)蛋白总量测定蛋白总量测定蛋白总量测定蛋白总量测定 1.1.1.1.双辛可宁酸法双辛可宁酸法双辛可宁酸法双辛可宁酸法(Bicinchoninic acid;BCABicinchoninic acid;BCABicinchoninic acid;BCABicinchoninic acid;BCA法法法法)2.2.2.2.考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法:(三三三三)偶联率及比（相对）活力测定偶联率及比（相对）活力测定偶联率及比（相对）活力测定偶联率及比（相对）活力测定第三十
33、三页，讲稿共一百零五页哦（三）固定化酶的（三）固定化酶的评价评价(四四)固定化酶的固定化酶的操作半衰期操作半衰期 在连续测定条件下，在连续测定条件下，固定化酶固定化酶(细胞细胞)的的活活力下降为最初活力一半力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间所经历的连续工作时间，以以t t1/21/2表示。是衡量稳定性的一项重要指标。表示。是衡量稳定性的一项重要指标。(五五)相对酶活力相对酶活力 具有相同酶蛋白量的具有相同酶蛋白量的固定化酶活力固定化酶活力与与游游离酶活力离酶活力的比值。的比值。第三十四页，讲稿共一百零五页哦（四）固定化酶的性质和影响因素（四）固定化酶的性质和影响因素1.1.固定化酶的形状
34、固定化酶的形状 固定化酶的形式多样，依不同用途有固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒颗粒、线条线条、薄膜薄膜和和酶管酶管等形状。等形状。其中其中颗粒颗粒占绝大多数，它和占绝大多数，它和线条线条主要主要用于工业发酵生产，如装成用于工业发酵生产，如装成酶柱酶柱用于连续生产，用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应；或在反应器中进行批式搅拌反应；薄膜薄膜主要用于酶电极，应用于分析化主要用于酶电极，应用于分析化学；学；酶管酶管机械强度较大，机械强度较大，适用于工业生产。适用于工业生产。第三十五页，讲稿共一百零五页哦（四）固定化酶的性质和影响因素（四）固定化酶的性质和影响因素2.2.2.2.固定化对反
35、应体系造成的效应固定化对反应体系造成的效应固定化对反应体系造成的效应固定化对反应体系造成的效应 酶经过固定化后引起的性质改变，不外酶经过固定化后引起的性质改变，不外酶经过固定化后引起的性质改变，不外酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是乎两种原因：一是乎两种原因：一是乎两种原因：一是酶本身的变化酶本身的变化酶本身的变化酶本身的变化，二是，二是，二是，二是受固受固受固受固定化载体的物理或化学性质的影响定化载体的物理或化学性质的影响定化载体的物理或化学性质的影响定化载体的物理或化学性质的影响。（1 1 1 1）构象效应：）构象效应：）构象效应：）构象效应：酶分子在固定化过程中，酶分子在
36、固定化过程中，酶分子与载体相互作用使得酶的活性中心酶分子与载体相互作用使得酶的活性中心酶分子与载体相互作用使得酶的活性中心酶分子与载体相互作用使得酶的活性中心或变构中心构象发生变化或变构中心构象发生变化或变构中心构象发生变化或变构中心构象发生变化。（2 2）屏蔽效应：）屏蔽效应：酶经固定化后，酶经固定化后，载体会成载体会成为底物或者其他效应物结合到活性中心或者为底物或者其他效应物结合到活性中心或者变构中心的空间障碍变构中心的空间障碍，可以通过，可以通过加入连接臂加入连接臂的方式进行改善。的方式进行改善。第三十六页，讲稿共一百零五页哦2013年年生命科学学院生命科学学院 贾洪涛贾洪涛适用于适用于
37、2011级生物技术本科级生物技术本科Linyi UniversityLinyi University固定化酶的性质和影响因素固定化酶的性质和影响因素（3 3 3 3）微扰效应：）微扰效应：）微扰效应：）微扰效应：酶固定化后，酶固定化后，载体固有的性质会引起紧邻固定化酶载体固有的性质会引起紧邻固定化酶载体固有的性质会引起紧邻固定化酶载体固有的性质会引起紧邻固定化酶的微环境的变化的微环境的变化的微环境的变化的微环境的变化，使酶的催化能力及酶对效应物作出调节反应的能力，使酶的催化能力及酶对效应物作出调节反应的能力发生改变。发生改变。（4 4 4 4）分配效应：）分配效应：）分配效应：）分配效应：由于
38、由于载体的亲水或者疏水特性以及带电特征载体的亲水或者疏水特性以及带电特征载体的亲水或者疏水特性以及带电特征载体的亲水或者疏水特性以及带电特征使底物、使底物、产物或其他效应物在每所处的产物或其他效应物在每所处的微环境和宏观体系间发生不等分配微环境和宏观体系间发生不等分配微环境和宏观体系间发生不等分配微环境和宏观体系间发生不等分配，改变了，改变了酶反应体系的组成平衡。酶反应体系的组成平衡。（5 5 5 5）扩散限制效应：）扩散限制效应：）扩散限制效应：）扩散限制效应：指底物、产物和其他效应物在酶的微环境区与宏观体指底物、产物和其他效应物在酶的微环境区与宏观体系之间迁移和运转速度受到限制的一种效应。
39、系之间迁移和运转速度受到限制的一种效应。第三十七页，讲稿共一百零五页哦3.3.固定化酶固定化酶（细胞）（细胞）性质的改变性质的改变 （1 1 1 1）固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一）固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一）固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一）固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。性也会受到影响发生改变。性也会受到影响发生改变。性也会受到影响发生改变。活力下降的原因：活力下降的原因：活力下降的原因：活力下降的原因：酶分子在固定化过程中，由于构象效应或调节中心酶分子在固定化过程中，由于构象效应或调节中心酶分
40、子在固定化过程中，由于构象效应或调节中心酶分子在固定化过程中，由于构象效应或调节中心空间构象发生变化或者屏蔽效应造成酶的空间构像发生了变空间构象发生变化或者屏蔽效应造成酶的空间构像发生了变空间构象发生变化或者屏蔽效应造成酶的空间构像发生了变空间构象发生变化或者屏蔽效应造成酶的空间构像发生了变化，活性中心无法与底物结合；化，活性中心无法与底物结合；化，活性中心无法与底物结合；化，活性中心无法与底物结合；部分活性中心的氨基酸残基参与了与载体的结合，导致部部分活性中心的氨基酸残基参与了与载体的结合，导致部部分活性中心的氨基酸残基参与了与载体的结合，导致部部分活性中心的氨基酸残基参与了与载体的结合，导
41、致部分酶完全丧失了活性；分酶完全丧失了活性；分酶完全丧失了活性；分酶完全丧失了活性；固定化后的空间障碍效应的影响；固定化后的空间障碍效应的影响；固定化后的空间障碍效应的影响；固定化后的空间障碍效应的影响；内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻；内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻；内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻；内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻；包埋法时被高分子物质半透膜包围。包埋法时被高分子物质半透膜包围。包埋法时被高分子物质半透膜包围。包埋法时被高分子物质半透膜包围。第三十八页，讲稿共一百零五页哦固定化酶固定化酶（细胞）（细胞）性质的改变性质
42、的改变（2 2）固定化后酶）固定化后酶稳定性提高稳定性提高 稳定性提高的原因：稳定性提高的原因：固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形；分子伸展变形；酶活力的缓慢释放；酶活力的缓慢释放；反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起作用；在开始起作用的酶变性后才起作用；抑制自降解，提高了酶稳定性。抑制自降解，提高了酶稳定性。第三十九页，讲稿共一百零五页哦固定化酶固定化酶（细胞）（细胞）性质的改变性质的改变（3 3）固定化酶（细胞）的最适）固定化酶（细胞）的最适pHpH变化变化变化变化 酶固定化后，
43、对底物的酶固定化后，对底物的酶固定化后，对底物的酶固定化后，对底物的最适最适最适最适pHpHpHpH曲线常常发生偏移曲线常常发生偏移曲线常常发生偏移曲线常常发生偏移。变化规律：变化规律：变化规律：变化规律：一般来说，一般来说，一般来说，一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适带负电荷载体制备的固定化酶，其最适带负电荷载体制备的固定化酶，其最适带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pHpHpHpH值较游离酶值较游离酶值较游离酶值较游离酶偏高偏高偏高偏高；反之，若使用；反之，若使用；反之，若使用；反之，若使用带正电荷载体的话，其最适带正电荷载体的话，其最适带正电荷载体的话，其最适带正电荷载体的话，
44、其最适pHpHpHpH值较游离酶偏低值较游离酶偏低值较游离酶偏低值较游离酶偏低，即向酸性偏移。，即向酸性偏移。，即向酸性偏移。，即向酸性偏移。原因：原因：原因：原因：一是酶本身一是酶本身一是酶本身一是酶本身电荷电荷电荷电荷在固定化前后发生变化；在固定化前后发生变化；在固定化前后发生变化；在固定化前后发生变化；二是由于载体电荷性质的影响二是由于载体电荷性质的影响二是由于载体电荷性质的影响二是由于载体电荷性质的影响致使致使致使致使固定化酶分子内外扩散层的氢离子浓度固定化酶分子内外扩散层的氢离子浓度固定化酶分子内外扩散层的氢离子浓度固定化酶分子内外扩散层的氢离子浓度产生差异；产生差异；产生差异；产生
45、差异；三是由于酶催化反应产物三是由于酶催化反应产物三是由于酶催化反应产物三是由于酶催化反应产物导致导致导致导致固定化酶分子内部形成带电荷微环境固定化酶分子内部形成带电荷微环境固定化酶分子内部形成带电荷微环境固定化酶分子内部形成带电荷微环境。一般来说，产物为酸性时固定。一般来说，产物为酸性时固定。一般来说，产物为酸性时固定。一般来说，产物为酸性时固定化酶的最适化酶的最适化酶的最适化酶的最适pHpHpHpH比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适pHpHpHpH比
46、游离酶低比游离酶低比游离酶低比游离酶低一些，产物为中性时，最适一些，产物为中性时，最适一些，产物为中性时，最适一些，产物为中性时，最适pHpHpHpH一般不改变。一般不改变。一般不改变。一般不改变。第四十页，讲稿共一百零五页哦固定化酶固定化酶（细胞）（细胞）性质的改变性质的改变（4 4）固定化酶（细胞）的最适温度的变化）固定化酶（细胞）的最适温度的变化 固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高，如色氨酸，如色氨酸酶经共价结合后最适温度比固定前提高酶经共价结合后最适温度比固定前提高5 5 5
47、515151515，但也，但也有不变甚至降低的。有不变甚至降低的。固定化酶的作用最适温度会固定化酶的作用最适温度会固定化酶的作用最适温度会固定化酶的作用最适温度会受固定受固定化方法化方法以及以及以及以及固定化载体固定化载体的影响。的影响。的影响。的影响。酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。果。果。果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。也随之提高，这是很有利的结果
48、。第四十一页，讲稿共一百零五页哦固定化酶（细胞）性质的改变固定化酶（细胞）性质的改变（5 5 5 5）酶固定后动力学参数）酶固定后动力学参数）酶固定后动力学参数）酶固定后动力学参数(米氏常数；米氏常数；米氏常数；米氏常数；Km)Km)的变化的变化 米氏常数米氏常数KmKmKmKm反映了酶与底物的亲和力。反映了酶与底物的亲和力。酶经固定酶经固定酶经固定酶经固定化后，酶蛋白分子的化后，酶蛋白分子的化后，酶蛋白分子的化后，酶蛋白分子的高级结构的变化以及载体电荷的影高级结构的变化以及载体电荷的影响响可导致底物和酶的亲合力的变化。固定化酶的表观米可导致底物和酶的亲合力的变化。固定化酶的表观米氏常数氏常数
49、KmKm随载体的带电性能变化。随载体的带电性能变化。简单说，由于简单说，由于高级结构变化高级结构变化及载体影响引起酶与及载体影响引起酶与及载体影响引起酶与及载体影响引起酶与底物底物底物底物亲和力亲和力亲和力亲和力变化，从而使变化，从而使KmKmKmKm变化。变化。而这种而这种而这种而这种KmKm变化又受变化又受到溶液中底物离子强度影响：离子强度升高，载体周围到溶液中底物离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，的静电梯度逐渐减小，KmKm变化也逐渐缩小以至消失。变化也逐渐缩小以至消失。变化也逐渐缩小以至消失。变化也逐渐缩小以至消失。第四十二页，讲稿共一百零五页哦固定化酶（细胞）性
50、质的改变固定化酶（细胞）性质的改变（6 6）固定化酶底物特异性发生变化）固定化酶底物特异性发生变化 固定化酶的固定化酶的底物特异性底物特异性底物特异性底物特异性与与与与底物分子量的大小底物分子量的大小有一定关系。有一定关系。有一定关系。有一定关系。一般来说，当酶的一般来说，当酶的一般来说，当酶的一般来说，当酶的底物为小分子化合物时底物为小分子化合物时底物为小分子化合物时底物为小分子化合物时，固，固，固，固定化酶的定化酶的定化酶的定化酶的底物特异性底物特异性大多数情况下大多数情况下不发生变化不发生变化。例例例例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，固如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异