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1、关于发光免疫技术第1页，讲稿共51张，创作于星期日发光免疫分析发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。第2页，讲稿共51张，创作于星期日第一节第一节 概概 述述第3页，讲稿共51张，创作于星期日 发光发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。并释放光子的过程。根据形成激发
2、态分子的能量来源不同可分为根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、光照发光、生物发光、化学发光化学发光等。等。第4页，讲稿共51张，创作于星期日 光照发光光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。见光（荧光）。生物发光生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光的发光
3、现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用素，在荧光素酶的催化下，利用ATPATP能，生成激发态氧化能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。放出来。第5页，讲稿共51张，创作于星期日 化学发光化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂发光剂)在化学反在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子
4、中的电子跃迁到激发态，当物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。能量，这一现象称为化学发光。一、化学发光一、化学发光第6页，讲稿共51张，创作于星期日一些化学反应能释放足够一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：接化学发光。反应过程可简单地描述如下：A
5、 A十十B C*B C*C*C C*C hh其中其中为光子，为光子，C*C*表示表示C C处于单线激发态。处于单线激发态。第7页，讲稿共51张，创作于星期日若激发能传递到另一个未参加化学反应若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子的分子D D上，使上，使D D分子激发到电子激发态，分子激发到电子激发态，D D分子从激发态回到基态时发光，这种过分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：A A十十B CB C*C C*十十D CD C十十D D*D D*D D十十hh第8页，讲稿共51张，创作于星期日 化学发光效率（化学发光效率（
6、CL）决定于生成激发态产物分）决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（子的化学激发效率（CE）和激发态分子的发射效率）和激发态分子的发射效率（EM）。）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。学发光效率。二、化学发光效率二、化学发光效率第9页，讲稿共51张，创作于星期日化学发光免疫分析化学发光免疫分析目前分类目前分类 按发光剂不同分为按发光剂不同分为 1.
7、1.发光酶免疫测定技术（发光酶免疫测定技术（CLEIACLEIA）2.2.化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)3.3.电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLIA)(ECLIA)第10页，讲稿共51张，创作于星期日第二节第二节 化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术第11页，讲稿共51张，创作于星期日 在化学发光反应中参与能量转移并最终以在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学化学发光剂或发光底物。发光剂或发光底物。一、化学发光剂一、化学发光剂第12页，讲稿共51张，创作于星期日能
8、作为化学发光剂的条件：能作为化学发光剂的条件：发光的量子产率高；发光的量子产率高；它的物理它的物理-化学特性要与被标记或测定的化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配；物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；其化学发光常是氧化反应的结果；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。第13页，讲稿共51张，创作于星期日 直接化学发光剂直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上催化作用，直接参与
9、发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。第14页，讲稿共51张，创作于星期日1.1.吖啶酯吖啶酯 在碱性条件下被在碱性条件下被H H2 2O O2 2氧化时氧化时,发出波长为发出波长为470nm470nm的光，具有很高的发光效率，的光，具有很高的发光效率，其激发态产物其激发态产物N-N-甲基吖啶酮是该发光反应甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。体系的发光体。第15页，讲稿共51张，创作于星期日2 2三联吡啶钌三联吡啶钌三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)3RU(bpy)32+2+是电化是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（
10、学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPATPA）在阳电极）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。三联吡啶钌三联吡啶钌第16页，讲稿共51张，创作于星期日电化学发光剂反应原理电化学发光剂反应原理 第17页，讲稿共51张，创作于星期日 酶促反应发光剂：酶促反应发光剂：是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。称为酶促反应发光剂。1鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 2AMPPD第18页，讲稿共51张，创作于星期日1 1鲁米诺鲁米诺
11、鲁米诺发光原理鲁米诺发光原理第19页，讲稿共51张，创作于星期日鲁米诺增强发光反应原理鲁米诺增强发光反应原理 第20页，讲稿共51张，创作于星期日2AMPPD3-(2-3-(2-螺旋金刚烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-4-(3“-磷酰氧基磷酰氧基)苯苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷第21页，讲稿共51张，创作于星期日1.1.碳二亚胺（碳二亚胺（EDCEDC）缩合法）缩合法 二、发光剂的标记技术二、发光剂的标记技术C-O第22页，讲稿共51张，创作于星期日2.2.过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法 第23页，讲稿共51张，创作于星期日3 3重氮盐偶联法重氮盐偶联法 第
12、24页，讲稿共51张，创作于星期日4.N-4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法羟基琥珀酰亚胺活化法 第25页，讲稿共51张，创作于星期日 1 1发光剂的选择发光剂的选择 2 2被标记蛋白质的性质被标记蛋白质的性质 3 3标记方法的选择标记方法的选择 4 4原料比原料比 5 5标记率标记率 6 6温度温度 7 7纯化与保存纯化与保存 影响标记的因素影响标记的因素第26页，讲稿共51张，创作于星期日第三节第三节 化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型 第27页，讲稿共51张，创作于星期日用吖啶酯直接标记抗体用吖啶酯直接标记抗体(抗原抗原)，与待测标本中相应的抗原，与待测标本中相应的抗原(抗体抗体)发
13、生免疫反应后，形成固相包被抗体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-吖啶酯标记抗体吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（复合物，这时只需加入氧化剂（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成碱性环境，吖啶酯使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光在不需要催化剂的情况下分解、发光 。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分
14、析一、直接化学发光免疫分析第28页，讲稿共51张，创作于星期日发光发光Y Y Y YY Y Y YY Y Y Y磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带丫啶酯带丫啶酯标记物抗标记物抗体体Y Y Y YY Y Y YY Y Y YY Y Y YY Y Y YY Y Y YY Y Y YY Y Y YY Y Y YY Y Y YY Y Y Y冲洗后冲洗后-夹心法夹心法（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化学发光的机理直接化学发光的机理第29页，讲稿共51张，创作于星期日磁磁微粒模式图微粒模式图Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY
15、YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点特点抗原和抗体结抗原和抗体结合与未结合部合与未结合部分的易分离分的易分离磁微粒技术磁微粒技术第30页，讲稿共51张，创作于星期日 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶或碱性磷酸酶(ALP)(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原来标记抗原或抗体，在与
16、待测标本中相应的抗原(抗体抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶标记抗体复合酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物物，经洗涤后，加入底物(发光剂发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析第31页，讲稿共51张，创作于星期日该分析系统采用辣根过氧化物酶（该
17、分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗）标记抗体体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶（酶（HRP）标记抗体复合物，这时加）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产和化学发光增强剂使产生化学发光。生化学发光。辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析第32页，讲稿共51张，创作于星期日辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 第33页，讲稿共5
18、1张，创作于星期日该分析系统以碱性磷酸酶该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体标记抗体(或抗原或抗原)，在，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体应后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶标记抗体复酶标记抗体复合物，这时加入合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。脱去磷酸根基团而发光。碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析第34页，讲稿共51张，创作于星期日碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 第35页，讲稿共51
19、张，创作于星期日分析步骤分配样品分配样品,磁颗粒磁颗粒和试剂和试剂孵育孵育使反应物使反应物结合结合在磁场中在磁场中清洗去除清洗去除未结合物质未结合物质加入加入底物底物产生产生信号信号孵育孵育,促使信号促使信号的产生的产生信号信号检测检测第36页，讲稿共51张，创作于星期日电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记是以电化学发光剂三联吡啶钌标记 抗体抗体(抗原抗原)，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)为电子供体，为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光在电场中因电子转移而发
20、生特异性化学发光 反应，它包括电化学和化学发光两个过程。反应，它包括电化学和化学发光两个过程。三、电化学发光免疫分析三、电化学发光免疫分析第37页，讲稿共51张，创作于星期日v电化学指电化学指在阳极表面在阳极表面 Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+和和TPATPA同时失去同时失去电子发生氧化反应。电子发生氧化反应。a.a.自由基自由基TPATPA+失去一个质子（失去一个质子（H H+），成为），成为 自由基自由基TPATPA，这是一个强还原剂。，这是一个强还原剂。b.b.TPATPA 将一个电子递给将一个电子递给Ru(bpy)Ru(bpy)3 33+3+，而，而TPATPA被被氧化。
21、氧化。c.c.激发态的激发态的Ru(bpy)Ru(bpy)3 32+*2+*在衰减时发射一个波在衰减时发射一个波长为长为620nm620nm的光子。的光子。化学发光包括化学发光包括第38页，讲稿共51张，创作于星期日电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图第39页，讲稿共51张，创作于星期日磁性微粒直径磁性微粒直径2.8m，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微粒体积小，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微粒体积小，悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相，在磁场中易于分离。悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相，在磁场中易于分离。第40页，讲稿共51张，创作于星期日电化学发光免疫测定示意图电化学发光
22、免疫测定示意图 第41页，讲稿共51张，创作于星期日电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图第42页，讲稿共51张，创作于星期日标记磁颗粒在电场中发光工作示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图第43页，讲稿共51张，创作于星期日 1.1.激素：甲状腺激素、生殖激素、垂体激素和皮质激素激素：甲状腺激素、生殖激素、垂体激素和皮质激素 2 2标志物：肿瘤标志物、心脏标志物、病毒标记物标志物：肿瘤标志物、心脏标志物、病毒标记物 3 3药物浓度监测药物浓度监测 4 4贫血因子贫血因子 5 5感染性疾病、过敏性疾病感染性疾病、过敏性疾病 7 7糖尿病糖尿病 胰岛素、血清胰岛素、血清C-C-肽、血浆胰高糖素等。肽、血浆胰高糖素等。四、临床应用四、临床应用第50页，讲稿共51张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第51页，讲稿共51张，创作于星期日