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1、蛋白质的化学修饰第1页，此课件共33页哦主主 要要 内内 容容化学修饰的原理化学修饰的原理化学修饰的原理化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性蛋白质化学修饰的局限性蛋白质化学修饰的局限性蛋白质化学修饰的局限性第2页，此课件共33页哦一、化学修饰的原理一、化学修饰的原理概念概念概念概念：从广义上说，凡是通过化学基团的引入或除：从广义上说，凡是通过化学基团的引入或除：从广义上说，凡是通过化学基团
2、的引入或除：从广义上说，凡是通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为蛋白蛋白蛋白蛋白质的化学修饰质的化学修饰质的化学修饰质的化学修饰。有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性活性活性活性(称称称称非必需部分的修饰非必需部分的修饰非必需部分的修饰非必需部分的修饰););但大多情况下将导致生但大多情况下将导致生但
3、大多情况下将导致生但大多情况下将导致生物活性的改变物活性的改变物活性的改变物活性的改变(如下降以至完全丧失如下降以至完全丧失如下降以至完全丧失如下降以至完全丧失)。影响蛋白质化学修饰反应进程的因素影响蛋白质化学修饰反应进程的因素影响蛋白质化学修饰反应进程的因素影响蛋白质化学修饰反应进程的因素：1.1.蛋蛋蛋蛋白质功能基的反应性；白质功能基的反应性；白质功能基的反应性；白质功能基的反应性；2.2.修饰剂的反应性。修饰剂的反应性。修饰剂的反应性。修饰剂的反应性。第3页，此课件共33页哦主主 要要 内内 容容化学修饰的原理化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联
4、蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性蛋白质化学修饰的局限性第4页，此课件共33页哦二、二、蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。其与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。其与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。其与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。其重要作用重要作用重要作用重要作用是用
5、于探测活性部位的结构。是用于探测活性部位的结构。是用于探测活性部位的结构。是用于探测活性部位的结构。理想情况下理想情况下理想情况下理想情况下,修饰试剂只是选择性地与某一特定的残基反修饰试剂只是选择性地与某一特定的残基反修饰试剂只是选择性地与某一特定的残基反修饰试剂只是选择性地与某一特定的残基反应应应应,很少或几乎不引起蛋白质分子构象变化。很少或几乎不引起蛋白质分子构象变化。很少或几乎不引起蛋白质分子构象变化。很少或几乎不引起蛋白质分子构象变化。在在在在2020种常见种常见种常见种常见AAAA残基中，仅具极性的侧链基团才能够进行化学残基中，仅具极性的侧链基团才能够进行化学残基中，仅具极性的侧链基
6、团才能够进行化学残基中，仅具极性的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。第5页，此课件共33页哦蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰2.1 特定的特定的AA残基侧链基团的反应试剂残基侧链基团的反应试剂（4种方法）种方法）2.2 巯基的化学修饰巯基的化学修饰2.3 氨基的化学修饰（氨基的化学修饰（3种方法）种方法）2.4 羧基的化学修饰羧基的化学修饰2.5 咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰2.6 二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰第6页，此课件共33页哦2.1 特定的
7、特定的AA残基侧链残基侧链基团的反应试剂（基团的反应试剂（4种）种）2.1.1 酰化及其相关反应酰化及其相关反应 这类化学修饰试剂如这类化学修饰试剂如这类化学修饰试剂如这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、硫代三乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、硫代三乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、硫代三乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和氟乙酸乙酯和氟乙酸乙酯和氟乙酸乙酯和O-O-甲基异脲甲基异脲甲基异脲甲基异脲等，在室温等，在室温等，在室温等，在室温(20C25C)(20C25C)，pH pH 4.5 9.04.5 9.0的条件下可与蛋白质某些侧链基团如的条件下可与蛋白质某些侧链基团如的条件下可与蛋白质某些侧链基团如的条
8、件下可与蛋白质某些侧链基团如 -NH-NH2 2、-OH-OH、-SH-SH及酚基及酚基及酚基及酚基等发生酰基化反应。等发生酰基化反应。等发生酰基化反应。等发生酰基化反应。第7页，此课件共33页哦2.1.2 烷基化反应烷基化反应 此类试剂此类试剂此类试剂此类试剂 (如如如如DNFBDNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物、碘甲烷卤代物、碘甲烷卤代物、碘甲烷卤代物、碘甲烷等等等等 )常常常常带有活泼的卤素原子带有活泼的卤素原子带有活泼的卤素原子带有活泼的卤素原子，因其电负性，因其电负性，因其电负性，因其
9、电负性而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋白质分子的而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋白质分子的而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋白质分子的而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋白质分子的亲核基团亲核基团亲核基团亲核基团 (如如如如-NH-NH2 2、-SH-SH、-COOH-COOH、-SCH-SCH3 3和咪唑基和咪唑基和咪唑基和咪唑基 )发生烷基发生烷基发生烷基发生烷基化。化。化。化。第8页，此课件共33页哦2.1.3 氧化和还原反应氧化和还原反应HH2 2OO2 2、N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺等具有很强氧化性，能将侧链等具有很强氧化性，能将侧链等具有很强氧化性，
10、能将侧链等具有很强氧化性，能将侧链基团基团基团基团(-SH-SCH-SH-SCH3 3 吲哚基吲哚基吲哚基吲哚基 咪唑基和酚基咪唑基和酚基咪唑基和酚基咪唑基和酚基)氧化氧化氧化氧化,往往易使往往易使往往易使往往易使肽链断裂肽链断裂肽链断裂肽链断裂(故要控制好氧化条件故要控制好氧化条件故要控制好氧化条件故要控制好氧化条件););光敏剂存在下的光氧化光敏剂存在下的光氧化光敏剂存在下的光氧化光敏剂存在下的光氧化是比较温和的氧化作用。是比较温和的氧化作用。是比较温和的氧化作用。是比较温和的氧化作用。2-2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇巯基乙
11、醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)(DTT)等主要用等主要用等主要用等主要用于于于于-S-S-S-S-的还原剂。的还原剂。的还原剂。的还原剂。连四硫酸钠连四硫酸钠连四硫酸钠连四硫酸钠或钾或钾或钾或钾是一温和的氧化剂，是一温和的氧化剂，是一温和的氧化剂，是一温和的氧化剂，常用于常用于常用于常用于-SH-SH的可逆的可逆的可逆的可逆保护剂。保护剂。保护剂。保护剂。第9页，此课件共33页哦2.1.4 芳香环取代反应芳香环取代反应蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质AAAA残基的残基的残基的残基的酚羟基在酚羟基在酚羟基在酚羟基在3 3和和和和5 5位位位位上易于发生亲电取上易于发生亲电取上易于发生亲电取上易于发生
12、亲电取代的代的代的代的碘化和硝化碘化和硝化碘化和硝化碘化和硝化反应。这类修饰反应的典型例子为反应。这类修饰反应的典型例子为反应。这类修饰反应的典型例子为反应。这类修饰反应的典型例子为四四四四硝基甲烷硝基甲烷硝基甲烷硝基甲烷(TNM),(TNM),可以作用于可以作用于可以作用于可以作用于TyrTyr的酚羟基的酚羟基的酚羟基的酚羟基,形成形成形成形成3-3-硝硝硝硝基基基基TyrTyr衍生物。这种产物有特殊光谱，可用于直接的衍生物。这种产物有特殊光谱，可用于直接的衍生物。这种产物有特殊光谱，可用于直接的衍生物。这种产物有特殊光谱，可用于直接的定量测定。定量测定。定量测定。定量测定。第10页，此课件
13、共33页哦蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰2.1 特定的特定的AA残基侧链基团的反应试剂残基侧链基团的反应试剂（4种方法）种方法）2.2 巯基的化学修饰巯基的化学修饰2.3 氨基的化学修饰（氨基的化学修饰（3种方法）种方法）2.4 羧基的化学修饰羧基的化学修饰2.5 咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰2.6 二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰第11页，此课件共33页哦2.2 巯基的化学修饰巯基的化学修饰巯基具有很强的亲核性，巯基具有很强的亲核性，是蛋白质分子中最是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。容易反应的侧链基团。常用的修饰剂有常用的修饰剂有3种：种：1.烷基化试剂烷基化试剂特别是特别是碘乙酸碘
14、乙酸和和碘乙酰胺碘乙酰胺是很是很重要的重要的-SH修饰剂。修饰产物相当稳定，易修饰剂。修饰产物相当稳定，易于分析。此类试剂还能与于分析。此类试剂还能与MetLysHis反应。反应。第12页，此课件共33页哦2.2.有机汞试剂有机汞试剂有机汞试剂有机汞试剂是最早使用的是最早使用的是最早使用的是最早使用的-SH-SH修饰剂之一，其中最常修饰剂之一，其中最常修饰剂之一，其中最常修饰剂之一，其中最常用的是用的是用的是用的是对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸，它与，它与，它与，它与-SH-SH形成的衍生物在形成的衍生物在形成的衍生物在形成的衍生物在250nm250nm处有最大吸收，可容许低
15、浓度蛋白质的光谱定量分析。处有最大吸收，可容许低浓度蛋白质的光谱定量分析。处有最大吸收，可容许低浓度蛋白质的光谱定量分析。处有最大吸收，可容许低浓度蛋白质的光谱定量分析。其中其中其中其中2-2-氯汞氯汞氯汞氯汞-4-4-硝基苯酚硝基苯酚硝基苯酚硝基苯酚(MNP)(MNP)与蛋白质分子中侧链与蛋白质分子中侧链与蛋白质分子中侧链与蛋白质分子中侧链-SHSH反应很快反应很快反应很快反应很快,并在并在并在并在395nm395nm处产生处产生处产生处产生1 1个负差吸收峰个负差吸收峰个负差吸收峰个负差吸收峰.3.-SH3.-SH的氧化的氧化的氧化的氧化也是一种专一性很高的化学修饰手段也是一种专一性很高的
16、化学修饰手段也是一种专一性很高的化学修饰手段也是一种专一性很高的化学修饰手段.HH2 2OO2 2一般用于氧化一般用于氧化一般用于氧化一般用于氧化-SH-SH形成形成形成形成-S-S-S-S-或在较大量时形成磺或在较大量时形成磺或在较大量时形成磺或在较大量时形成磺酸，也可以生成次磺酸。酸，也可以生成次磺酸。酸，也可以生成次磺酸。酸，也可以生成次磺酸。第13页，此课件共33页哦蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰2.1 特定的特定的AA残基侧链基团的反应试剂残基侧链基团的反应试剂（4种方法）种方法）2.2 巯基的化学修饰巯基的化学修饰2.3 氨基的化学修饰（氨基的化学修饰（3种方法）种方法）2.4
17、羧基的化学修饰羧基的化学修饰2.5 咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰2.6 二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰第14页，此课件共33页哦2.3 氨基的化学修饰氨基的化学修饰氨基的修饰可分为三类氨基的修饰可分为三类氨基的修饰可分为三类氨基的修饰可分为三类：引入正电荷的修饰；电荷：引入正电荷的修饰；电荷：引入正电荷的修饰；电荷：引入正电荷的修饰；电荷消失的修饰；引入负电荷的修饰。消失的修饰；引入负电荷的修饰。消失的修饰；引入负电荷的修饰。消失的修饰；引入负电荷的修饰。第15页，此课件共33页哦2.3.1 引入正电荷的修饰引入正电荷的修饰Lys-Lys-NH-NH2 2以非质子化形式存在时很活泼以非质
18、子化形式存在时很活泼以非质子化形式存在时很活泼以非质子化形式存在时很活泼,是蛋白质分子是蛋白质分子是蛋白质分子是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团，中亲核反应活性很高的基团，中亲核反应活性很高的基团，中亲核反应活性很高的基团，可被选择性修饰。可被选择性修饰。可被选择性修饰。可被选择性修饰。LysLys修饰后侧链留下可电离的带正电的基团。修饰后侧链留下可电离的带正电的基团。修饰后侧链留下可电离的带正电的基团。修饰后侧链留下可电离的带正电的基团。还原烷基化还原烷基化还原烷基化还原烷基化：醛醛醛醛与与与与LysLys侧链侧链侧链侧链反应形成反应形成反应形成反应形成希夫碱希夫碱希夫碱希夫碱，再用，再用
19、，再用，再用硼氢化硼氢化硼氢化硼氢化钠（钠（钠（钠（NaBHNaBH4 4）还原希夫碱，得到稳定衍生物。还原希夫碱，得到稳定衍生物。还原希夫碱，得到稳定衍生物。还原希夫碱，得到稳定衍生物。P-NHP-NH2 2 +RCHO P-N=CHR P-NH-CH+RCHO P-N=CHR P-NH-CH2 2R R -H2O+H2OH第16页，此课件共33页哦2.3.2 电荷消失的修饰电荷消失的修饰这类试剂可抑制这类试剂可抑制这类试剂可抑制这类试剂可抑制Lys-Lys-NH-NH2 2的质子化的质子化的质子化的质子化,使形成的衍生物不带使形成的衍生物不带使形成的衍生物不带使形成的衍生物不带电。电。电。
20、电。1.1.乙酰化乙酰化乙酰化乙酰化：在微碱性：在微碱性：在微碱性：在微碱性pHpH下，下，下，下，氨基氨基氨基氨基与与与与乙酸酐反乙酸酐反乙酸酐反乙酸酐反应生成乙酰化应生成乙酰化应生成乙酰化应生成乙酰化衍生物。衍生物。衍生物。衍生物。2.2.芳香化芳香化芳香化芳香化：三硝基苯磺酸与氨基作用：三硝基苯磺酸与氨基作用：三硝基苯磺酸与氨基作用：三硝基苯磺酸与氨基作用,生成的衍生物为黄色，生成的衍生物为黄色，生成的衍生物为黄色，生成的衍生物为黄色，可定量测定可定量测定可定量测定可定量测定-NH-NH2 2。(其它其它其它其它:DNFBDNS):DNFBDNS)三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸三硝
21、基苯磺酸 (TNBS)(TNBS)第17页，此课件共33页哦2.3.3 引入负电荷的修饰引入负电荷的修饰1 1.乙酰化乙酰化乙酰化乙酰化:此反应类似于此反应类似于此反应类似于此反应类似于乙酸酐乙酸酐乙酸酐乙酸酐与与与与氨基氨基氨基氨基反应反应反应反应,但酸酐但酸酐但酸酐但酸酐(如如如如琥珀酸酐琥珀酸酐琥珀酸酐琥珀酸酐)所带负电荷全部引入到侧链上。所带负电荷全部引入到侧链上。所带负电荷全部引入到侧链上。所带负电荷全部引入到侧链上。2.2.烷基化烷基化烷基化烷基化：第18页，此课件共33页哦蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰2.1 特定的特定的AA残基侧链基团的反应试剂残基侧链基团的反应试剂（4种方
22、法）种方法）2.2 巯基的化学修饰巯基的化学修饰2.3 氨基的化学修饰（氨基的化学修饰（3种方法）种方法）2.4 羧基的化学修饰羧基的化学修饰2.5 咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰2.6 二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰第19页，此课件共33页哦2.4 羧基的化学修饰羧基的化学修饰由于羧基在水溶液中的化学性质由于羧基在水溶液中的化学性质由于羧基在水溶液中的化学性质由于羧基在水溶液中的化学性质,使得蛋白质分子中使得蛋白质分子中使得蛋白质分子中使得蛋白质分子中GluGlu和和和和AspAsp的修饰很有限的修饰很有限的修饰很有限的修饰很有限,产物一般是酯类或酰胺类产物一般是酯类或酰胺类产物一般是酯
23、类或酰胺类产物一般是酯类或酰胺类.目前最常用的标目前最常用的标准方法准方法,在比较温在比较温和的条件下就可进和的条件下就可进行行胃蛋白酶与胃蛋白酶与 1414CC硼氟硼氟化三甲洋盐在化三甲洋盐在pH 5pH 5时时酶完全失活酶完全失活,研究表明研究表明两两-COOH-COOH为该酶必需为该酶必需基团基团第20页，此课件共33页哦蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰2.1 特定的特定的AA残基侧链基团的反应试剂残基侧链基团的反应试剂（4种方法）种方法）2.2 巯基的化学修饰巯基的化学修饰2.3 氨基的化学修饰（氨基的化学修饰（3种方法）种方法）2.4 羧基的化学修饰羧基的化学修饰2.5 咪唑基的化学
24、修饰咪唑基的化学修饰2.6 二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰第21页，此课件共33页哦2.5 咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰His残基的咪唑基可通过残基的咪唑基可通过N原子的烷基化原子的烷基化或或C原子的亲核取代原子的亲核取代来进行修饰。来进行修饰。焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的是最常用的His残残基的修饰试剂基的修饰试剂,在近中性时专一性较好在近中性时专一性较好,使使His残基的咪唑基上残基的咪唑基上1个个N羧乙基化羧乙基化,并使并使得在得在240nm处的光吸收增加。在碱性条处的光吸收增加。在碱性条件下该取代反应是可逆的。件下该取代反应是可逆的。第22页，此课件共33页哦蛋白
25、质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰2.1 特定的特定的AA残基侧链基团的反应试剂残基侧链基团的反应试剂（4种方法）种方法）2.2 巯基的化学修饰巯基的化学修饰2.3 氨基的化学修饰（氨基的化学修饰（3种方法）种方法）2.4 羧基的化学修饰羧基的化学修饰2.5 咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰2.6 二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰第23页，此课件共33页哦2.6 二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰同同同同-SH-SH类似类似类似类似,-S-S-,-S-S-具有其特有的特性具有其特有的特性具有其特有的特性具有其特有的特性,可用来进行特异的修可用来进行特异的修可用来进行特异的修可用来进行特异的修饰饰饰饰,
26、通常是通过还原的方法通常是通过还原的方法通常是通过还原的方法通常是通过还原的方法.这些方法通常与某些这些方法通常与某些这些方法通常与某些这些方法通常与某些-SH-SH修饰方修饰方修饰方修饰方法结合法结合法结合法结合,以阻止再氧化成以阻止再氧化成以阻止再氧化成以阻止再氧化成-S-S-S-S-或计算断裂开的或计算断裂开的或计算断裂开的或计算断裂开的-S-S-S-S-数目。数目。数目。数目。常用的有常用的有常用的有常用的有:巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇(具高度选择性和长的半衰期具高度选择性和长的半衰期具高度选择性和长的半衰期具高度选择性和长的半衰期.但要有变但要有变但要有变但要有变性剂性剂性剂性
27、剂,且使用大大过量的巯基乙醇且使用大大过量的巯基乙醇且使用大大过量的巯基乙醇且使用大大过量的巯基乙醇)、Cleland Cleland 试剂试剂试剂试剂包括包括包括包括二硫苏糖醇二硫苏糖醇二硫苏糖醇二硫苏糖醇(DTTDTT)及其差向异构体二硫赤藓糖醇及其差向异构体二硫赤藓糖醇及其差向异构体二硫赤藓糖醇及其差向异构体二硫赤藓糖醇(DTE(DTE)()(勿勿勿勿需过量还原剂需过量还原剂需过量还原剂需过量还原剂)。-S-S-S-S-经还原成为经还原成为经还原成为经还原成为-SH-SH，一般情况下很容易自动氧化，故需经，一般情况下很容易自动氧化，故需经，一般情况下很容易自动氧化，故需经，一般情况下很容
28、易自动氧化，故需经过过过过羧甲基羧甲基羧甲基羧甲基处理防止重新氧化。处理防止重新氧化。处理防止重新氧化。处理防止重新氧化。第24页，此课件共33页哦主主 要要 内内 容容化学修饰的原理化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性蛋白质化学修饰的局限性第25页，此课件共33页哦三、三、蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联双功能试剂双功能试剂双功能试剂双功能试剂：指具有两个反应活性部位，可在相隔较近的指具有两个反应活性部位，可在相隔较近的指具有两个反应活性部位，可在相隔较近的指具有两个反应活性部位，可在相隔
29、较近的两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、链间或蛋白质分两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、链间或蛋白质分两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、链间或蛋白质分两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、链间或蛋白质分子间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。子间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。子间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。子间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。双功能试剂还可将双功能试剂还可将双功能试剂还可将双功能试剂还可将一蛋白质分子一蛋白质分子一蛋白质分子一蛋白质分子偶联到偶联到偶联到偶联到一个化学惰性的一个化学惰性的一个化学惰性的一个化学惰性的水不溶性的
30、生物大分子上水不溶性的生物大分子上水不溶性的生物大分子上水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白质。，形成固定化蛋白质。，形成固定化蛋白质。，形成固定化蛋白质。表征交联在一起的氨基酸残基或蛋白质表征交联在一起的氨基酸残基或蛋白质表征交联在一起的氨基酸残基或蛋白质表征交联在一起的氨基酸残基或蛋白质,可提供许多可提供许多可提供许多可提供许多关于蛋白质构象和蛋白质间相互作用的信息。关于蛋白质构象和蛋白质间相互作用的信息。关于蛋白质构象和蛋白质间相互作用的信息。关于蛋白质构象和蛋白质间相互作用的信息。第26页，此课件共33页哦交联剂的应用交联剂的应用研究蛋白质的折叠研究蛋白质的折叠研究蛋白质的折叠研究蛋
31、白质的折叠:当蛋白质浓度很大时当蛋白质浓度很大时当蛋白质浓度很大时当蛋白质浓度很大时,交联剂也能形成分子间的交联交联剂也能形成分子间的交联交联剂也能形成分子间的交联交联剂也能形成分子间的交联键键键键,使蛋白质对变性趋于稳定。使蛋白质对变性趋于稳定。使蛋白质对变性趋于稳定。使蛋白质对变性趋于稳定。如如如如RajputRajput等用戊二醛将胰蛋白酶和胰糜蛋白酶等用戊二醛将胰蛋白酶和胰糜蛋白酶等用戊二醛将胰蛋白酶和胰糜蛋白酶等用戊二醛将胰蛋白酶和胰糜蛋白酶交联在一交联在一交联在一交联在一起。这种固定化的杂化酶的优点是，显著地降低了杂化起。这种固定化的杂化酶的优点是，显著地降低了杂化起。这种固定化的
32、杂化酶的优点是，显著地降低了杂化起。这种固定化的杂化酶的优点是，显著地降低了杂化酶中胰蛋白酶的自溶作用，同时也使反应器的体积大大酶中胰蛋白酶的自溶作用，同时也使反应器的体积大大酶中胰蛋白酶的自溶作用，同时也使反应器的体积大大酶中胰蛋白酶的自溶作用，同时也使反应器的体积大大缩小。缩小。缩小。缩小。酶分子内的交联常可提高酶分子构象的稳定性，防止酶分子内的交联常可提高酶分子构象的稳定性，防止酶分子内的交联常可提高酶分子构象的稳定性，防止酶分子内的交联常可提高酶分子构象的稳定性，防止酶失活。因此，设法增加酶分子表面交联键的数目是酶固酶失活。因此，设法增加酶分子表面交联键的数目是酶固酶失活。因此，设法增
33、加酶分子表面交联键的数目是酶固酶失活。因此，设法增加酶分子表面交联键的数目是酶固定化的方法之一。定化的方法之一。定化的方法之一。定化的方法之一。第27页，此课件共33页哦3.3 交联剂的应用交联剂的应用测定蛋白质亚基的量测定蛋白质亚基的量测定蛋白质亚基的量测定蛋白质亚基的量:如用如用如用如用辛二亚氨酸二甲酯辛二亚氨酸二甲酯辛二亚氨酸二甲酯辛二亚氨酸二甲酯作用于齐聚体蛋白质作用于齐聚体蛋白质作用于齐聚体蛋白质作用于齐聚体蛋白质,使在同一使在同一使在同一使在同一亚基内和多亚基间的亚基内和多亚基间的亚基内和多亚基间的亚基内和多亚基间的LysLys残基之间形成交联残基之间形成交联残基之间形成交联残基之
34、间形成交联,再进行再进行再进行再进行SDS-SDS-PAGE,PAGE,则可测定其分子量和亚基的数目则可测定其分子量和亚基的数目则可测定其分子量和亚基的数目则可测定其分子量和亚基的数目,以阐明亚基的以阐明亚基的以阐明亚基的以阐明亚基的组合情况组合情况组合情况组合情况(如单体、二聚体还是三聚体等）。如单体、二聚体还是三聚体等）。如单体、二聚体还是三聚体等）。如单体、二聚体还是三聚体等）。用交联剂还能测定蛋白质上残基间的距离。如用跨度用交联剂还能测定蛋白质上残基间的距离。如用跨度用交联剂还能测定蛋白质上残基间的距离。如用跨度用交联剂还能测定蛋白质上残基间的距离。如用跨度为为为为0.371.45nm
35、0.371.45nm的一系列亚氨酯交联糖原磷酸化酶的一系列亚氨酯交联糖原磷酸化酶的一系列亚氨酯交联糖原磷酸化酶的一系列亚氨酯交联糖原磷酸化酶b,b,再结合再结合再结合再结合SDS-PAGESDS-PAGE系统测定出系统测定出系统测定出系统测定出,在有效交联形成的四聚体上的在有效交联形成的四聚体上的在有效交联形成的四聚体上的在有效交联形成的四聚体上的两两两两LysLys残基间距离约为残基间距离约为残基间距离约为残基间距离约为0.8nm0.8nm。第28页，此课件共33页哦主主 要要 内内 容容化学修饰的原理化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联蛋白质化学修
36、饰的应用蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性蛋白质化学修饰的局限性第29页，此课件共33页哦五、五、蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的应用5.1 5.1 用于测定蛋白质分子中某种氨基酸的数量用于测定蛋白质分子中某种氨基酸的数量用于测定蛋白质分子中某种氨基酸的数量用于测定蛋白质分子中某种氨基酸的数量研究蛋白质性质时，常需测定其中含有某种研究蛋白质性质时，常需测定其中含有某种研究蛋白质性质时，常需测定其中含有某种研究蛋白质性质时，常需测定其中含有某种AAAA的数的数的数的数量。当然用量。当然用量。当然用量。当然用AAAA分析法可得到此数据。但当只需知道某分析法可得到此数据。但当只需知道某分
37、析法可得到此数据。但当只需知道某分析法可得到此数据。但当只需知道某一一一一AAAA的数量的数量的数量的数量,不需知道其它不需知道其它不需知道其它不需知道其它AAAA数量时数量时数量时数量时,则应建立仅对则应建立仅对则应建立仅对则应建立仅对某一氨基酸的快速灵敏的分析方法某一氨基酸的快速灵敏的分析方法某一氨基酸的快速灵敏的分析方法某一氨基酸的快速灵敏的分析方法,实际上是用于蛋实际上是用于蛋实际上是用于蛋实际上是用于蛋白质定量化学修饰。白质定量化学修饰。白质定量化学修饰。白质定量化学修饰。常用且灵敏度高的方法是常用且灵敏度高的方法是常用且灵敏度高的方法是常用且灵敏度高的方法是对氯汞苯甲酸与对氯汞苯甲
38、酸与对氯汞苯甲酸与对氯汞苯甲酸与-SH-SH作用作用作用作用;三硝基苯磺酸与三硝基苯磺酸与三硝基苯磺酸与三硝基苯磺酸与-NH-NH2 2作用。作用。作用。作用。用荧光法可测定微量蛋白用荧光法可测定微量蛋白用荧光法可测定微量蛋白用荧光法可测定微量蛋白质质质质,灵敏度高，常用荧光胺。灵敏度高，常用荧光胺。灵敏度高，常用荧光胺。灵敏度高，常用荧光胺。第30页，此课件共33页哦5.2 在蛋白质序列分析中的应用在蛋白质序列分析中的应用用于测定蛋白质及多肽化学结构的许多方法都是以用于测定蛋白质及多肽化学结构的许多方法都是以用于测定蛋白质及多肽化学结构的许多方法都是以用于测定蛋白质及多肽化学结构的许多方法都
39、是以蛋白质化学修饰为基础的。蛋白质化学修饰为基础的。蛋白质化学修饰为基础的。蛋白质化学修饰为基础的。A.A.控制酶解程度控制酶解程度控制酶解程度控制酶解程度:如常用胰蛋白酶专一水解碱性如常用胰蛋白酶专一水解碱性如常用胰蛋白酶专一水解碱性如常用胰蛋白酶专一水解碱性氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸(Arg(Arg和和和和Lys)Lys)的的的的-COOH-COOH所形成的肽键。若要使所形成的肽键。若要使所形成的肽键。若要使所形成的肽键。若要使胰蛋白酶只水解胰蛋白酶只水解胰蛋白酶只水解胰蛋白酶只水解ArgArg所形成的肽键所形成的肽键所形成的肽键所形成的肽键,可用三氟乙酰化可用三氟乙酰化可用三氟乙酰化可用三
40、氟乙酰化法将法将法将法将Lys-Lys-NH-NH2 2保护起来保护起来保护起来保护起来,使它转变为酶不能水解的使它转变为酶不能水解的使它转变为酶不能水解的使它转变为酶不能水解的产物。产物。产物。产物。B.B.化学裂解化学裂解化学裂解化学裂解:最理想且普遍采用的是最理想且普遍采用的是最理想且普遍采用的是最理想且普遍采用的是CNBrCNBr专一性裂专一性裂专一性裂专一性裂解解解解MetMet的的的的-COOH-COOH所形成的肽键。所形成的肽键。所形成的肽键。所形成的肽键。第31页，此课件共33页哦5.3 确定蛋白质残基的功能确定蛋白质残基的功能化学修饰结合保护实验可研究底物或其它配位体对化学修
41、饰结合保护实验可研究底物或其它配位体对化学修饰结合保护实验可研究底物或其它配位体对化学修饰结合保护实验可研究底物或其它配位体对修饰速度和程度影响。修饰速度和程度影响。修饰速度和程度影响。修饰速度和程度影响。如用磷酸吡哆醛修饰如用磷酸吡哆醛修饰如用磷酸吡哆醛修饰如用磷酸吡哆醛修饰Fru-6-PFru-6-P激酶时激酶时激酶时激酶时,发现有两个发现有两个发现有两个发现有两个LysLys被修饰被修饰被修饰被修饰,酶活力丧失酶活力丧失酶活力丧失酶活力丧失;而在而在而在而在Fru-2,6-PPFru-2,6-PP存在时存在时存在时存在时,则可减弱修饰作用则可减弱修饰作用则可减弱修饰作用则可减弱修饰作用,
42、保护激酶活力。保护激酶活力。保护激酶活力。保护激酶活力。若修饰的可逆性与生物功能的改变有对应关系若修饰的可逆性与生物功能的改变有对应关系若修饰的可逆性与生物功能的改变有对应关系若修饰的可逆性与生物功能的改变有对应关系,也可为也可为也可为也可为确定某一残基的可能功能提供有利证据确定某一残基的可能功能提供有利证据确定某一残基的可能功能提供有利证据确定某一残基的可能功能提供有利证据;用于蛋白质变构部位上必需用于蛋白质变构部位上必需用于蛋白质变构部位上必需用于蛋白质变构部位上必需AAAA残基的分析残基的分析残基的分析残基的分析,以及协以及协以及协以及协同作用所必需残基的表征。同作用所必需残基的表征。同
43、作用所必需残基的表征。同作用所必需残基的表征。第32页，此课件共33页哦5.4 蛋白质化学修饰在生物工程中的应用蛋白质化学修饰在生物工程中的应用提高酶的稳定性提高酶的稳定性提高酶的稳定性提高酶的稳定性：酶的固定化技术：酶的固定化技术：酶的固定化技术：酶的固定化技术改变酶的专一性改变酶的专一性改变酶的专一性改变酶的专一性：黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶：黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶：黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶：黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶的的的的-Cys-Cys共价结合，结果将有水解活性的木瓜蛋白酶转变为共价结合，结果将有水解活性的木瓜蛋白酶转变为共价结合，结果将有水解活性的木瓜蛋白酶转
44、变为共价结合，结果将有水解活性的木瓜蛋白酶转变为具有氧化还原活性的黄素木瓜蛋白酶。具有氧化还原活性的黄素木瓜蛋白酶。具有氧化还原活性的黄素木瓜蛋白酶。具有氧化还原活性的黄素木瓜蛋白酶。创造新的酶活性创造新的酶活性创造新的酶活性创造新的酶活性：许多重要的生物活性肽含：许多重要的生物活性肽含：许多重要的生物活性肽含：许多重要的生物活性肽含D-AAD-AA，因，因，因，因肽酶只对肽酶只对肽酶只对肽酶只对L-AAL-AA有专一性，因此不可能在肽酶催化下合成有专一性，因此不可能在肽酶催化下合成有专一性，因此不可能在肽酶催化下合成有专一性，因此不可能在肽酶催化下合成含有含有含有含有D-AAD-AA的肽。的肽。的肽。的肽。生产实践上的应用生产实践上的应用生产实践上的应用生产实践上的应用：医药：医药：医药：医药(甲醛使细菌毒素和病毒改性甲醛使细菌毒素和病毒改性甲醛使细菌毒素和病毒改性甲醛使细菌毒素和病毒改性)、毛纺毛纺毛纺毛纺(羊毛染色羊毛染色羊毛染色羊毛染色)、食品、食品、食品、食品(去除杂味去除杂味去除杂味去除杂味 怪味怪味怪味怪味)等。等。等。等。第33页，此课件共33页哦