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1、酶工程制药第1页，此课件共135页哦n n第一节概述n n第二节酶的来源和生产n n第三节酶和细胞的固定化n n第四节固定化酶和固定化细胞的反应器n n第五节酶工程在医药工业中的应用n n第六节酶工程研究的进展第2页，此课件共135页哦第一节概述第3页，此课件共135页哦一、酶的特性n n酶、酶促反应的定义n n酶除具有一般催化剂的共性外，还有其特有的特点：催化效率高；专一性强；反应条件温和；酶的催化活性受到调节和控制。n n1961年按酶所催化的反应类型将酶分成6大类：氧化还原酶类；转移酶类；水解酶类；裂合酶类；异构酶类；合成酶（或称连接酶）类。第4页，此课件共135页哦二、酶工程简介n n
2、酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术科学。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的新的技术科学。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。质的技术。n n20世纪世纪2020年代初：酶工程名称出现于自然酶制剂在工业上的年代初：酶工程名称出现于自然酶制剂在工业上的大规模应用；大规模应用；n n1953年，羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等用年，羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行固定
3、。重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行固定。n n1969年，固定化酶技术拆分年，固定化酶技术拆分DL-氨基酸氨基酸n n19711971年，年，1st国际酶工程会议：酶的生产、分离纯化、酶的国际酶工程会议：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的反应器、酶及固定化酶的应用等。固定化、酶及固定化酶的反应器、酶及固定化酶的应用等。第5页，此课件共135页哦二、酶工程简介n n从现代观点来看，酶工程主要有以下几个方面的研究从现代观点来看，酶工程主要有以下几个方面的研究内容：内容：酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发；应用开发；酶和细胞的固定化及酶反应器
4、的研究酶和细胞的固定化及酶反应器的研究（包括酶传感器、反应检测等）；（包括酶传感器、反应检测等）；酶生产中基因工酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究；程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究；酶酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究；系的研究；有机相中酶反应的研究；有机相中酶反应的研究；酶的抑制剂、酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究；激活剂的开发及应用研究；抗体酶、核酸酶的研究；抗体酶、核酸酶的研究；模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。第6页，此课件共135
5、页哦第二章酶的来源和生产第7页，此课件共135页哦一、酶的来源n n酶的来源主要是动植物和微生物，动植物细胞培养的方法可用于酶生产，目前工业化生产一般以微生物为主要来源。n n利用微生物生产酶的优点是：微生物种类繁多，动植物体内存在的酶，几乎都可从微生物中得到；微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量；微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌株。第8页，此课件共135页哦二、酶的生产菌n n1、对菌种的要求：（1）产酶量、酶的性质、最好是胞外酶；（2）不是致病菌；（3）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体；（4）能利用廉价的原料，发酵
6、周期短，易于培养。n n2、生产菌的来源：菌种保藏机构和有关研究部门，但大量的工作应是从自然界中分离筛选菌样采集、菌种分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。还应包括改良（如基因突变、基因转移和基因克隆）。n n3、目前常用的产酶微生物：大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、青霉菌、木霉菌、根霉菌链霉菌等。第9页，此课件共135页哦工业用部分主要酶的生产菌种微生物类别微生物类别微生物类别微生物类别菌名菌名菌名菌名产生的酶产生的酶产生的酶产生的酶用途用途用途用途细菌细菌细菌细菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶酒精与啤酒工业、洗涤剂、糊精加工、纺织品脱浆等酒精与啤酒工业、洗涤剂、糊精
7、加工、纺织品脱浆等酒精与啤酒工业、洗涤剂、糊精加工、纺织品脱浆等酒精与啤酒工业、洗涤剂、糊精加工、纺织品脱浆等蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶生丝脱胶、皮革脱毛、胶卷回收、酱油酿造生丝脱胶、皮革脱毛、胶卷回收、酱油酿造生丝脱胶、皮革脱毛、胶卷回收、酱油酿造生丝脱胶、皮革脱毛、胶卷回收、酱油酿造大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌L-L-天冬氨酸酶天冬氨酸酶天冬氨酸酶天冬氨酸酶生产生产生产生产L-L-天冬氨酸：治疗白血病天冬氨酸：治疗白血病天冬氨酸：治疗白血病天冬氨酸：治疗白血病青霉素酰化酶青霉素酰化酶青霉素酰化酶青霉素酰化酶制备新青霉素的母核制备新青霉素的母核制备新青霉素的母核制备新青霉素的母核6-6-氨
8、基青霉素烷酸氨基青霉素烷酸氨基青霉素烷酸氨基青霉素烷酸异型乳酸杆菌异型乳酸杆菌异型乳酸杆菌异型乳酸杆菌葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶由葡萄糖制果糖由葡萄糖制果糖由葡萄糖制果糖由葡萄糖制果糖短小芽孢杆菌短小芽孢杆菌短小芽孢杆菌短小芽孢杆菌碱性蛋白酶碱性蛋白酶碱性蛋白酶碱性蛋白酶皮革脱毛皮革脱毛皮革脱毛皮革脱毛产气气杆菌产气气杆菌产气气杆菌产气气杆菌异淀粉酶异淀粉酶异淀粉酶异淀粉酶分解淀粉的分解淀粉的分解淀粉的分解淀粉的-1,6-1,6-糖苷键糖苷键糖苷键糖苷键酵母酵母酵母酵母解脂假丝酵母解脂假丝酵母解脂假丝酵母解脂假丝酵母脂肪酶脂肪酶脂肪酶脂肪酶绢丝原料脱脂、洗涤剂、医药、乳品
9、增香绢丝原料脱脂、洗涤剂、医药、乳品增香绢丝原料脱脂、洗涤剂、医药、乳品增香绢丝原料脱脂、洗涤剂、医药、乳品增香啤酒酵母、假丝啤酒酵母、假丝啤酒酵母、假丝啤酒酵母、假丝酵母酵母酵母酵母转化酶转化酶转化酶转化酶制造转化糖制造转化糖制造转化糖制造转化糖霉菌霉菌霉菌霉菌点青酶点青酶点青酶点青酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶食品加工中食品去氧、除葡萄糖，作试剂测定葡食品加工中食品去氧、除葡萄糖，作试剂测定葡食品加工中食品去氧、除葡萄糖，作试剂测定葡食品加工中食品去氧、除葡萄糖，作试剂测定葡萄糖萄糖萄糖萄糖放线菌放线菌放线菌放线菌转化微白色放线转化微白色放线转化微白色放线转化微白色放线
10、菌菌菌菌蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶皮革脱毛皮革脱毛皮革脱毛皮革脱毛第10页，此课件共135页哦第三节酶和细胞的固定化第11页，此课件共135页哦酶应用过程中的一些不足酶应用过程中的一些不足n n酶的稳定性较差酶的稳定性较差酶的稳定性较差酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶等；和胃淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的蛋白酶等可以耐受较低的pHpH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。n n酶的一次性使用酶的一次性使用酶的一次性使用酶的一
11、次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。n n产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。无疑给产物的进一步
12、的分离纯化带来一定的困难。固定化技术固定化技术第12页，此课件共135页哦固定化酶的定义n n是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程叫做酶的固定化。固定化酶的过程叫做酶的固定化。n n固定化所采用的酶，可以是经提取分离后得到的有一固定化所采用的酶，可以是经提取分离后得到的有一定纯度的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞定纯度的酶，也可以是结合在
13、菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。碎片上的酶或酶系。第13页，此课件共135页哦n n酶类可粗分为天然酶和修饰酶，固定化酶属于修饰酶，修饰酶类还包括经过化学修饰的酶和用分子生物学方法在分子水平上进行改良的酶等。n n固定化酶最大特点是既具有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂的特性。固定化酶的特点第14页，此课件共135页哦固相酶还具有以下优点n n可多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高。如固定化的葡萄糖异构酶可以在6065条条件下连续使用超过件下连续使用超过1000h1000h；n n反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于
14、纯化，产品质量高；易于纯化，产品质量高；n n反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；n n酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少；n n比水溶性酶更适合于多酶反应。比水溶性酶更适合于多酶反应。第15页，此课件共135页哦n n酶的固定化就是通过载体将酶限制或固定于特定的空间位置，酶的固定化就是通过载体将酶限制或固定于特定的空间位置，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。用的酶制剂。n n由于酶的空间结构、活性位点等物理化学特性不同，因此并不由于酶的空间结构、活性位点等物理化学特性不同，因此并
15、不是一种固定化技术就能普遍适用于每一种酶，所以要根据酶的是一种固定化技术就能普遍适用于每一种酶，所以要根据酶的应用目的和特性，来选择其固定化方法。应用目的和特性，来选择其固定化方法。n n目前已建立的各种各样的固定化方法，按所用的载体和操作目前已建立的各种各样的固定化方法，按所用的载体和操作方法的差异，一般可分为载体结合法、包埋法及交联法方法的差异，一般可分为载体结合法、包埋法及交联法3 3类，类，细胞固定化还有选择性热变性（热处理）方法。细胞固定化还有选择性热变性（热处理）方法。酶和细胞的固定化方法第16页，此课件共135页哦酶和细胞的固定化方法载体结合法交联法包埋法热处理（细胞）物理吸附法
16、共价结合法网格型微囊型离子结合法第17页，此课件共135页哦（1）载体结合法n n载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。n n物理吸附法：是用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的一种固定化方法，此类载体有无机载体、天然高分子、大孔型合成树脂、疏水型的载体。物理吸附法的缺点在于最适吸附酶量无规律可循，不同载体和不同酶其吸附条件也不同，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，同时酶与载体之间的结合力不强，酶易于脱落，导致酶活力下降并污染产物。此法也可固定细胞；第18页，此课件共135页哦（1）载体结合法n n离子结合法：是通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上的固定化方法。此类载体有多糖
17、类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如DEAE-DEAE-纤维素、AmberliteCG-50、XE-97、IR-45和Dowex-50等。操作简单、酶的高级结构和活性中心的氨基酸不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是载体与酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或vpHvpH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。此法也可用于微生物细胞的固定化，细胞有自溶现象。第19页，此课件共135页哦（1）载体结合法n n共价结合法：共价结合法：n n共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法，也就共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法，也就是将酶分子上
18、非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共是将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。它是研究最广泛、内容最丰富的固定化方法，价结合的方法。它是研究最广泛、内容最丰富的固定化方法，其原理是酶分子上的功能团，如氨基、羧基、羟基、咪唑基、其原理是酶分子上的功能团，如氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基等和载体表面的反应基团之间形成共价键，因而将酶固巯基等和载体表面的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在载体上。定在载体上。n n共价结合法有数十种，如重氮化、迭氮化、酸酐活化法、酰氯法、异硫氰酸酯法、缩合剂法、溴化氰活化法、烷基化及硅烷化法等。n n在共价结合法中必须首先使载体活化，即
19、使载体获得能与酶在共价结合法中必须首先使载体活化，即使载体获得能与酶分子的某一特定基团发生特异反应的活泼基团；另外要考虑分子的某一特定基团发生特异反应的活泼基团；另外要考虑到酶蛋白上提供共价结合的功能团不影响酶的活性；反应条到酶蛋白上提供共价结合的功能团不影响酶的活性；反应条件尽可能温和。件尽可能温和。第20页，此课件共135页哦共价结合法的优缺点n n共价结合法与离子结合法和物理吸附法相比，反应条共价结合法与离子结合法和物理吸附法相比，反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了比较强烈的反应件苛刻，操作复杂，而且由于采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性条件，会引起酶
20、蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活性高的固定化酶，甚至中心，因此往往不能得到比活性高的固定化酶，甚至酶的底物专一性等性质也会发生变化。酶的底物专一性等性质也会发生变化。n n但是酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存但是酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。在盐类等原因而轻易脱落。第21页，此课件共135页哦（2）交联法n n交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。交联法有可分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载体交联法4种。其内容有酶分子交联、分子间交联或辅助蛋白与酶分子间交联；也可以先将
21、酶或细胞吸附于载体表面而后再交联或者在酶与载体之间进行交联。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2,2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯及己二酰亚胺二甲酯等。参与交联反应的酶蛋白的功能团有N-末端的-氨基、赖氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基及组氨酸的咪唑基等。第22页，此课件共135页哦交联法的优缺点n n交联法的反应条件比较强烈，固定化酶的酶活回收一般较低，但是尽可能降低交联剂的浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。第23页，此课件共135页哦n n最常用的交联剂是戊二醛，它的二个醛基与酶分子的游离氨基反应形成schiff碱，彼此交联，其方式如下：n nCH=N-酶酶
22、-N=CH-(CH2 2)3-CH=N-CH=N-酶=N=CH-交联方式NCH(CH2)3CHNNCH(CH2)3CHNn nCH=N-酶-N=CH-(CH-N=CH-(CH2 2)3-CH=N-酶酶=N=CH-第24页，此课件共135页哦交联法n n一般用交联法所得到的固定化酶颗粒小，结构性能差、酶活性低，故常与吸附法或包埋法联合使用。如先使用明胶（蛋白质）包埋，再用戊二醛交联；或先用尼龙（聚酰胺类）膜或活性炭、FeFe2O3等吸附后，再交联。由于酶的功能团，如氨基、等吸附后，再交联。由于酶的功能团，如氨基、酚基、羧基、巯基等参与了反应，会引起酶活性中心酚基、羧基、巯基等参与了反应，会引起酶
23、活性中心结构的改变，导致酶活性下降。为了避免和减少这种结构的改变，导致酶活性下降。为了避免和减少这种影响，常在被交联的酶溶液中添加一定量的辅助蛋白影响，常在被交联的酶溶液中添加一定量的辅助蛋白如牛血清白蛋白，以提高固定化酶的稳定性。如牛血清白蛋白，以提高固定化酶的稳定性。第25页，此课件共135页哦(3)包埋法n n包埋法分为网格型和微囊型两种。包埋法分为网格型和微囊型两种。n n将酶或细胞包埋在高分子凝胶网络中的称为网格型；将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。n n包埋法注意事项：防止高分子聚合造成酶的失活，只适于小分包埋法注意事项：防止高分子聚合造成酶的失活，只适于小分子底物和产物
24、。子底物和产物。n n网格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等网格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子和淀粉、明胶、胶原、海藻胶和角叉菜胶等天然合成高分子和淀粉、明胶、胶原、海藻胶和角叉菜胶等天然高分子。网格型包埋法是固定化细胞中用得最多、最有效的高分子。网格型包埋法是固定化细胞中用得最多、最有效的方法。方法。n n由包埋法制得的微囊型固定化酶通常为直径几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高第26页，此课件共135页哦（4）选择性热变性法n n专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理使细胞
25、膜蛋白变性但不使酶变形而使酶固定于细胞内的方法。第27页，此课件共135页哦4、酶和细胞的固定化载体n n在酶的固定化过程中所用的水不溶性固体支持物为载体或基质。固定化载体必须符合一定的条件：固定化过程不引起酶变性；对酸碱有一定的耐受性；有一定的机械强度；有一定的饿亲水性及良好的稳定性；有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；共价结合时具有可活化基团；有耐受酶和微生物细胞的能力；廉价易得。第28页，此课件共135页哦n n吸附载体，主要有物理吸附和离子吸附两种，物理吸附有无机物和有机物。n n包埋载体，目前工业上用的包埋载体主要有卡拉胶、海藻胶等。n n共价结合载体，有纤维素、SephadexA200
26、、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃等。n n交联法是通过双或多功能试剂进行固定化，因此不需要固定化载体。也可用与吸附法和包埋法相同的载体进行交联。酶和细胞固定化的载体第29页，此课件共135页哦5、固定化酶的制备技术n n（1）吸附法制备固定化酶技术n n（2）包埋法制备固定化酶技术第30页，此课件共135页哦（1）吸附法制备固定化酶技术n n物理吸附用酶的水溶液与对此酶具有高度吸附能力的载体混合洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶（易脱落，故不常用）n n离子交换吸附处理方法与物理吸附相同，但离子间力强（较常用）第31页，此课件共135页哦（2）包埋法制备固定化酶技术n n凝胶包埋法和微囊化包埋法：凝
27、胶包埋法和微囊化包埋法：n n凝胶包埋法将酶或细胞限制于高聚物网格中的将酶或细胞限制于高聚物网格中的技术；可以通过调节凝胶材料的浓度来改变包埋率技术；可以通过调节凝胶材料的浓度来改变包埋率和固定化酶的机械强度。还可通过先包埋再交联的和固定化酶的机械强度。还可通过先包埋再交联的方法，使保留更坚固。方法，使保留更坚固。n n微囊化法微囊化法将酶或细胞固定于不同构型的膜的外壳将酶或细胞固定于不同构型的膜的外壳内的技术。包有酶的半透膜厚约内的技术。包有酶的半透膜厚约20nm20nm，膜孔径40nm40nm，有界面沉降法和界面聚合法两种。，有界面沉降法和界面聚合法两种。第32页，此课件共135页哦界面沉
28、降法n n是物理法，其利用某些在水相和有机相界面上溶解度是物理法，其利用某些在水相和有机相界面上溶解度极低的高聚物成膜的过程将酶包埋的方法。其过程为极低的高聚物成膜的过程将酶包埋的方法。其过程为n n酶溶液在表面活性剂帮助下与水不混溶的沸点比水酶溶液在表面活性剂帮助下与水不混溶的沸点比水低的有机相中乳化低的有机相中乳化将溶于有机溶剂的高聚物加将溶于有机溶剂的高聚物加入搅拌下的乳化液中入搅拌下的乳化液中加入另一种不能溶解高聚加入另一种不能溶解高聚物的有机溶剂物的有机溶剂使高聚物在油水界面上沉淀、析使高聚物在油水界面上沉淀、析出及成膜出及成膜最后在乳化剂作用下使微囊从有机相中转移至水相，即成固定化
29、酶。第33页，此课件共135页哦界面聚合法n n是化学法，其利用不溶于水的高聚物单体在油-水界面上聚合成膜的过程制备微囊。成膜的高聚物有尼龙、聚酰胺及聚脲等。见下例：含酶的10%血红蛋白溶液己甲叉二胺水溶液+混合液1含1%Span85的氯仿-环己烷+混合液2溶于有机相的癸二酰氯+Tween20去乳化，转移至水相微囊第34页，此课件共135页哦（3）交联法制备固定化酶技术n n主要是多功能试剂的使用。n n交联酶法：主要是通过多功能试剂使酶分子间形成网络结构而固定化n n酶-辅助蛋白交联法：是指向酶溶液中加入辅助蛋白的辅助蛋白交联法：是指向酶溶液中加入辅助蛋白的交联过程，酶活回收率和机械强度较交
30、联酶法高。交联过程，酶活回收率和机械强度较交联酶法高。n n吸附交联法：吸附与交联相结合的方法吸附交联法：吸附与交联相结合的方法n n载体交联法：利用多功能试剂分子的一些化学基团载体交联法：利用多功能试剂分子的一些化学基团与载体偶联而另一些化学基团与酶分子偶联的方法。与载体偶联而另一些化学基团与酶分子偶联的方法。第35页，此课件共135页哦（4）共价结合法制备固定化酶技术n n共价结合法是通过酶分子的非活性基团与载体表面的活泼基团之间发生化学反应而形成共价键的连接法。n n共价结合法反应条件剧烈，常导致酶活下降或失活，成本因失败几率高或效率的低下而变得不太实用，因此在医药工业中应用较少。第36
31、页，此课件共135页哦二、固定化细胞的制备第37页，此课件共135页哦1、固定化细胞的定义n n将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。n n固定化细胞主要利用细胞内酶及酶系，它的应用比固定化酶更普遍。如今该技术已扩展至动植物细胞，甚至线粒体、叶绿体及微粒体等细胞器的固定化。第38页，此课件共135页哦2、固定化细胞的特点n n为什么要固定化？颗粒小、难于截流或定位，而固定化细胞不仅兼具细胞特性、生物催化功能及固相催化剂特点，还因为其具有以下特点：n n无需进行酶的分离纯化；细胞保持酶的原始状
32、态，故酶活回收率高；细胞内酶比固定化酶稳定性更高；细胞内酶的辅因子可以自动再生；细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；抗污染能力强。第39页，此课件共135页哦3、固定化细胞的制备技术n n固定化酶主要适用于细胞内酶，底物和产物易于透过细胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其它副反应，若有副反应应有相应消除措施。n n固定化细胞技术主要有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法。这些技术与前面提到的相关固定化酶的技术类似。第40页，此课件共135页哦三、固定化方法与载体的选择依据第41页，此课件共135页哦1、固定化方法的选择考虑因素n n（1）固定化酶应用的安全性：主要是指固定化过程中应用的试剂是否
33、有毒性和残留。n n（2）固定化酶在操作中的稳定性：主要从酶活和稳定性方面考虑，选择折中的条件。n n（3）固定化的成本：应尽可能降低成本。第42页，此课件共135页哦2、载体选择n n一般是为了工业化生产，因此性能好、价格便宜是一项重要的指标；此外，底物或产物性质都是重要的考虑对象。第43页，此课件共135页哦四、固定化酶的形状与性质第44页，此课件共135页哦1、固定化酶的形状n n目前已有多种物理形状的固定化酶，如酶膜、酶管、酶纤维、微囊和颗粒状的固定化酶。n n固定化酶的物理形状不仅是为了适应不同的应用目的及反应类型而制备相应形状，其最终形状还与基质的性质和制备方法有关。第45页，此课
34、件共135页哦n n（1）颗粒状固定化酶n n颗粒状固定化酶包括酶珠、酶块、酶片和酶粉等。n n制备简单，颗粒比表面大，转化效率高，适用于各种类型的反应器。n n（2）纤维状固定化酶n n只适用于填充床反应器，已有多种酶膜被制备出来。n n（3）管状固定化酶n n已制备出糖化酶、转化酶和脲酶等酶管。第46页，此课件共135页哦2、固定化酶的性质n n天然酶经过固定化后即成为固定化酶，其催化反应体系也由均相反应转变为非均相反应。n n由于固定化方法和所用载体性质不同，制备的固定化酶可能会受到扩散控制、空间障碍、微环境变化和化学修饰等因素的影响，可能会导致酶学性质和谜活力的变化。第47页，此课件共
35、135页哦（1）酶活力的变化n n一般酶活力是下降的，一般都会考虑相应的固定化一般酶活力是下降的，一般都会考虑相应的固定化过程可能对酶的影响，避免损害酶的活性中心，有过程可能对酶的影响，避免损害酶的活性中心，有时在固定化反应体系中会加入抑制剂、底物或产物时在固定化反应体系中会加入抑制剂、底物或产物以保护酶的活性中心。以保护酶的活性中心。n n乳糖酶的固定化就采用在其抑制剂葡萄糖乳糖酶的固定化就采用在其抑制剂葡萄糖-内酯存在下进行聚丙烯酰胺凝胶的包埋，如此可获得高活力的固定化乳糖酶。第48页，此课件共135页哦（2）酶稳定性的变化n n通常，大部分酶固定化后，虽然其活力有所下降，通常，大部分酶固
36、定化后，虽然其活力有所下降，但其稳定性大都有不同程度的改善。主要包括：但其稳定性大都有不同程度的改善。主要包括：操作稳定性，半衰期在操作稳定性，半衰期在1个月以上，可以认为其具有一定的工业应用价值；贮藏稳定性，一般固定化后应立即使用，但保存方法得当则其贮藏很长时间后，其酶活仍然具有可操作性；对蛋白酶的稳定性，固定化酶对蛋白酶具有很高的稳定性，但游离酶对蛋白酶的稳定性则很低。第49页，此课件共135页哦（3）酶学特性的变化n n经过固定化后，其底物专一性、最适pH、最适温度、动力学常数及最发反应速度等，均可能发生变化。第50页，此课件共135页哦五、固定化细胞的形状和性质第51页，此课件共135
37、页哦n n1、固定化细胞的形状：与固定化酶一样，可以具有珠状、块状、片状或纤维状等。工业上应用较多的是包埋法制备的各种形状的固定化细胞。n n2、固定化细胞的性质：一般是利用其胞内酶，底物和产物必需是小分子。固定化细胞的稳定性有一定提高。第52页，此课件共135页哦六、固定化酶活力的测定方法第53页，此课件共135页哦n n都可用在单位时间内，单位体积中的底物减少量或产物增加量来表示，通常在酶促反应中，如底物具有光吸收、旋光、电位差或荧光等性质的变化，可以进行直接测定。n n有可通过与酶产物相偶联的酶促反应来测定活力。第54页，此课件共135页哦第四节固定化酶和固定化细胞的反应器第55页，此课
38、件共135页哦4.1什么是酶反应器酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容器中酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度。进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合合适的场所和最佳的反应条件适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产
39、物。它处于酶催化应过程的中心地料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。位，是连接原料和产物的桥梁。第56页，此课件共135页哦酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图过程调控过程调控生物反应器生物反应器 消消毒毒原料原料预处理预处理 产物分产物分离提纯离提纯 产产品品生物催化剂生物催化剂制备制备空气空气除菌除菌能量能量热量热量第57页，此课件共135页哦酶的应用形式n n游离酶：主要用于物质转化、产品加工和三废处理游离酶：主要用于物质转化、产品加工和三废处理等过程，存在缺点是很难反复使用等过程，存在缺点是很难反复使
40、用 液体酶制剂液体酶制剂 固体酶制剂固体酶制剂n n固定化酶：主要用于物质转化、产品加工、工艺改进及三废处理等，由于固定化酶能反复使用，反应后很容易和反应液分离而保证产品质量n n完整细胞：利用细胞内各种酶的物质转化、三废处理等过程发挥作用 对于游离酶和固定化酶的选择，应考虑：对于游离酶和固定化酶的选择，应考虑：1）酶应用的性质）酶应用的性质和范围；和范围；2）酶的保存稳定性和操作稳定性；）酶的保存稳定性和操作稳定性；3）成本等。）成本等。第58页，此课件共135页哦4.2理想的酶反应器的要求n n生物反应器设计的主要目标：生物反应器设计的主要目标：生物反应器设计的主要目标：生物反应器设计的主
41、要目标：使产品的质量最高，生产成本最低使产品的质量最高，生产成本最低使产品的质量最高，生产成本最低使产品的质量最高，生产成本最低。n n评价生物反应器的主要标准：评价生物反应器的主要标准：评价生物反应器的主要标准：评价生物反应器的主要标准：反应器生产能力的大小和产品质量的高低反应器生产能力的大小和产品质量的高低反应器生产能力的大小和产品质量的高低反应器生产能力的大小和产品质量的高低。(4)(4)应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降。应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降。(1)所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），才能得到较所用生物催化
42、剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），才能得到较大的产品转化率。大的产品转化率。(2)(2)能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。(3)(3)应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。第59页，此课件共135页哦常见的酶反应器类型n n按按按按结构结构结构结构区分区分区分区分 搅拌罐式反应器（搅拌罐式反应器（搅拌罐式反应器（搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reac
43、tor,STRStirred Tank Reactor,STR）鼓泡式反应器鼓泡式反应器鼓泡式反应器鼓泡式反应器(bubble column reactor,BCR)(bubble column reactor,BCR)填充床式反应器填充床式反应器填充床式反应器填充床式反应器(packed column reactor,PCR)(packed column reactor,PCR)流化床式反应器流化床式反应器流化床式反应器流化床式反应器(Fluidized Bed Reactor,FBR)(Fluidized Bed Reactor,FBR)膜反应器膜反应器膜反应器膜反应器(Membrane
44、Reactor,MR)(Membrane Reactor,MR)喷射式反应器喷射式反应器喷射式反应器喷射式反应器n n按操作方式区分按操作方式区分按操作方式区分按操作方式区分 分批式反应分批式反应分批式反应分批式反应(batch)(batch)连续式反应连续式反应连续式反应连续式反应(continuous)(continuous)流加分批式反应流加分批式反应流加分批式反应流加分批式反应(feeding batch)(feeding batch)n n混合形式混合形式混合形式混合形式 连续搅拌罐反应器（连续搅拌罐反应器（连续搅拌罐反应器（连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred T
45、ank Reactor,CSTRContinuous Stirred Tank Reactor,CSTR）分批搅拌罐反应器（分批搅拌罐反应器（分批搅拌罐反应器（分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor,BSTRBatch Stirred Tank Reactor,BSTR）第60页，此课件共135页哦各种酶反应器的特点反应器类型反应器类型适用的操作方式适用的操作方式适用的酶适用的酶特点特点搅拌罐式反应器搅拌罐式反应器分批式分批式,流加分批式流加分批式连续式连续式,游离酶游离酶固定化酶固定化酶反应比较完全，反应条反应比较完全，反应条件容易调节控制。件容易调节控制。填
46、充床式反应器填充床式反应器连续式连续式固定化酶固定化酶密度大，可以提高酶催密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工业化反应的速度。在工业生产中普遍使用。生产中普遍使用。流化床反应器流化床反应器分批式分批式流加分批式流加分批式连续式连续式固定化酶固定化酶流化床反应器具有混合流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果均匀，传质和传热效果好，温度和好，温度和pH值的调值的调节控制比较容易，不易节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。液也可进行催化反应。第61页，此课件共135页哦反应器类型反应器类型适用的操作适用的操作方式方式适用的酶适用的酶 特点特点鼓泡式反应鼓
47、泡式反应器器分批式分批式流加分批式流加分批式连续式连续式游离酶游离酶固定化酶固定化酶鼓泡式反应器的结构简鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、小，混合效果好，传质、传热效率高传热效率高,适合于有气适合于有气体参与的反应。体参与的反应。膜反应器膜反应器连续式连续式游离酶游离酶固定化酶固定化酶清洗比较困难清洗比较困难 喷射式反应喷射式反应器器连续式连续式游离酶游离酶通入高压喷射蒸汽，实通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的适用于某些耐高温酶的反应反应第62页，此课件共135
48、页哦(1)间歇式酶反应器间歇式酶反应器n n又称为批量反应器（又称为批量反应器（又称为批量反应器（又称为批量反应器（Batch Reactor Batch Reactor BSTRBSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反）、间歇式搅拌罐、搅拌式反）、间歇式搅拌罐、搅拌式反）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下反应完成
49、之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。一批反应。一批反应。一批反应。n n优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。稳态。稳态。稳态。n n缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易
50、失去活性，故在工业生缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。第63页，此课件共135页哦(2)(2)连续式酶反应器n n又称为连续搅拌釜式反应器（又称为连续搅拌釜式反应器（又称为连续搅拌釜式反应器（又称为连续搅拌釜式反应器（Continuous Stirred Tank Reactor,Co