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1、课题分解纤维素的微生物的分离第1页，此课件共43页哦第2页，此课件共43页哦 纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。维素酶。草食性动物是怎样消化食物草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？中纤维素的？第3页，此课件共43页哦纤维素的分解需要在纤维素的分解需要在纤维素酶纤维素酶的催化的催化作用下完成。作用下完成。（一）纤维素与纤维素酶（一）纤维素与纤维素酶第4页，此课件
2、共43页哦 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般，一般认为它至少包括三种组分，即认为它至少包括三种组分，即C C1 1酶、酶、C CX X酶和葡萄糖苷酶酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。维二糖分解成葡萄糖。纤维素纤维素纤维二纤维二糖糖葡萄糖葡萄糖C1酶酶Cx酶酶葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶第5页，此课件共43页哦取二支取二支20mL的试管的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验实验：纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L的的醋酸醋
3、酸钠缓冲液醋酸醋酸钠缓冲液11ml和和10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？第6页，此课件共43页哦 在一支试管中添加纤维素酶，在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸醋酸钠缓冲液用量不同，但醋酸醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的都能维持相同的pHpH。实验分
4、析：该小实验是如何构实验分析：该小实验是如何构成对照的？成对照的？第7页，此课件共43页哦下列生物能分解纤维素的是（下列生物能分解纤维素的是（）人人 兔兔 牛牛 蘑菇蘑菇 纤维杆菌纤维杆菌A.B.C.D.C第8页，此课件共43页哦（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选1 1、筛选纤维素分解菌的方法是、筛选纤维素分解菌的方法是_ 该方法该方法可以通过可以通过_反应直接筛选。反应直接筛选。刚果红（刚果红（Congo RedCongo Red）染色法）染色法颜色颜色第9页，此课件共43页哦2 2、其原理是：刚果红可以与纤维素、其原理是：刚果红可以与纤维素形成形成_，当纤维素被，当纤维素被_
5、分解后，红色复合物无法分解后，红色复合物无法形成，出现以形成，出现以_为中心为中心的的_，我们可以通过，我们可以通过_来筛选纤维素分解菌。来筛选纤维素分解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈第10页，此课件共43页哦第11页，此课件共43页哦练一练：练一练：1.1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是下列关于纤维素酶的说法，错误的是A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁
6、D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖第12页，此课件共43页哦2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是下列说法错误的是A.刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物 B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了纤维素分解菌第13页，此课件共43页哦土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释将样品涂布到
7、鉴别将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培纤维素分解菌的培养基上养基上挑选产生透挑选产生透明圈的菌落明圈的菌落(三)第14页，此课件共43页哦分布环境分布环境1 1、土壤取样：、土壤取样：富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中操作步骤操作步骤 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。原因原因第15页，此课件共43页哦实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年
8、积累的枯枝败叶等。累的枯枝败叶等。讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约般应将滤纸埋于深约10cm10cm左右的土壤中。左右的土壤中。第16页，此课件共43页哦2 2、选择培养、选择培养 增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。品中分离所需要的微生物。目的：目的：制备选择培养
9、基：制备选择培养基：操作：操作：将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。第17页，此课件共43页哦培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵
10、母膏 0.5g生长因子、碳源、氮源生长因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮源、生长因子氮源、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水第18页，此课件共43页哦提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄或者将纤维素改为葡萄糖。糖。A A A A、以上配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、以上配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、以上配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、以上配方是液体培养基还是固体培养基？为
11、什么？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B B B B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？何进行选择的？何进行选择的？何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。素的微生物可以大
12、量繁殖。C C C C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用第19页，此课件共43页哦 说明：说明：分析分析“纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才
13、能大量繁殖。的微生物才能大量繁殖。第20页，此课件共43页哦 在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够适应适应这种这种营养条件的微生物得到营养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那些，而那些不适应不适应这这种营养条件的微生物的繁殖被种营养条件的微生物的繁殖被抑制抑制，因此可以起到，因此可以起到“浓缩浓缩”的作用。的作用。为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？第21页，此课件共43页哦比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理
14、原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养第22页，此课件共43页哦思考：本实验的流程与课题思考：本实验的流程与课题2 2中的实验流程有哪些异中的实验流程有哪些异同？同？本实验流程与课题本实验流程与课题2 2的流程的区别如下。课题的流程的区别如下。课题2 2是是将土样制成的菌悬液直接涂布在将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离的选择
15、性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通得到菌落。本课题通过过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。第23页，此课件共43页哦按照课题按照课题1 1的稀释操作方法，将选择培养后的的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释培养基进行等比稀释10101 110107 7倍。倍。3.3.梯度稀释梯度稀释101102103104105106第24页，此课件共43页哦4.4.将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养的培养基上基上（1 1）制备鉴别培养基）
16、制备鉴别培养基:（2 2）涂布平板：）涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml0.1ml涂涂布到平板培养基上，布到平板培养基上，3030倒置培养。倒置培养。第25页，此课件共43页哦培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤
17、维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)第26页，此课件共43页哦 挑选产生明显透明圈的菌落，一般即为挑选产生明显透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。分解纤维素的菌落。5 5、挑选产生透明圈的菌落、挑选产生透明圈的菌落第27页，此课件共43页哦刚果红染色法刚果红染色法方法一：方法一：先培养微生物，再加入刚先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应果红进行颜色反应 在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg1 mgmLmL的的CRCR溶液，溶液，101015 min15 min后倒去后倒去CRCR溶液，加入物质的
18、量浓度溶液，加入物质的量浓度为为l moll molL L的的NaCINaCI溶液，溶液，15 min15 min后倒掉后倒掉NaClNaCl溶液，此时，溶液，此时，产生纤维素酶的茵落周围将会出现透明圈。产生纤维素酶的茵落周围将会出现透明圈。第28页，此课件共43页哦方法一中方法一中NaClNaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考：漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌上刚果红是结
19、合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！分解纤维素的能就强！第29页，此课件共43页哦方法二：方法二：在倒平板时就加入刚果红在倒平板时就加入刚果红 配制质量浓度为配制质量浓度为10 mg10 mgmImI的的CRCR溶液，灭菌后，溶液，灭菌后，按照每按照每200 mI
20、200 mI培养基加入培养基加入1 mI1 mI的比例加入的比例加入CRCR溶液，溶液，混匀后倒平板，等培养基上长出茵落后，产生纤维素混匀后倒平板，等培养基上长出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。第30页，此课件共43页哦这两种方法各有哪些优点与不足？这两种方法各有哪些优点与不足？染色法染色法染色法染色法优优优优点点点点缺点缺点缺点缺点方法一方法一方法一方法一方法二方法二方法二方法二颜色反应基本颜色反应基本上是纤维素分上是纤维素分解菌的作用解菌的作用操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混刚果红会使菌落之间发生混杂杂操作简便不存操作简便不存在
21、菌落混杂问在菌落混杂问题题1.1.产生淀粉酶的微生物也产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈产生模糊透明圈2.2.有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。形成明显的透明圈。第31页，此课件共43页哦比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如
22、养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法第32页，此课件共43页哦 在在产生明显的透明圈产生
23、明显的透明圈的菌落，挑取并接的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30300 0C C 37370 0C C培养，可获得培养，可获得纯化培养纯化培养。6 6、纯化培养、纯化培养第33页，此课件共43页哦 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。解纤维素的微生物。
24、2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。（四）结果分析与评价（四）结果分析与评价第34页，此课件共43页哦 为了确定分离得到的是纤维素分解菌，为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行还需要进行_实验，纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。纤发酵
25、。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 葡萄糖葡萄糖 （五）课题延伸（五）课题延伸第35页，此课件共43页哦分解分解纤纤维素的维素的微生物微生物的分离的分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分
26、离出分解菌分离出分解菌第36页，此课件共43页哦D1 1、下列材料中纤维素含量最高的是、下列材料中纤维素含量最高的是 ()()A A杨树杨树 B B小麦小麦 C C玉米玉米 D D棉花棉花第37页，此课件共43页哦C2、纤维素酶能够分解、纤维素酶能够分解 ()A纤维素的微生物纤维素的微生物 B淀粉的微生物淀粉的微生物 C纤维素纤维素 D淀粉淀粉第38页，此课件共43页哦B3、刚果红能与哪项物质形成红色复合、刚果红能与哪项物质形成红色复合物物 ()A纤维二糖纤维二糖 B纤维素纤维素 C葡萄糖葡萄糖 D麦芽糖麦芽糖第39页，此课件共43页哦B4、寻找纤维素分解菌应到、寻找纤维素分解菌应到()A湿润
27、的环境中湿润的环境中 B富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中 C富含无机盐的环境中富含无机盐的环境中 D池塘中池塘中第40页，此课件共43页哦D5、纤维素分解菌的选择培养基有选择、纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有作用，原因在于其含有()ANaNO3 BKCl C酵母膏酵母膏 D纤维素粉纤维素粉第41页，此课件共43页哦A6、下列哪种生物能产生纤维素酶、下列哪种生物能产生纤维素酶()A纤维素分解菌纤维素分解菌 B牛牛 C羊羊 D兔兔第42页，此课件共43页哦D7、选择培养时应将锥形瓶固定、选择培养时应将锥形瓶固定在在()A桌子上桌子上 B温箱里温箱里 C窗台上窗台上 D摇床上摇床上第43页，此课件共43页哦