《实验33生物芯片的点样制备及检测核酸多态性.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验33生物芯片的点样制备及检测核酸多态性.pdf（8页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、实验实验 27 动物细胞基因组动物细胞基因组 DNA SNP 的生物芯片检测的生物芯片检测 实验目的：实验目的：制作点样型 DNA 芯片，用于检测特定的 DNA 片段；合成检测 10 条特定基因（或位点）的 DNA 探针，点样制备 DNA 微阵列芯片，检测上面实验中制备的双色荧光标记 cDNA。实验原理：实验原理：1、SNP 的概念及意义的概念及意义 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的 90%以上。SNP 在群体中的发
2、生频率不小于 1%。SNP 在人类基因组中广泛存在，平均每 5001000 个碱基对中就有 1 个，目前已发现约 400 万个 SNP 遗传标记。SNP 所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）指同型碱基之间的转换，如嘌呤与嘌呤(G-A)、嘧啶与嘧啶(T-C)间的替换或颠换（transversion）指发生在嘌呤与嘧啶(A-T、A-C、C-G、G-T)之间的替换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的 SNP 并不包括后两种情况。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是 3 个或 4 个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以
3、忽略。因此，通常所说的 SNP 都是二等位多态性的。SNP 变异可能是转换（CT，在其互补链上则为 GA），也可能是颠换（CA，GT，CG，AT）。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的 SNP 约占 2/3，其它几种变异的发生几率相似。转换已 CT 为主（图 27-1），其原因是 CpG 的 C是甲基化的，容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶 T，CpG 也因此变为突变热点。图 27-1（From:http:/science.marshall.edu/murraye）根据人类基因组的研究资料，DNA 的核苷酸序列在不同个体中至少有 99.9是相同的；但在任意选定的两个个体中，DNA 序
4、列可以有数以百万计的变异点，其中绝大多数都属于SNP。SNP 是人类基因组 DNA 序列中最常见的变异形式。据估计，发生在基因的蛋白质编生物秀-专心做生物！w w w.b b io o.c o m易生物-领先的生物医药商务平台w w w.e b io e.c o m易生物 w w w.eb io e.c o m码区的约 4 万个 SNP，可以导致蛋白质合成时氨基酸的“错义”改变。现已知，至少 93的人类基因都存在 SNP。人类基因组 SNP 研究所揭示的人种、人群和个体之间 DNA 序列的差异以及这些差异所表现的意义将对疾病的诊断、治疗和预防带来革命性的变化。SNP 被称为“第三代 DNA 遗
5、传标记”。这种遗传标记的特点是单个碱基的置换，与第一代的 RFLP 及第二代的 STR 以长度的差异作为遗传标记的特点截然不同。SNP 的分布密集，在人类基因组中被认为有 300 万个以上的 SNP 遗传标记，这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限，因此被认为是应用前景最好的遗传标记物。2、SNP 检测方法检测方法 传统的 SNP 检测方法是采用一些已有的成熟技术，如 DNA 测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳分析（DGGE），温度梯度凝胶电泳(TGGE)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、等位基因特异聚合酶链反应分析（AS-PCR
6、）等。但这些必须通过凝胶电泳进行检测，因此，距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。传统的 RFLP 只能检测到 SNP 的一部分，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，不适宜于 SNP 的检测；SSCP 则很难满足自动化的需要，难以大规模开展工作。因此，这些方法均未被广泛采用。目前已有多种新兴的方法可用于 SNP 检测，如变性的高效液相色谱检测(DHPLC)、等位基因特异性延伸（allele-specific primer extension，ASPE）、单碱基延伸（single base extension，SBE）技术、DNA 列阵微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接（O
7、LA）、TaqMan 探针技术、分子信标（molecular beacons）技术、Minisequencing、DNA 芯片等。其中基因芯片技术具有高通量、简便快捷、平行化和成本低廉等优点，且芯片技术的高密度探针矩阵可为大规模 SNP 分型提供一个高效检测途径。芯片技术平台包括微球微点阵，纤维薄膜微点、玻璃片基微点阵芯片等，其探针密度跨越范围几百至上百万不等，其中GoldenGateTM所使用的微球芯片密度可达100万，Affymetrix SNP芯片密度近 200 万。DNA 芯片技术是近年来新开发的一种 DNA 序列变异检测工具。DNA 芯片(DNA chip)，也称生物芯片(bioch
8、ip)，其大小与计算机上的 CPU 芯片相似，约 1cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片，芯片上铺了一层肉眼看不见的 DNA 纤维“地毯”，即具有特定碱基序列的探针。待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上。由于 DNA 和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。目前，基于 DNA 芯片的 SNP 检测平台以及功能成为高通量、大规模、全基因组 SNP检测分析的主流技术。其中典型的代表是 Affymetrix 公司的 SNP 检测高密度 DNA 微阵列芯片。此外，还有 Illumina 公司的
9、SNP 检测芯片，如 Beadlab 平台，是 Illumina 公司整合GoldenGate 多通道位点特异性延伸扩增检测方案和 BeadArray 高密度微阵列技术，开发而成的顶级高通量 SNP 基因分型系统，每天可完成超过 44 万个基因分型。新的 Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0（图 27-2）产品的特点是超过 1,800,000 个遗传变异标志物，包括超过 906,600 个 SNP 和超过 946,000 个用于检测拷贝数变化的探针。大约有 482,000 个 SNPs 来自于前代产品 500K 和 SNP5.0 芯片。剩下 424,000s
10、 个 SNP 包括了来源于国际 HapMap 计划中的标签 SNPs，X，Y 染色体和线粒体上更具代表性的 SNPs，以及来自于重组热点区域和 500K 芯片设计完成后新加入 dbSNP 数据库的 SNPs。SNP6.0 还包括了 202,000 个用于检测 5,677 个已知拷贝数变异区域的探针，这些区域来源的于多伦多基因组变异体数据库。该数据库中的每个 3,182 个非重叠片断区域分别平均用 61 个探针来检测。除了检测这些已知的拷贝数多态区域，还有超过 744,000 个探针平均分配到整个基因组上，用来发现求知的拷贝数变异区域。设计方面 SNP 6.0 芯片只取最佳 SNP 位点和每组等
11、到位基因的一个完全匹配，并有三次重复检测，所以总共只有六个探针（表 22-1）。生物秀-专心做生物！w w w.b b io o.c o m易生物-领先的生物医药商务平台w w w.e b io e.c o m易生物 w w w.eb io e.c o m 表 22-1 Affymetrix 公司的 SNP5.0 和 SNP6.0 芯片的参数 SNP5.0 SNP6.0 芯片张数 1 1 覆盖 SNP 位点数（SNPs）500,568 906,600 拷贝数变化检测探针数（CNVs）420,000 946,000 全基因组上覆盖的平均物理距离 5.8Kb 3.1Kb 每个 SNP 位点探针数
12、8 6 位点检出率 99%99%一致性 99%99%图 27-2 Affymetrix 公司的 SNP6.0 芯片 图 27-3 反映了运用 Affymetrix 公司的 SNP6.0 芯片完成全基因组 SNP 检测的技术流程。图 27-3 Overview of the Genome-Wide Human SNP Assay Kit 5.0/6.0.Briefly,total genomic DNA(500 ng)is digested with Nsp I and Sty I restriction enzymes and ligated to adaptors that recogniz
13、e the cohesive 4 bp overhangs.All fragments resulting from restriction enzyme digestion,regardless of size,are substrates for adaptor ligation.A generic primer that recognizes the adaptor sequence is used to amplify adaptor-ligated DNA fragments.PCR conditions have been optimized to preferentially a
14、mplify fragments in the 200 to 1,100 bp size range.PCR amplification products 生物秀-专心做生物！w w w.b b io o.c o m易生物-领先的生物医药商务平台w w w.e b io e.c o m易生物 w w w.eb io e.c o mfor each restriction enzyme digest are combined and purified using polystyrene beads.The amplified DNA is then fragmented,labeled and
15、hybridized to the array.(From:http:/.tw)3、微点样法制备、微点样法制备 SNP 检测检测 DNA 微阵列芯片微阵列芯片 微点样法是制备 DNA 微阵列芯片的主要方法之一。该方法将事先设计并合成好的 DNA探针通过点样仪（arrayer）按照一定的排列方式微量针点或喷点固定到固体基底表面，制备成 DNA 微阵列芯片（图 27-4）。在芯片的制备过程中，基底材料的选择及其表面的化学修饰是至关重要的。许多材料都可以用作生物芯片的基底材料，如滤膜、玻璃片以及水凝胶膜。图 27-4 一种点样仪（arrayer），嵌入图为点样针 3.1、载玻片及其氨基硅烷化修饰、载
16、玻片及其氨基硅烷化修饰 由于玻片容易获得，具有本地荧光低、透明度高、热学性质好、硬度高、易于在表面进行化学修饰以固定核酸探针等特点，从而使之成为一种目前最为常用的生物芯片基底材料之一。此外载玻片表面光滑，而且没有多孔结构，标记的靶序列可以直接与固定探针结合，而不会受扩散效应的影响，具有较高的局部浓度和较快的杂交反应速度。这种没有多孔结构的表面也非常适合洗脱多于探针和非特异性吸附的标记靶标序列。大多数商品化的用于制备生物芯片的载玻片已经经过多聚赖氨酸、氨基硅烷或氨基修饰（图 27-5）。尽管光滑无孔的载玻片在生物芯片应用中具有很多优点，但是这种载玻片在固定结构化生物分子，如抗体分子或结构化的寡核
17、苷酸探针分子时很难保持其固有的分子结构；而且这种载玻片表面的固定能力有限，影响了检测灵敏度。载玻片的氨基硅烷化及 DNA 固定原理如图 27-5 所示。氨基修饰氨基硅烷化基底需要使可逆的希夫碱（Schiffs base）还原成稳定的烷胺键化合物，图 27-6 为硼氢化钠还原步骤示意图。3.2、载玻片上涂覆的水凝胶或聚合物膜：、载玻片上涂覆的水凝胶或聚合物膜：为了解决平滑无孔载玻片的缺陷，将一种功能化的三维亲水多孔凝胶（如聚丙烯酰氨凝胶块）铺在载玻片表面，作为固定 DNA 分子的基底材料（图 27-7）。多孔水凝胶材料结合生物秀-专心做生物！w w w.b b io o.c o m易生物-领先的
18、生物医药商务平台w w w.e b io e.c o m易生物 w w w.eb io e.c o m了平滑载玻片反应速度快和孔状材料可提供类似于液相的环境及较大的固定能力等优点。在这种基底上进行的杂交反应更接近于均一液相环境中的反应而不是固液界面的反应。而且这类多孔凝胶膜可在通用商品化的精密度较高的芯片点样仪和扫描仪上使用。这类水凝胶膜的缺陷是具有较高的荧光背景，反应完后需要经过长时间的清洗，才能除去表面非特异吸附的标记靶标；其次，在于液体接触时遇到较高杂交温度很容易破碎甚至溶解；最后，它的制备过程比较复杂，商品化的基片价格昂贵。琼脂糖中邻近的羟基可在较为温和的条件下被高碘酸钠氧化，生成醛基
19、。醛基可以与修饰了氨基的 DNA 分子探针反应形成希夫碱（图 27-7）。图 27-5 氨基硅烷化玻片的表面处理及氨基修饰的 DNA 探针的固定。醛基可以与修饰了氨基的 DNA 分子探针反应形成希夫碱（Schiffs base）。图 27-6 硼氢化钠还原希夫碱形成烷胺键化合物步骤示意图 3.3、寡核苷酸、寡核苷酸 DNA 微阵列芯片检测微阵列芯片检测 SNP 技术：技术：寡核苷酸芯片检测基因突变技术是基因芯片技术的一种。该技术用于检测基因突变的基本原理是在玻璃、硅等载体上，根据检测需要，设计、固定多个特异的寡核苷酸探针。而后将大量经扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子的待测 DNA 样品与之
20、杂交，若两者存在至少一个碱基的差异时，即可产生杂交结果即荧光信号值的差异。以此来判断待测样品与芯生物秀-专心做生物！w w w.b b io o.c o m易生物-领先的生物医药商务平台w w w.e b io e.c o m易生物 w w w.eb io e.c o m片上的哪一个探针完全配对，即可得出待测样品特定位点的碱基序列，从而判断是否存在突变及突变位点和类型。该法具有准确、快速、高效和高通量地分析生物基因信息的优点。图 27-7 琼脂糖膜的高碘酸钠活化及氨基修饰的 DNA 分子探针的固定 图 27-8 p53 基因突变的寡核苷酸 DNA 微阵列芯片检测（PNAS 1999,96:73
21、82-7387）人类 p53 位于 1713，全长 1620，含有 11 个外显子和 10 个内含子，分为野生型、突变型及介于两者之间的杂合状态等 3 种类型。最常见的 p53 突变为点突变，而点突变最常见的是单个碱基替换。p53 结构上有 5 个进化上的高度保守区，多数 p53 基因突变是发生在这些保守区内的 58 外显子上。p53 基因突变是人类多种恶性肿瘤最常见的基因改变，约有 50%以上的肿瘤患者发现有 p53 突变。因此检测 p53 基因突变对于确定肿瘤的病因!判断预后以生物秀-专心做生物！w w w.b b io o.c o m易生物-领先的生物医药商务平台w w w.e b io
22、 e.c o m易生物 w w w.eb io e.c o m及治疗方案的制定具有十分重要的意义。p53 基因突变的寡核苷酸 DNA 微阵列芯片检测如图 27-8 示意。阵列上的 DNA 探针 5个一组。每个探针除一个位点错配外，其他碱基与参考序列互补，称为“置换”位置。在“置换”位置，包括四种可能的核苷酸(A、C、G、T)和一个碱基的缺失。杂交条件优化后，荧光标记的待测 DNA 只与其序列最匹配的探针杂交，取得相对与组内其他四种探针更高的荧光信号。Affymetrix 公司 p53 基因突变检测寡核苷酸微阵列芯片包含针对 p53 基因每个碱基的探针组（5 个探针/碱基）。图 27-9 显示了
23、荧光标记的 p53 基因外显子 PCR 扩增产物与 p53基因突变检测寡核苷酸微阵列杂交后的荧光图象。示例图片：示例图片：图27-9 荧光标记的p53基因外显子PCR扩增产物与p53基因突变检测寡核苷酸微阵列杂交后的荧光图象（Nucl.Acids Res.2005,33:e90）生物秀-专心做生物！w w w.b b io o.c o m易生物-领先的生物医药商务平台w w w.e b io e.c o m易生物 w w w.eb io e.c o m 图 27-10 The genomic SNP detection assay.Human genomic DNA is hybridized
24、 to microarray-immobilized capture oligonucleotides harboring a single-nucleotide variation.After removing unbound gDNA,oligonucleotide-modified gold nanoparticles hybridize to the captured target nucleic acid.Following a wash step,signal amplification is performed.During this step,elementary silver is deposited on the gold nanoparticles,greatly enhancing their light-scattering ability.(From:http:/ w w.b b io o.c o m易生物-领先的生物医药商务平台w w w.e b io e.c o m易生物 w w w.eb io e.c o m