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1、实验九噬菌体效价的测定张理实验九噬菌体效价的测定张理珉珉现在学习的是第1页，共37页目的要求目的要求1、掌握噬菌体效价测定的原理及方法、掌握噬菌体效价测定的原理及方法2、观察噬菌斑的形态、观察噬菌斑的形态现在学习的是第2页，共37页实实 验验 内内 容容 一一培养基和实验物品的准备培养基和实验物品的准备现在学习的是第3页，共37页本次实验准备工作（本次实验准备工作（2 2人人/组）组）1 1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（pH 7.4-7.6pH 7.4-7.6 ）；（已准备好）（已准备好）（已准备好）（已准备好
2、）。2 2、测定效价时稀释用、测定效价时稀释用、测定效价时稀释用、测定效价时稀释用9ml9ml9ml9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液牛肉膏蛋白胨液体培养液牛肉膏蛋白胨液体培养液牛肉膏蛋白胨液体培养液 3 3支支/组，分装于组，分装于18180mm18180mm试管；试管；试管；试管；3 3 3 3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（、牛肉膏蛋白胨固体培养基（、牛肉膏蛋白胨固体培养基（、牛肉膏蛋白胨固体培养基（1.5%1.5%的琼脂）的琼脂）的琼脂）的琼脂）底层用，底层用，100ml/100ml/组，装于组，装于250ml250ml250ml250ml三角瓶，三角瓶，（用于制备（用于制备6 6 6 6个无菌平
3、板，倒薄一点）个无菌平板，倒薄一点）4 4、上层用上层用5ml5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8%0.8%的琼脂），的琼脂），融化后分装于融化后分装于15150mm15150mm试管中加塞包扎灭菌，试管中加塞包扎灭菌，6支支/组；组；组；组；（教师已准备好）（教师已准备好）（教师已准备好）（教师已准备好）5 5 5 5、1ml1ml1ml1ml无菌吸管无菌吸管 5 5 5 5支支支支/组。组。现在学习的是第4页，共37页实实 验验 内内 容容 二二噬菌体知识介绍噬菌体知识介绍现在学习的是第5页，共37页一、几个重要概念一、几个重要概念1、噬菌体：、噬菌体：是感染细
4、菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，分布极广，个体很小，在光学显物的病毒，分布极广，个体很小，在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。微镜下看不见，需用电镜观察。不同的噬菌体在电镜下有三种形态：不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蝌蚪形、微球形和丝形蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。蚪形，由头部和尾部两部分组成。现在学习的是第6页，共37页2、噬菌斑：、噬菌斑：在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞裂解形成的，其
5、形状、大小不等。裂解形成的，其形状、大小不等。3、噬菌体效价：、噬菌体效价：指指1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌体样品中所含具有侵染活性的噬菌体（烈性噬菌体）数量（烈性噬菌体）数量噬菌斑形成单位噬菌斑形成单位（pfu，plaque-forming unit）。）。效价（效价（titre，titer）这一名词在不同的场合）这一名词在不同的场合有其不同的含义（如抗生素等）有其不同的含义（如抗生素等）。现在学习的是第7页，共37页二、病毒粒子的构造（模型）二、病毒粒子的构造（模型）现在学习的是第8页，共37页噬噬菌菌体体的的形形态态及及分分类类科科属属现在学习的是第9页，共37页大大肠肠杆杆菌菌T
6、4噬噬菌菌体体结结构构示示意意图图现在学习的是第10页，共37页大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体结构示意图噬菌体结构示意图及电镜照片及电镜照片头部头部头部头部六角形基板六角形基板六角形基板六角形基板领环领环领环领环螺旋形尾鞘螺旋形尾鞘螺旋形尾鞘螺旋形尾鞘核心或管（中核心或管（中核心或管（中核心或管（中空）空）空）空）尾刺或刺突尾刺或刺突尾刺或刺突尾刺或刺突尾丝尾丝尾丝尾丝现在学习的是第11页，共37页噬菌斑示意照片噬菌斑示意照片宿主细宿主细菌菌苔菌菌苔噬菌斑噬菌斑现在学习的是第12页，共37页大大肠肠杆杆菌菌T噬噬菌菌斑斑的的表表型型形形态态现在学习的是第13页，共37页三、噬菌体的分类三、噬菌体的
7、分类根据噬菌体与宿主菌的相互关系根据噬菌体与宿主菌的相互关系烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage）能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌。体，并最终裂解细菌。温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage）噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬菌体菌体，但噬菌体DNA能随细菌能随细菌DNA复制，并复制，并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合态、随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合态、营养态三种形式。营养态三种形式。针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体、溶针对温和
8、噬菌体来说：前（原）噬菌体、溶源菌源菌现在学习的是第14页，共37页四、噬菌体繁殖（生活周期）四、噬菌体繁殖（生活周期）1 1、吸附、吸附2 2、侵入、侵入3 3、增殖（生物合成）、增殖（生物合成）4 4、成熟装配、成熟装配5 5、裂解释放、裂解释放现在学习的是第15页，共37页T4噬菌体吸附和噬菌体吸附和DNA的注入的注入现在学习的是第16页，共37页T偶偶数数噬噬菌菌体体感感染染大大肠肠杆杆菌菌的的扫扫描描电电镜镜照照片片现在学习的是第17页，共37页T4噬噬菌菌体体的的生生活活周周期期现在学习的是第18页，共37页T4噬噬菌菌体体的的装装配配现在学习的是第19页，共37页五、噬菌体的应用
9、五、噬菌体的应用1、细菌的鉴定与分型、细菌的鉴定与分型 噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性，即一噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性，即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细菌，故可种噬菌体只能裂解一种和它相应的细菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。用于未知细菌的鉴定和分型。2、遗传学及分子生物学研究的重要工具、遗传学及分子生物学研究的重要工具 噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细胞噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细胞简单得多，且易获得大量的突变体简单得多，且易获得大量的突变体构建构建基因文库（基因文库（噬菌体）；基因工程载体；噬菌噬菌体）；基因工程载体；噬菌体展示技术。体展示技术。现在学习的是第2
10、0页，共37页3 3、细菌感染的诊断与治疗、细菌感染的诊断与治疗 利用其专一性，可以诊断和治疗一些利用其专一性，可以诊断和治疗一些相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治疗已有应用）疗已有应用）但专一性也限制了噬菌体在临床上的广但专一性也限制了噬菌体在临床上的广泛应用（人们最需要的是广谱性）。泛应用（人们最需要的是广谱性）。现在学习的是第21页，共37页六、噬菌体的危害六、噬菌体的危害在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使生产难以完成。生产难以完成。表现形式：表
11、现形式：发酵周期明显延长；发酵周期明显延长；碳源消碳源消耗缓慢；耗缓慢；发酵液变清，镜检时，有大量异发酵液变清，镜检时，有大量异常菌体出现；常菌体出现；发酵产物的形成缓慢或根本发酵产物的形成缓慢或根本不形成；不形成；用敏感菌作平板检查时，出现大用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；量噬菌斑；用电子显微镜观察时，可见到用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在。有无数噬菌体粒子存在。轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。现在学习的是第22页，共37页七、以防为主的措施：七、以防为主的措施
12、：1、决不使用可疑菌种；、决不使用可疑菌种；2、严格保持环境卫生；、严格保持环境卫生；3、决不排放或随便丢弃活菌液；、决不排放或随便丢弃活菌液；4、注意通气质量、注意通气质量 空气过滤器要保证质量并经常空气过滤器要保证质量并经常进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在3040米高空；米高空；5、加强管道及发酵罐的灭菌；、加强管道及发酵罐的灭菌；6、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种；、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种；7、严格执行会客制度。、严格执行会客制度。现在学习的是第23页，共37页实实 验验 内内 容容 三三噬菌体效价的测定噬菌体效价的测定现在
13、学习的是第24页，共37页一、噬菌体效价测定的方法一、噬菌体效价测定的方法（梯度稀释）（梯度稀释）斑点试验法斑点试验法涂菌平板上滴加稀释液涂菌平板上滴加稀释液液体稀释试管法液体稀释试管法以不长菌判断（澄清）以不长菌判断（澄清）双层平板法双层平板法最常用，相对单层优点较多最常用，相对单层优点较多单层平板法单层平板法载玻片法载玻片法快速快速其它病毒的效价（计数）测定其它病毒的效价（计数）测定空斑计数、空斑计数、电子显微镜直接计数、电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝免疫学间接测定（凝集、集、ELISA酶标仪）酶标仪）滴度表示滴度表示现在学习的是第25页，共37页噬菌体效价测定的方法噬菌体效价测定
14、的方法现在学习的是第26页，共37页二、双层平板法二、双层平板法现在学习的是第27页，共37页二、双层平板法二、双层平板法3737约约约约4hr4hr双层平板法双层平板法双层平板法双层平板法双层平板法（双层平板法（双层平板法（双层平板法（1.5%1.5%琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基10mL10mL）双层平板法双层平板法双层平板法双层平板法宿主菌悬液（对数期菌液宿主菌悬液（对数期菌液宿主菌悬液（对数期菌液宿主菌悬液（对数期菌液0.9mL0.9mL）噬菌体菌悬液（合适稀释液噬菌体菌悬液（合适稀释液噬菌体菌悬液（合适稀释液噬菌体菌悬液（合适稀释液0.1mL0.1mL）上层培养基（上层培养
15、基（上层培养基（上层培养基（0.8%0.8%琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基5mL5mL）混匀混匀混匀混匀计数计数计数计数现在学习的是第28页，共37页单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较现在学习的是第29页，共37页双层平板法的优点：双层平板法的优点：加了底层培养基后，可使原来底面不平的加了底层培养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到了弥补；玻璃皿的缺陷得到了弥补；所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重叠缘
16、清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重叠现象；现象；因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬菌因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬菌斑较大，更有利于计数。斑较大，更有利于计数。现在学习的是第30页，共37页三、实验原理三、实验原理一个噬菌体一个噬菌体侵染宿主细胞侵染宿主细胞引起裂解引起裂解扩散重复侵染裂解扩散重复侵染裂解形成一个噬菌斑（琼形成一个噬菌斑（琼脂凝胶中）脂凝胶中）宿主细胞数远远大于噬菌体数？宿主细胞数远远大于噬菌体数？噬菌体效价（噬菌体效价（pfu/ml）=噬菌斑数噬菌斑数10稀释倍数稀释倍数现在学习的是第31页，共37页四、实验步骤四、实验步骤1 1、制备底层平板、制备底层平板 将已灭菌融化的
17、牛肉膏蛋白胨固体培养将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板基平板6 6个（倒薄一些），凝固。个（倒薄一些），凝固。2 2、加入大肠杆菌敏感菌、加入大肠杆菌敏感菌 在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液0.9mL0.9mL。现在学习的是第32页，共37页3、稀释噬菌体、稀释噬菌体 取取1mL含噬菌体液加入到含噬菌体液加入到 9mL牛肉膏牛肉膏蛋白胨培养液中，采用蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法，分别倍稀释法，分别制备噬菌体稀释液（制备噬菌体稀释液（10-7、10-8、10-9）。）。4、噬菌体与大
18、肠杆菌敏感菌混合、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合 将已加有大肠杆菌敏感菌将已加有大肠杆菌敏感菌6皿平板（皿平板（10-7、10-8、10-9各各2皿）中，分别加入皿）中，分别加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置噬菌体稀释液，混合后放置5分钟。分钟。现在学习的是第33页，共37页5、加入上层培养基、加入上层培养基 将将5mL溶化的半固体培养基中迅速倒溶化的半固体培养基中迅速倒入含噬菌体与大肠杆菌敏感菌平板中入含噬菌体与大肠杆菌敏感菌平板中（4550），并混合均匀。静止凝固。），并混合均匀。静止凝固。6、培养、培养 37培养培养5小时或室温培养小时或室温培养12小时。小时。现在学习的是第34页，共3
19、7页7、观察、计数、观察、计数 观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑形成单位（的噬菌斑形成单位（pfu）记录于表格内。）记录于表格内。8、计算噬菌体的效价、计算噬菌体的效价 按照六个计数原则选择，计算每毫升未按照六个计数原则选择，计算每毫升未稀释的原液的噬菌体效价。稀释的原液的噬菌体效价。噬菌体效价（噬菌体效价（pfu/ml）=噬菌斑数噬菌斑数10 稀释倍数稀释倍数现在学习的是第35页，共37页实验步骤框图（教师进行演示操作）实验步骤框图（教师进行演示操作）用牛肉膏蛋白胨固体培用牛肉膏蛋白胨固体培用牛肉膏蛋白胨固体培用牛肉膏蛋白胨固体培养基倒平板养基倒平板养
20、基倒平板养基倒平板6 6皿（薄一皿（薄一皿（薄一皿（薄一点）点）点）点）噬菌体稀释液（噬菌体稀释液（噬菌体稀释液（噬菌体稀释液（1010-7-7、1010-8-8、1010-9-9）0.1mL0.1mL，各，各，各，各2 2皿皿皿皿敏感菌菌悬液敏感菌菌悬液敏感菌菌悬液敏感菌菌悬液0.9mL0.9mL放入已有底层固体培养基的平放入已有底层固体培养基的平放入已有底层固体培养基的平放入已有底层固体培养基的平板中板中板中板中混匀放置混匀放置混匀放置混匀放置5 5分钟分钟分钟分钟将将将将5mL5mL溶化的半固体培养基中倒入上溶化的半固体培养基中倒入上溶化的半固体培养基中倒入上溶化的半固体培养基中倒入上述
21、平板中（述平板中（述平板中（述平板中（45504550）混匀（动作？）混匀（动作？）混匀（动作？）混匀（动作？）3737培养培养培养培养4 4小时或室小时或室小时或室小时或室温培养温培养温培养温培养1212小时小时小时小时观察结果计数观察结果计数观察结果计数观察结果计数现在学习的是第36页，共37页教科书介绍方法的操作步骤教科书介绍方法的操作步骤噬菌体稀释液噬菌体稀释液噬菌体稀释液噬菌体稀释液0.1ml0.1ml宿主培养液宿主培养液宿主培养液宿主培养液0.9ml0.9ml45484548溶化好牛肉膏蛋白溶化好牛肉膏蛋白溶化好牛肉膏蛋白溶化好牛肉膏蛋白胨半固体培养基胨半固体培养基胨半固体培养基胨半固体培养基4ml4ml混匀吸附混匀吸附混匀吸附混匀吸附5min5min搓动混匀后倒于搓动混匀后倒于搓动混匀后倒于搓动混匀后倒于有底层的平板中有底层的平板中有底层的平板中有底层的平板中铺平铺平铺平铺平37 37 培养培养培养培养5656小小小小时，观察计数时，观察计数时，观察计数时，观察计数 在无菌空试管中混匀上层在无菌空试管中混匀上层在无菌空试管中混匀上层在无菌空试管中混匀上层后（后（后（后（3 3种成分），再倒入底种成分），再倒入底种成分），再倒入底种成分），再倒入底层层层层 上铺平。上铺平。上铺平。上铺平。现在学习的是第37页，共37页