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1、关于微生物学新技术在环境领域中的应用第1页，此课件共44页哦 固固定定化化微微生生物物，用用制制备备固固定定化化酶酶的的方方法法将将微微生物固定在载体上，即成固定化微生物。生物固定在载体上，即成固定化微生物。固固定定化化细细胞胞比比游游离离细细胞胞稳稳定定性性高高，催催化化效效率率比比离离体体酶酶高高，且且比比固固定定化化酶酶操操作作简简便便，能能完完成多步酶反应。成多步酶反应。第2页，此课件共44页哦 二、二、酶的分离提纯酶的分离提纯 利利用用微微生生物物生生产产酶酶制制品品可可以以分分为为菌菌种种选选育育、发酵培养、分离提取发酵培养、分离提取和和酶制品保存酶制品保存四个步骤。四个步骤。1纯
2、化：纯化：盐盐析析法法，绝绝大大多多数数情情况况采采用用（NH4）2SO4。有机溶剂沉淀法，有机溶剂沉淀法，乙醇或丙酮乙醇或丙酮 层层析析法法，吸吸附附层层析析法法、离离子子交交换换层层析析法法、分分子筛过滤层析法、等电点沉淀法子筛过滤层析法、等电点沉淀法第3页，此课件共44页哦 三、固定化方法三、固定化方法 固定化方法有固定化方法有载体结合法、交联法、包埋法载体结合法、交联法、包埋法和逆胶束酶反应系统。和逆胶束酶反应系统。第4页，此课件共44页哦第5页，此课件共44页哦 1、载体结合法、载体结合法 将酶固定在非水溶性载体上。载体有葡聚糖、活性碳、胶原、将酶固定在非水溶性载体上。载体有葡聚糖、
3、活性碳、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤维素等。维素等。2、交联法、交联法 利用双功能试剂或多功能试剂使酶与酶发生交联而进行固利用双功能试剂或多功能试剂使酶与酶发生交联而进行固定。交联剂有：戊二醛、双重氮联苯胺和六甲撑二异氰定。交联剂有：戊二醛、双重氮联苯胺和六甲撑二异氰酸酯。酸酯。第6页，此课件共44页哦 3、包埋法、包埋法 将酶包埋在凝胶格子（格子型）中，或由半透性将酶包埋在凝胶格子（格子型）中，或由半透性的聚合物膜组成的胶囊内（微胶囊型）的方法。的聚合物膜组成的胶囊内（微胶囊型）的方法。格子型的包埋材料：聚丙烯酰胺
4、（格子型的包埋材料：聚丙烯酰胺（PACAM）凝胶、聚）凝胶、聚乙烯醇（乙烯醇（PVA）、琼脂、硅胶等。）、琼脂、硅胶等。微胶囊型的包埋材料：尼龙、乙基纤维素和硝酸纤微胶囊型的包埋材料：尼龙、乙基纤维素和硝酸纤维素维素 第7页，此课件共44页哦 4、逆胶束酶反应系统、逆胶束酶反应系统 表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自发形成聚集体，其亲水一端连接成逆胶发形成聚集体，其亲水一端连接成逆胶束的极性核，水分子插于核中，其疏水束的极性核，水分子插于核中，其疏水性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子溶于逆胶束中，组成逆胶束酶系统。溶于逆胶束中
5、，组成逆胶束酶系统。对微生物细胞的固定化最适合用对微生物细胞的固定化最适合用凝胶包凝胶包埋法埋法。第8页，此课件共44页哦四、四、固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用 英国采用固定化细胞反应设备处理含氰废水。英国采用固定化细胞反应设备处理含氰废水。中国应用固定化细胞技术降解含直链烷基苯磺酸钠中国应用固定化细胞技术降解含直链烷基苯磺酸钠（LAS）废水，去除率和酶活性保存率均在）废水，去除率和酶活性保存率均在90%以上。以上。德国将德国将9种降解对硫磷农药的酶共价固定在多孔玻种降解对硫磷农药的酶共价固定在多孔玻璃珠、硅胶珠上，制成酶柱处理对硫磷废水，获得
6、璃珠、硅胶珠上，制成酶柱处理对硫磷废水，获得95%以上的去除效果。以上的去除效果。第9页，此课件共44页哦 第二节第二节 微生物絮凝剂微生物絮凝剂 传传统统的的絮絮凝凝剂剂有有无无机机和和有有机机高高分分子子两两类类，第第三三类类为为微生物絮凝剂。微生物絮凝剂。加量为加量为200mg/L200mg/L 一、微生物絮凝剂的特点一、微生物絮凝剂的特点 1 1、来源广泛，生产周期短且效率高。、来源广泛，生产周期短且效率高。2 2、具具很很高高的的絮絮凝凝效效果果，与与聚聚铁铁、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺等等絮絮凝剂比，絮凝速度大，沉淀易过滤。凝剂比，絮凝速度大，沉淀易过滤。3 3、对人体和动物无危害。、对
7、人体和动物无危害。4 4、具可生化性，可防止絮凝后对环境造成的二次污染。、具可生化性，可防止絮凝后对环境造成的二次污染。5 5、能广泛应用于各种污水的处理。、能广泛应用于各种污水的处理。第10页，此课件共44页哦 二、微生物絮凝剂的结构组成、化学本质二、微生物絮凝剂的结构组成、化学本质 1 1、微生物絮凝剂的结构组成、微生物絮凝剂的结构组成 具具有有絮絮凝凝性性的的微微生生物物涉涉及及各各类类微微生生物物，有有细细菌菌、放放线线菌菌、霉霉菌菌、酵酵母母菌菌，原原生生动动物物等（表等（表11-111-1）。）。微生物絮凝剂的组成和结构见表微生物絮凝剂的组成和结构见表11-211-2。第11页，此
8、课件共44页哦第12页，此课件共44页哦第13页，此课件共44页哦 2 2、微生物絮凝剂的化学本质、微生物絮凝剂的化学本质 微生物所产生的絮凝剂主要是微生物代微生物所产生的絮凝剂主要是微生物代 谢过程中所产生的谢过程中所产生的多聚糖类多聚糖类，有些是蛋，有些是蛋白质（或多肽），或者是含有蛋白质白质（或多肽），或者是含有蛋白质（或多肽）。（或多肽）。第14页，此课件共44页哦三、微生物絮凝剂的絮凝机理三、微生物絮凝剂的絮凝机理 “桥桥联联作作用用”机机理理：絮絮凝凝剂剂大大分分子子借借助助离离子子键键、氢氢键键和和范范德德华华力力，同同时时吸吸附附多多个个胶胶体体颗颗粒粒，在在颗颗粒粒之之间间产
9、产生生“架架桥桥”，从从而而形形成成一一种种网网状状的的三三维维结构而沉淀下来。结构而沉淀下来。絮絮凝凝剂剂的的分分子子结结构构、形形状状、相相对对分分子子质质量量和和所所带带基基团会影响其絮凝效果。团会影响其絮凝效果。第15页，此课件共44页哦 四、微生物絮凝剂的合成和应用四、微生物絮凝剂的合成和应用 1 1、微生物絮凝剂的合成、微生物絮凝剂的合成 一一般般认认为为，微微生生物物多多在在其其生生长长的的中中后后期期释释放放絮絮凝凝剂剂形形成成絮絮体体，但但到到了了静静止止期期后后期期，细细胞胞不不再再产产生生新新的的絮絮凝凝物物质质，甚甚至至会会由由于于出出现现解解絮絮凝凝酶酶而而导导致致絮
10、凝活性下降。絮凝活性下降。培培养养基基的的组组成成、初初始始pHpH、培培养养温温度度、通通气气状状况况等等会影响絮凝剂的合成。会影响絮凝剂的合成。提取方法：凝胶色谱，有机溶剂提取和碱提取。提取方法：凝胶色谱，有机溶剂提取和碱提取。第16页，此课件共44页哦2 2、微生物絮凝剂的应用、微生物絮凝剂的应用(1)(1)高浓度有机水废水的处理高浓度有机水废水的处理 NOC-1NOC-1生物絮凝剂加生物絮凝剂加Ca2+Ca2+处理畜业生产产生的废水；处理畜业生产产生的废水；C-62C-62菌株产生的絮凝剂处理？革废水。菌株产生的絮凝剂处理？革废水。（2 2）染料废水的脱色）染料废水的脱色 用于造纸黑液
11、、糖蜜废水、墨水废水的脱色。用于造纸黑液、糖蜜废水、墨水废水的脱色。第17页，此课件共44页哦(3)(3)乳化液油水分离乳化液油水分离 用广泛产碱菌（用广泛产碱菌（Alcaligenens latusAlcaligenens latus ）培养物易将）培养物易将棕榈酸从其乳化液中分离出来。棕榈酸从其乳化液中分离出来。（4 4）活性污泥的处理）活性污泥的处理 从从红平红球菌红平红球菌（Rhodococcus erythropolisRhodococcus erythropolis ）分）分离得到的絮凝剂可促进污泥的沉降。离得到的絮凝剂可促进污泥的沉降。第18页，此课件共44页哦 第三节第三节 分
12、子生物技术分子生物技术在环境领域中的应用在环境领域中的应用 一、核酸探针和一、核酸探针和PCRPCR技术技术 1 1、核酸探针、核酸探针 在在适适当当条条件件下下，单单链链DNADNA片片段段能能与与另另一一段段与与之之互互补补的的单单链链片片段段结结合合，这这个个过过程程称称为为核核酸酸杂杂交交。利利用用这这一一特特性性，将最初的将最初的DNADNA片段进行标记，即可做成片段进行标记，即可做成核酸探针。核酸探针。利利用用核核酸酸探探针针技技术术可可以以检检测测环环境境中中是是否否存存在在某某些些特特定定种种类的微生物，如致病菌和病毒。类的微生物，如致病菌和病毒。第19页，此课件共44页哦 2
13、、PCRPCR技术技术 PCR(Polymerase PCR(Polymerase chain chain reaction)reaction)称称为为DNADNA多多聚聚酶酶链链式式反反应应，是是对对特特异异性性DNADNA片片段段在在体体外外进进行行扩扩增的一种非常快速而简便的方法。增的一种非常快速而简便的方法。（1 1）PCRPCR的原理：的原理：第20页，此课件共44页哦第21页，此课件共44页哦 （2）PCRPCR技术的操作方法：技术的操作方法：加热变性加热变性 将待扩增的将待扩增的DNA置于置于9495的高温的高温中加热中加热5min，使双链，使双链DNA解链为单链解链为单链DNA
14、，分，分开的两条单链开的两条单链DNA作为扩增的模板。作为扩增的模板。退火退火 将加热变性的单链将加热变性的单链DNA溶液的温度缓慢下降溶液的温度缓慢下降至至55 后，在这过程中引物的后，在这过程中引物的DNA的碱基将与单的碱基将与单链模板链模板DNA一端碱基配对。一端碱基配对。第22页，此课件共44页哦 延伸延伸 退火之后，当温度上升至退火之后，当温度上升至7272时，在耐时，在耐热性热性Taq DNATaq DNA多聚酶、适当的多聚酶、适当的PHPH和一定的离子强和一定的离子强度下，寡核苷酸引物（引物度下，寡核苷酸引物（引物DNADNA）碱基延伸和模）碱基延伸和模板板DNADNA结合构成双
15、链结合构成双链DNADNA。经过经过25253030次循环，扩增倍数达次循环，扩增倍数达10106 6，可将，可将2kb 2kb 的的DNADNA由原来的由原来的1pg1pg扩增到扩增到0.5 0.5 1g1g。第23页，此课件共44页哦第24页，此课件共44页哦（3）PCR技术的应用技术的应用应用应用PCR技术研究特定环境中微生物区系技术研究特定环境中微生物区系的组成、结构，分析种群动态。的组成、结构，分析种群动态。应用应用PCR技术监测环境中特定的微生物。技术监测环境中特定的微生物。量化环境系统中微生物群体的各组成成员。量化环境系统中微生物群体的各组成成员。第25页，此课件共44页哦 二、
16、二、16S rDNA16S rDNA序列及其同源性的分析序列及其同源性的分析 通通过过对对16S 16S rRNArRNA基基因因的的DNADNA序序列列分分析析，可可以以分分析析细细菌菌的的种种类类信信息息，并并且且已已经经逐逐渐渐成成为为微微生生物物分分类类和和鉴鉴定定中中非非常常重重要要而而且且有有用用的的指指标标和和手段。手段。第26页，此课件共44页哦 16s rRNA16s rRNA基因技术在环境科学领域中的应用基因技术在环境科学领域中的应用 鉴定生物降解菌；鉴定生物降解菌；研研究究某某一一特特定定环环境境中中微微生生物物的的区区系系组组成成，进进而而了了解解其种群动态，研究微生物
17、的多样性。其种群动态，研究微生物的多样性。PCR-DGGEPCR-DGGE或或PCR-TGGEPCR-TGGE分析微生物的多样性分析微生物的多样性 第27页，此课件共44页哦变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳DGGE 1979年由年由Fisher和和Lerman最先提出的用于最先提出的用于检测检测DNA片片段中的点突变段中的点突变的一种电泳技术。的一种电泳技术。Muyzer 等人在等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研年首次将其应用于微生物群落结构研究究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel
18、 electrophoresis，TGGE）。）。第28页，此课件共44页哦原理n双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。nDGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。n一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain,MD)和解链行为(melting behavior)。n一个几百个碱基对的DNA 片段一
19、般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加各区域依次发生解链。第29页，此课件共44页哦n显示的是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第234 个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。nMD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个解链区域。第30页，此课件共44页哦n不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。n当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移
20、行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。n一旦DNA 片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA 片段最低的解链区域解链，部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，不同的DNA 片段会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。第31页，此课件共44页哦n然而，当变性剂浓度达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。n在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。n含有GC 夹子的DNA 片段解链温度很高，可以防止DN
21、A 片段在DGGE 胶中完全解链。n当加了GC 夹子后，DNA 片段中每个碱基处的序列差异都能被区分开。第32页，此课件共44页哦第33页，此课件共44页哦n当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerase chain reaction）扩增技术，用PCR 扩增的16S rDNA 产物来反映微生物群落结构组成。n通常根据16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5-端含有一段GC 夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE/TGGE 分析。n由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片断，所以
22、一般选择扩增16S rRNA基因的V3区或V6-V8区。第34页，此课件共44页哦16S rDNA16S rDNA的高可变区的高可变区E.coli 16S rRNA二级结构及各可变区二级结构及各可变区 n V3V3区区 约约170bp170bpn V6-V8 V6-V8区区 约约350bp350bpn 片段大小不同，携带的信片段大小不同，携带的信息量不同，选择不同的区域息量不同，选择不同的区域得到得到DGGEDGGE图谱不同，群落信图谱不同，群落信息也有差异息也有差异n 不同的片段大小对应的胶不同的片段大小对应的胶浓度也不同浓度也不同n根据需要选择最合适的根据需要选择最合适的n提取基因组后，扩
23、增提取基因组后，扩增16SrDNA高可变区高可变区片段片段第35页，此课件共44页哦确定合适的变性剂范围对DNA片段进行有效分离根据根据变性剂梯度方向与电泳方向变性剂梯度方向与电泳方向相同或不同相同或不同,DGGE分分为：为：垂直垂直DGGE 平行平行DGGE第36页，此课件共44页哦常规的常规的DGGEDGGE电泳技术对于长度超过电泳技术对于长度超过500bp500bp的的DNADNA片段的序列变化情况片段的序列变化情况,只能有只能有50%50%的检的检出率。出率。应用应用“GCGC夹板夹板”技术可使检出率提高到技术可使检出率提高到100%100%。当当等等长长的的双双链链DNADNA分分子
24、子在在含含梯梯度度变变性性剂剂(尿尿素素、甲甲酰酰胺胺)聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中进进行行电电泳泳时时,因因其其解解链链的的速速度度和和程程度度与与其其序序列列密切相关密切相关;部部分分解解链链的的DNADNA分分子子的的迁迁移移速度随解链程度增大而减小速度随解链程度增大而减小。GC-Clamp16SrDNA低低浓浓度度高高浓浓度度第37页，此课件共44页哦DGGE的参数：的参数：n 胶浓度胶浓度 取决于片段大小取决于片段大小 ，通常不宜超过，通常不宜超过500bp500bp 6%6%胶浓度：胶浓度：400 400 1000bp1000bp 8%8%胶浓度：胶浓度：200 200 400
25、bp400bp 10%10%胶浓度：胶浓度：100 100 300bp300bp n 变性剂范围变性剂范围 不同的样品不同不同的样品不同n 温度温度 一般都用一般都用6060摄氏度摄氏度n 电压电压n 时间时间第38页，此课件共44页哦第39页，此课件共44页哦环境样品分析的流程环境样品分析的流程第40页，此课件共44页哦DGGEDGGE在微生物分子生态学中的应用在微生物分子生态学中的应用n 对微生物对微生物群落结构群落结构进行对比、分析或者跟踪监测。进行对比、分析或者跟踪监测。n 通过扩增通过扩增功能基因功能基因来研究功能基因及功能菌群的来研究功能基因及功能菌群的 多样性。多样性。n 跟踪及
26、检测细菌的富集和分离跟踪及检测细菌的富集和分离，评价不同的培养，评价不同的培养 条件对分离菌种的影响。条件对分离菌种的影响。第41页，此课件共44页哦举例：举例：油藏古细菌油藏古细菌 V3V3区区 DGGE DGGE 图谱图谱胶浓度：胶浓度：10%10%变性剂范围：变性剂范围：40%-60%40%-60%电压：电压：200V200V运行时间：运行时间：4.5h4.5h第42页，此课件共44页哦优点优点：重现性强，可靠性高，方便快捷而且使用成本低。重现性强，可靠性高，方便快捷而且使用成本低。能同时分析多个样品，使其非常适于分析环境样品能同时分析多个样品，使其非常适于分析环境样品中微生物群落结构的变化。中微生物群落结构的变化。缺点缺点：n 分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），只能检测出优势菌。只能检测出优势菌。n 一般只能分析一般只能分析500bp以下以下的片段。的片段。n PCR过程产生的过程产生的异源双链和单链异源双链和单链DNA会对分析造成偏差。会对分析造成偏差。第43页，此课件共44页哦感感谢谢大大家家观观看看第44页，此课件共44页哦