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1、关于基因克隆的酶学基础第一页，讲稿共一百零七页哦第四章第四章 分子克隆的酶学基础分子克隆的酶学基础基因的重组与分离，涉及到一系列相互关基因的重组与分离，涉及到一系列相互关联的酶促反应。特别是联的酶促反应。特别是核酸限制性内切酶核酸限制性内切酶 和和DNADNA连接酶连接酶的发现和应用，使的发现和应用，使DNADNA分子的体外分子的体外连接与切割成为可能。连接与切割成为可能。核酸限制性内切酶和核酸限制性内切酶和DNADNA连接酶是重组连接酶是重组DNADNA技术赖以创立的重要酶学基础。技术赖以创立的重要酶学基础。第二页，讲稿共一百零七页哦重组重组DNADNA实验中常使用的酶实验中常使用的酶III
2、I型核酸内切限制酶型核酸内切限制酶DNADNA连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌DNA DNA 聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶多核苷酸激酶多核苷酸激酶末端转移酶末端转移酶核酸外切酶核酸外切酶IIIIII核酸外切酶核酸外切酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶S1S1核酸酶核酸酶oBal31Bal31核酸酶核酸酶oTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶第三页，讲稿共一百零七页哦DNADNA的一级结构的一级结构 DNADNA的二维结构的二维结构第四页，讲稿共一百零七页哦核酸酶核酸酶n通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。n专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（
3、RNase)；特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）。n从核酸分子末端开始,一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链,称为核酸外切酶（exonuclease）；从核酸内部切割磷酸二酯键使之断裂为小片段的为核酸内切酶（endonuclease）。第五页，讲稿共一百零七页哦第六页，讲稿共一百零七页哦第一节第一节、核酸内切限制酶与、核酸内切限制酶与DNADNA分子的体外切割分子的体外切割1.寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象(R/M)修饰的甲基转移酶修饰的甲基转移酶核酸内切限制酶核酸内切限制酶EcoBEcoK（Restriction and modification
4、Restriction and modification）第七页，讲稿共一百零七页哦E.coli 菌株噬菌体感染率 KBCE.coli K110-410-4E.coli B10-4110-4E.coli C111说明说明K K和和B B菌株中存在一种限制系统可排除外来的菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNADNA第八页，讲稿共一百零七页哦GAATTCCTTAAGEcoRIMEcoRI限制作用限制作用修饰作用修饰作用G35AATTCCTTAA53GGAATTCCTTAAGMeMeMeEcoRI核酸内切限制酶核酸内切限制酶EcoRI及其修饰的甲基化酶及其修饰的甲基化酶MEcoR的限制与修饰作用的
5、限制与修饰作用第九页，讲稿共一百零七页哦第十页，讲稿共一百零七页哦第十一页，讲稿共一百零七页哦寄主的限制与修饰的作用o保护自身的DNA不受限制;o破坏外源DNA,使之迅速降解第十二页，讲稿共一百零七页哦2.限制酶的发现限制酶的发现u60年代提出了限制性内切酶和限制酶的概念u1968年，首次从E.coli K中分离到限制酶有特定的识别位点但没有特定的切割位点，切割位点离识别位有特定的识别位点但没有特定的切割位点，切割位点离识别位点达点达 1000bp 以上。以上。u1970年，美国约翰霍布金斯大学的H.Smith找到Hind限制性内切酶。u2006年2月为止共发现3773种限制酶,810种甲基化
6、酶第十三页，讲稿共一百零七页哦核酸内切限制酶核酸内切限制酶(restrictionendonuclease)o是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶第十四页，讲稿共一百零七页哦3.3.核酸内切限制酶的类型核酸内切限制酶的类型特性特性I I型酶型酶IIII型酶型酶IIIIII型酶型酶蛋白质结构蛋白质结构3 3种亚基种亚基单一成分单一成分2 2种不同亚基种不同亚基辅助因子辅助因子ATP,MgATP,Mg2+2+,S-Met,S-MetMgMg2+2+ATP,MgATP,Mg2+2+,S-Met,S-Met序列特异切割序列特异切割不是不是
7、是是是是切割位点切割位点距识别序列距识别序列1kb处处随机切割随机切割识别序列内识别序列内或附近或附近距识别距离下游距识别距离下游24-26bp处处克隆中的作用克隆中的作用无用无用十分有用十分有用用处不大用处不大第十五页，讲稿共一百零七页哦4.II4.II型核酸内切限制酶的基本特性型核酸内切限制酶的基本特性在特异在特异识别序列识别序列切割切割DNADNA分子；分子；两个单链切割部位在两个单链切割部位在DNADNA分子上的分布分子上的分布,通常不直接相对；通常不直接相对；断片往往具有互补的单链延伸末端。断片往往具有互补的单链延伸末端。(1)(1)基本特性基本特性第十六页，讲稿共一百零七页哦识别序
8、列识别序列4-84-8个核苷酸序列个核苷酸序列大部分呈旋转对称大部分呈旋转对称、反向重复结构反向重复结构回文结构回文结构C-C-G-C-G-GG-G-C-G-C-C对称轴对称轴切割位点切割位点切割位点切割位点第十七页，讲稿共一百零七页哦ABCCBAABBAABCCBAABAB 部分识别序列不对称部分识别序列不对称:AccAccBSBS:CCG:CCG CTCCTCGGCGGCGAGGAGBssBssS S:C:C TCGTGTCGTGGAGCAGAGCA C C 有一些限制酶可识别多种序列有一些限制酶可识别多种序列AccIGTMKAC(M:AAccIGTMKAC(M:A或或C)C)HindII
9、GTYRAC(Y:CHindIIGTYRAC(Y:C或或R:AR:A或或G)G)第十八页，讲稿共一百零七页哦识别位点在DNA分子中的频率假定核苷酸随机排列的情况下进行实践中:如DNA长49kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点，实际上要少一些，如BglII只有6个，BamHI只有5个，而SalI只有2个。44=25646=4096第十九页，讲稿共一百零七页哦基因组中碱基对的排列是非均匀的，尽管有的酶切序列中GC含量相同，但在基因组中出现的机率还是不一样。在 E.coli 中Aso（GGCGCGCC）20kb Not（GCGGCCGC）200kb（常利用它出现的机会少来构建图谱）EcoR和Hi
10、nd5kb Spe（ACTAGT）60kb第二十页，讲稿共一百零七页哦细菌基因组（细菌基因组（Bacteria genome)大多数富含A+T的细菌中，CCC和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的几率就非常少。酵母基因组（酵母基因组（Yeast genome)G+C含量38%，在重复序列之外，富含G+C的识别序列就特别少。哺乳动物中含哺乳动物中含CG序列的酶切位点稀少，大多序列的酶切位点稀少，大多CG序列序列是甲基化的是甲基化的第二十一页，讲稿共一百零七页哦(2)、限制性内切酶产生的末端限制性内切酶产生的末端u粘性末端粘性末端Cohesive ends(Mached en
11、ds)5粘性末端粘性末端,3突出末端o平末端平末端 Blunt endso非对称突出端非对称突出端第二十二页，讲稿共一百零七页哦粘性末端粘性末端Cohesive ends(Mached ends)DNA分子在限制性内切酶的作用下形成具有互补碱基的单链延伸末端分子在限制性内切酶的作用下形成具有互补碱基的单链延伸末端结构结构,能够通过互补碱基的配对而重新连接起来能够通过互补碱基的配对而重新连接起来.EcoRIEcoRI切割位点切割位点5-GAATTC-33-CTTAAG-5a.a.在对称轴的在对称轴的5 5 一侧切割底物，一侧切割底物，DNADNA双链交错断开，形成双链交错断开，形成5 5 突出末
12、端突出末端第二十三页，讲稿共一百零七页哦EcoRIEcoRI等产生的等产生的等产生的等产生的5 5 粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5退火退火退火退火 4-7 4-7 5G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C5OHOHPPPPOHOH第二十四页，讲稿共一百零七页哦b.3一侧切割形成3突出末端5-CTG
13、CAG-33-GACGTC-5PstIPstI切割位点切割位点第二十五页，讲稿共一百零七页哦PstI等产生的等产生的3粘性末端粘性末端5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5PstI 37PstI 37 5G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G33C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C55G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G33C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C5OHOHPPOHOHPP第二十六页，讲稿共一百零七页哦o5突出端易于通过DNA激酶和32pATP进行同位素标记o3突出端是末
14、端转移酶的理想作用底物,在酶的作用下,容易使DNA片段带上多核苷酸尾第二十七页，讲稿共一百零七页哦在对称轴上同时切割DNA的两条链5-GCGGCCGC-33-CGCCGGCG-5u平末端平末端 Blunt ends第二十八页，讲稿共一百零七页哦PvuII等产生的平头末端等产生的平头末端5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C55G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C5PvuII 37 PvuII 37 第二十九页，讲稿共一百零七页哦第三十页，讲稿共一百零七页哦 同
15、裂酶（同裂酶（Isoschizomer):识别位点的序列相同的限制性识别位点的序列相同的限制性 内切酶内切酶 完全同裂酶完全同裂酶:识别位点和切点完全相同：如识别位点和切点完全相同：如MobI和和Sau3AI 识别序列切割位点识别序列切割位点为为 GATC 不完全同裂酶不完全同裂酶:识别位点相同，但切点不同如识别位点相同，但切点不同如AatII(GACGT C)ZraI(GAC GTC)同尾酶同尾酶(Isocaudiners):识别的序列不同，但能切出相同的粘性识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如末端。如 BamH I、Bgl、Bcl I、Xho 等等EcoEcoRR GG AATTC
16、AATTC MfeMfe CCAATTC AATTC Apo Apo R R AATTYAATTYR:AorG;Y:CorTR:AorG;Y:CorT第三十一页，讲稿共一百零七页哦具粘性末端的具粘性末端的DNADNA片段结合方式片段结合方式 限制性片段末端连接作用限制性片段末端连接作用限制性片段末端连接作用限制性片段末端连接作用a.a.具有具有EcoRIEcoRI粘性末端的粘性末端的22条条DNADNA片断之片断之间的连接间的连接b.b.具有粘性末端具有粘性末端的同一条片断的的同一条片断的自我连接自我连接第三十二页，讲稿共一百零七页哦属名头一个字母属名头一个字母+种名头两个字母种名头两个字母菌
17、株名菌株名不同修饰体系不同修饰体系系统名系统名 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d株株 HindIII6.6.核酸内切限制酶的命名法核酸内切限制酶的命名法核酸内切限制酶的命名法核酸内切限制酶的命名法第三十三页，讲稿共一百零七页哦DNA片段（线性载体）检测末端长度对切割的影响时，同样发现识别序列的末端长度对酶切效率有明显影响，不同的酶对末端长度的要求是不同。因此o设计PCR引物时，引入酶切位点时，在位点之外加上能够满足要求的碱基数目。o双酶切多克隆位点时选择合适的酶切秩序第三十四页，讲稿共一百零七页哦7、位点偏爱(sitepreference)某些限制酶
18、对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱(1)现象：EcoR 酶切割酶切割 噬菌体中的噬菌体中的 5 个位点时并不是随机的，靠近右端的位点个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快比分子中间的位点切割快 10 倍；倍；EcoR 对腺病毒对腺病毒 2（adenvirus-2）DNA 不同位置切点的切割速率也不同。不同位置切点的切割速率也不同。EcoR 和和 Hind 在在 噬菌体噬菌体 DNA 中的切割速率分别有中的切割速率分别有 10 倍和倍和 14 倍的倍的差异差异 噬菌体噬菌体 DNA 有有 4 个个 Sac
19、 位点，三个在中央，一个在右臂，对中央三个位位点，三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快点的酶切速度快 50 倍倍 第三十五页，讲稿共一百零七页哦8.II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：o使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解o低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切o一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先
20、切，然后更换缓冲液，另一种酶再切酶切酶切温度要求不同时温度要求不同时,先低温切先低温切,后高温切后高温切第三十六页，讲稿共一百零七页哦注意事项o取少量酶o最后加酶o减少反应体积o反应时间的延长o分装（对于多个反应）第三十七页，讲稿共一百零七页哦第三十八页，讲稿共一百零七页哦9、影响酶活性的因素、影响酶活性的因素(1)DNA(1)DNA的纯度的纯度:蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA,SDS、NaCl等等提高对低纯度提高对低纯度DNA酶切效率的方法酶切效率的方法:o增加核酸内切酶的用量增加核酸内切酶的用量,1ugDNA/10u;o扩大反应体积扩大反应体积,稀释抑制因素稀
21、释抑制因素o延长酶切保温时间延长酶切保温时间第三十九页，讲稿共一百零七页哦(2)(2)甲基化程度甲基化程度:大肠杆菌中的大肠杆菌中的dam甲基化酶在甲基化酶在5GATC3序列中的腺序列中的腺嘌呤嘌呤N6位位引入甲基引入甲基(3)缓冲液缓冲液 pH,MgpH,Mg2+2+,DTT,BSA,10(X),DTT,BSA,10(X)(4)酶切消化反应的温度酶切消化反应的温度大多数为37,少数25-30 smalI(25);ApaI(30)(5)DNA的分子构型的分子构型与切割与切割 DNA 相比，相比，EcoR、Pst、Sal 需要至少需要至少 2.5-10 倍的倍的酶来切割酶来切割 pBR322 的
22、超螺旋的超螺旋 DNA。第四十页，讲稿共一百零七页哦(6)、酶的星星活性（、酶的星星活性（star activity)在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性o星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点Apo、Ase、BamH、BssH11、EcoR、EcoRV、Hind、Hinf、Kpn、Pst、Pvu、Sal、Sca、Taq和Xmn等酶皆可表现出星星活性。第四十一页，讲稿共一百零七页哦o高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH等会使一核酸内切酶的识别等会使一核酸
23、内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象现象o甘油浓度高（5%）o酶过量（100U/l）o离子强度低（8.0）o有机溶剂如PMSD（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、sulphalane等等.o用其它二价阳离子如Mn+、Cu+、Co+或Zn+代替了Mg+。第四十二页，讲稿共一百零七页哦10、酶切位点的引入（1）产生的5突出端补平后，再连接可产生新的酶切位点（2）同尾末端的连接不同的同尾酶切割不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端再相
24、互连接时，可产生新的酶切位产生的末端再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点消失点，同时原来的酶切位点消失 BamH（GGATCC）+Bcl（TGATCA）Alw（GGATC 4/5）第四十三页，讲稿共一百零七页哦（3）平末端的限制酶切割的DNA在连接后也可产生新的酶切位点Pvu（CAGCTG）+EcoRV（GATATC）Mob（GATC）第四十四页，讲稿共一百零七页哦限制性核酸内切酶反应的终止o65或80 温浴20分钟o加入EDTA（10mM)终止第四十五页，讲稿共一百零七页哦第二节第二节、DNA连接酶催化双链DNA片段靠在一起的3羟基与5磷酸之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来
25、的酶。两种两种DNA连接酶连接酶大肠杆菌连接酶大肠杆菌连接酶:是一种相对分子量为74000的蛋白质,催化时需NAD+做能量,只能连接粘性末端T4噬菌体连接酶噬菌体连接酶:相对分子质量60000,需ATP做为能量来源,可连接粘性末端和平末端连接的条件连接的条件:oDNA3端有游离的-OH,5端有P;o需要能量;o必须是两条双链DNA.o只封闭双螺旋DNA骨架上的缺口第四十六页，讲稿共一百零七页哦1T4DNA连接酶（T4DNAligase）T4噬菌体感染大肠杆菌产生底物：粘端、切口、平端的RNA（但效率低）或DNA影响因素：低浓度的聚乙二醇PEG（一般为10%）和单价阳离子（150-200mMNa
26、Cl）可以提高平端连接速率。第四十七页，讲稿共一百零七页哦2E.coli DNA连接酶（E.coliDNAligase）o与T4DNAligase活性相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）参与。o平端连接效率低，常用于置换合成法合成cDNAo不能将RNA连接到DNA，不连接RNA。第四十八页，讲稿共一百零七页哦3TaqDNA连接酶在两个寡核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接dsDNA中的缺口o作用在4565o需NAD+。o可用于检测等位基因的变化o在PCR扩增中引入寡核苷酸。o它不可替代T4DNAligase。第四十九页，讲稿共一百零七页哦二、连接反应的机
27、理nATP（NAD+)提供激活的AMPnATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。nAMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连nAMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5端P上,形成“DNA-腺苷酸”复合物n3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP第五十页，讲稿共一百零七页哦第五十一页，讲稿共一百零七页哦DNA连接酶第五十二页，讲稿共一百零七页哦第五十三页，讲稿共一百零七页哦四、影响连接反应的因素四、影响连接反应的因素1 反应温度反应温度16反应，4小时；4反应，反应过夜2 连接酶的浓度连接酶的浓度oWeiss单位在37下20分钟催化1nmol32
28、p从焦磷酸根置换到，32PATP所需的酶量，定义为1个Weiss单位。oNEB单位在20l反应体系中于16，使 Hind切过的DNA（300g/ml，0.12M5末端）在30分钟内连接50%所需的酶量为1个NEB单位。1NEB=0.015Weiss1Weiss=67NEBo平末端连接反应的酶量大约是1-2个单位,粘性末端仅为0.1个单位,3 ATP浓度浓度4 DNA片断末端片断末端 自身环化的单体，线性二聚体或多聚体，分子间连接，重组质粒自身环化的单体，线性二聚体或多聚体，分子间连接，重组质粒第五十四页，讲稿共一百零七页哦nn插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度
29、比例插入片段与载体的浓度比例3-103-10：11；nn碱性磷酸酶处理载体碱性磷酸酶处理载体碱性磷酸酶处理载体碱性磷酸酶处理载体目的片段的量的计算目的片段的量的计算目的片段的量的计算目的片段的量的计算提高连接效率的方法提高连接效率的方法提高连接效率的方法提高连接效率的方法第五十五页，讲稿共一百零七页哦第三节第三节、DNA 聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）和）和反转录酶反转录酶作用：在有模板，引物存在下，把脱氧核糖单核苷酸（dNTP）连续加到双链DNA分子引物链的3-OH端，催化核苷酸的聚合作用。一一 基因工程中常用的基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶o大肠杆菌DNA聚合酶，oKl
30、enowfragmentoT7DNA聚合酶oT4DNA聚合酶o修饰过的T7DNA聚合酶o反转录酶第五十六页，讲稿共一百零七页哦二二、DNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用DNADNA聚合酶聚合酶 I I 与核酸杂交探针的置备；与核酸杂交探针的置备；大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶的聚合酶的KlenowKlenow片段与片段与DNADNA末端末端标记；标记；T4 DNA T4 DNA 聚合酶和取代合成法标记聚合酶和取代合成法标记DNADNA片段；片段；依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶与互补聚合酶与互补DNA DNA 的合成；的合成；第五十七页，讲稿共一百零七页哦（一）、E.coli
31、DNA聚合酶1.基本活性 5-3 DNA 聚合酶活性。聚合酶活性。底物：为单链DNA，引物（带3-OH基）或5突出的双链DNA。5-3 外切核酸酶活性外切核酸酶活性 底物：双链DNA或DNA:RNA杂交体活性：从5端降解双链DNA，也降解RNA:DNA中的RNA（RNaseH活性）第五十八页，讲稿共一百零七页哦 3-5 外切酶活性外切酶活性底物：带3-OH的双链DNA或单链DNA活性：3-OH端降解DNA，可被5-3聚合活性封闭，也可被带5磷酸的dNMP所抑制。在没有在没有 dNTP 的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的 dNTP 时，外时，
32、外切活性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得双链切活性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得双链 DNA 成为平末端。成为平末端。第五十九页，讲稿共一百零七页哦DNA聚合酶聚合酶 I 聚合活性聚合活性第六十页，讲稿共一百零七页哦DNADNA聚合酶聚合酶 I I 的的5 5-3-3核酸外切酶活性核酸外切酶活性第六十一页，讲稿共一百零七页哦2E.coliDNA聚合酶的用途o切口平移法（nicktranslation）标记DNA所有所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反应聚合酶中只有此酶有此反应5533MgMg2+,DNaseI2+,DNaseIdNTP,DNApolyIdNTP,DNApolyI切口平
33、移切口平移第六十二页，讲稿共一百零七页哦探针标记探针标记(a)(a)双链双链双链双链DNADNA分子分子分子分子(b)(b)由由由由DNaseIDNaseI产生的单链缺口产生的单链缺口产生的单链缺口产生的单链缺口,带有带有带有带有33OHOH末端末端末端末端(c)(c)大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I 的的的的55 3 3外外外外切酶活性从缺口切酶活性从缺口切酶活性从缺口切酶活性从缺口55-P-P一侧移去一到一侧移去一到一侧移去一到一侧移去一到数个核苷酸数个核苷酸数个核苷酸数个核苷酸(d)(d)大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚
34、合酶聚合酶II将将将将3232PP标标标标记的核苷酸掺入取代原先被删记的核苷酸掺入取代原先被删记的核苷酸掺入取代原先被删记的核苷酸掺入取代原先被删除的核苷酸除的核苷酸除的核苷酸除的核苷酸(e)(e)重复进行重复进行重复进行重复进行和和和和(d),(d),使缺口沿着使缺口沿着使缺口沿着使缺口沿着55 33方向移动方向移动方向移动方向移动.第六十三页，讲稿共一百零七页哦（二）、（二）、Klenow DNA 聚合酶聚合酶 E.coliDNApolymeraselargefragment（Klenowfragment）o大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I I经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除
35、去5-3外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3-5外切活性不受影响，分子量为76kDa。第六十四页，讲稿共一百零七页哦活性：与 E.coliDNA聚合酶的活性是一致的。但没有5-3外切活性作用：补平3凹端DNA。要加足够的dNTP抹平DNA3凸端。必须加足量dNTP在cDNA克隆中合成第二链。随机引物标记。应用于Sanger双脱氧链末端终止法的DNA测序（已经被T7DNA聚合酶取代）第六十五页，讲稿共一百零七页哦DNADNA分子末端标记分子末端标记第六十六页，讲稿共一百零七页哦（三）、（三）、T4 噬菌体噬菌体 DNA 聚合酶（聚合酶（T4 phage DNA polymerase）来源
36、于T4噬菌体感染的E.coli，分子量为114kDa活性：o与与 Klenow 酶相似，但酶相似，但 3-5 外切活性强外切活性强 200 倍倍o 53聚合活性聚合活性第六十七页，讲稿共一百零七页哦用途用于补平或标记用于补平或标记3凹端凹端取代合成（需高浓度取代合成（需高浓度dNTP一种一种)-末端标记末端标记标记标记DNA片段片段 利用外切活性产生利用外切活性产生3凹端再补平凹端再补平第六十八页，讲稿共一百零七页哦（四）、（四）、T7 噬菌体噬菌体 DNA 聚合酶（聚合酶（T7 phage DNA polymerase）o来源于T7噬菌体感染的 E.coli，为两种紧密结合的蛋白质复合体，一
37、种是噬菌体基因5蛋白，另一个是宿主蛋白的硫氧还蛋白。o聚合能力最强的聚合能力最强的DNADNA聚合酶；聚合酶；o聚合过程中不形成二级结构；聚合过程中不形成二级结构；o可进行单纯的延伸或取代合成的途径；可进行单纯的延伸或取代合成的途径；o在从在从5 5到到3 3方向的聚合过程中也有一定程度的方向的聚合过程中也有一定程度的3 35 5核酸外核酸外切酶活性；切酶活性；o将双链将双链DNA5DNA5或或3 3突出末端转变成平末端的结构。突出末端转变成平末端的结构。第六十九页，讲稿共一百零七页哦活性：与T4噬菌体DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶类似，但3-5外切活性为Klenow的1000倍。用途
38、：T7噬菌体DNA聚合酶可替代T4的功能并可用于长模板的引物延伸。第七十页，讲稿共一百零七页哦修饰的T7DNA聚合酶o切除了99%以上的3-5外切活性（V1）o完全除去V2用于测序反应第七十一页，讲稿共一百零七页哦（五）、耐热（五）、耐热 DNA 聚合酶聚合酶在高温下有DNA聚合活性，来自噬高温的细菌，主要用于PCR反应，如Taq DNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶和 TthDNA聚合酶等第七十二页，讲稿共一百零七页哦（六）、反转录酶（六）、反转录酶（Reverse transcriptase）依赖于依赖于 RNA 的的 DNA 聚合酶，聚合酶，也叫做也
39、叫做RNARNA指指导的导的DNA DNA 聚合酶或反转录酶。聚合酶或反转录酶。活性：有5-3合成DNA活性来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV（鼠白血病病毒，又称M-MuLV）第七十三页，讲稿共一百零七页哦AMV反转录酶o包含两条多肽链；o具5-3DNA聚合活性很强的RNA酶H活性（降解与DNA杂交的RNA）在cDNA合成开始时，引物和mRNA模板杂交体可成为RNaseH的底物，此时，模板的降解和cDNA的合成相竞争；反应终止时，RNaseH可在正在增长的DNA链近3端切割模板，趋向于抑制cDNA的产量并限制其长度。在42（鸡的正常体温）能有效发挥作用，能有效地拷贝较复杂的mRNA，
40、但提纯过程中易被内切酶污染。第七十四页，讲稿共一百零七页哦oM-MuLV反转录酶是单链多肽，84kDa，其RNaseH活性弱，有利于合成较长cDNA。其基因工程产品纯度高。第七十五页，讲稿共一百零七页哦2用途ocDNA（complememtaryDNA)克隆o5突出DNA的补平和标记o测序反应第七十六页，讲稿共一百零七页哦3活性o53DNA聚合活性RNAorDNA为模板及带3-OH的RNA或DNA引物oRNaseH活性第七十七页，讲稿共一百零七页哦反转录酶的反转录酶的5-3方向的方向的DNA聚合酶聚合酶 I 活性活性第七十八页，讲稿共一百零七页哦反转录酶的反转录酶的5 5-3-3方向和方向和3
41、 3-5-5方向的核糖核酸外方向的核糖核酸外切酶活性（切酶活性（Rnase H)Rnase H)双向外切双向外切DNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNA链链第七十九页，讲稿共一百零七页哦第四节、DNA及RNA的修饰酶1.1.末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾2.2.T4T4多核苷酸激酶与多核苷酸激酶与DNADNA分子分子5 5末端的标记末端的标记3.3.碱性磷酸酶与碱性磷酸酶与DNADNA脱磷酸作用脱磷酸作用第八十页，讲稿共一百零七页哦一、末端转移酶（一、末端转移酶（terminal transferase）o来源于小牛胸腺，o是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。o
42、在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3羟基端。T或C首选CO2+；A或G首选Mg2+第八十一页，讲稿共一百零七页哦TdT的基本特性的基本特性5p3HOOH3p5TdToCo2+dATP5p3HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3p5第八十二页，讲稿共一百零七页哦末端转移酶末端转移酶terminaltransferaseterminaltransferase（TdT)TdT)第八十三页，讲稿共一百零七页哦1底物oDNA可短至3个核苷酸，对3羟基突出末端的底物作用效率最高o低离子强度时，5突出端或平端的DNA也可作为底物2用途o在cDNA或载体3末端加同聚尾用于
43、克隆o末端标记第八十四页，讲稿共一百零七页哦同聚物加尾法再生同聚物加尾法再生Hind Hind IIIIII识别位点识别位点第八十五页，讲稿共一百零七页哦二、二、T4 多核苷酸激酶多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase）是一种磷酸化酶，可将是一种磷酸化酶，可将 ATP 的的 -磷酸基转移至磷酸基转移至 DNA 或或 RNA 的的 5 末端。末端。分子克隆应用中呈现两种反应分子克隆应用中呈现两种反应：正反应正反应：将：将 ATP 的的 -磷酸基团转移到无磷酸的磷酸基团转移到无磷酸的 DNA 5 端。端。用于对缺乏用于对缺乏 5-磷酸的磷酸的 DNA 进行磷酸化进行磷酸化,
44、催化催化5突出末端磷酸化速度比平末端或突出末端磷酸化速度比平末端或5末端磷酸化速度快得多。末端磷酸化速度快得多。交换反应交换反应：在过量：在过量 ADP和和-32PATP 存在的情况下，该激酶可将磷酸化的存在的情况下，该激酶可将磷酸化的 5 端磷端磷酸转移给酸转移给 ADP，然后，然后 DNA 从从 ATP 中中 -磷酸而重新磷酸化。磷酸而重新磷酸化。使用的使用的 ATP 均为放射性同位素标记均为放射性同位素标记 -32pATP，那么反应的产物都，那么反应的产物都变成末端获得放射性标记的变成末端获得放射性标记的 DNA。第八十六页，讲稿共一百零七页哦第八十七页，讲稿共一百零七页哦T4T4多核苷
45、酸激酶的交换活性多核苷酸激酶的交换活性第八十八页，讲稿共一百零七页哦三、碱性磷酸酶（三、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）主要来源于:o牛小肠碱性磷酸酶（Calfintestinalalkalinephosphatase），简称CIP或CIAPo细菌的碱性磷酸酶（Bacterialalkalinephosphatase,BAP）第八十九页，讲稿共一百零七页哦作用催化除去DNA或RNA5磷酸的反应用于防止用于防止 DNA 片段自身连接，或标记（片段自身连接，或标记（5 端）前除端）前除 DNA 或或 RNA 5 磷酸磷酸 第九十页，讲稿共一百零七页哦第九十一页，讲稿共一百零七
46、页哦第九十二页，讲稿共一百零七页哦第四节第四节 其它酶其它酶一、依赖于一、依赖于 DNA 的的 RNA 聚合酶聚合酶（DNA dependent RNA polymerase）SP6 噬菌体噬菌体 RNA 聚合酶聚合酶（来源于感染鼠伤寒沙门氏菌（来源于感染鼠伤寒沙门氏菌 LT2 菌株菌株）T4 或或 T7 噬菌体噬菌体 RNA 聚合酶聚合酶（来源于噬菌体感染的大肠杆菌）。（来源于噬菌体感染的大肠杆菌）。第九十三页，讲稿共一百零七页哦1活性这些RNA聚合酶实际上为转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。它与DNA聚合酶不同，无需引物，但需识别
47、特异性位点。2用途体外合成RNA分子。用于表达外源基因。第九十四页，讲稿共一百零七页哦二、核酸外切酶二、核酸外切酶（nuclease）o单链外切核酸酶大肠杆菌外切核酸酶I和VII：两头降解，产生2-25bp寡核苷酸片段o双链外切核酸酶大肠杆菌外切核酸酶III:双链DNA从3OH末端开始降解，释放5单核苷酸o从dsDNA3-OH逐一去除单核苷酸的反应，底物为dsDNA或线状和带切口或缺口的环状DNA，反应结果是在dsDNA上产生长长的单链区。o该酶还有对无嘌呤DNA特异性内切核酸酶活性、RNaseH活性和3-磷酸酶活性（去磷酸）。o不降解核酸内的磷酸二酯键，也不降解单链DNA及带3突出的dsDN
48、A。持续作用能力不强，产物为切割程度不相上下的群体，有利于分离长短不等的DNA。第九十五页，讲稿共一百零七页哦第九十六页，讲稿共一百零七页哦三单链核酸内切酶1BAL31 核酸酶核酸酶（BAL31nuclease）来源于交替单胞菌（Alteromonas espejiana）BAL31主要活性为o单链特异的核酸内切酶活性,从3羟基末端迅速降解DNA 依赖依赖 Ca+,而且EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸）可抑制其活性。双链的核酸外切酶活性：可从线性DNA两条链的两端迅速去除单核苷酸第九十七页，讲稿共一百零七页哦用途o从两头缩短DNA，用于构建嵌套缺失体o制作DNA限制酶切图;o确定D
49、NA二级结构o从单链RNA上去除核苷酸。第九十八页，讲稿共一百零七页哦2Sl核酸酶（S1nuclease）来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）o降解单链DNA或RNA，产生带5磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链,是一种高度单链特异的核酸内切酶o对dsDNA、dsRNA和DNA:RNA杂交体不敏感。活性需pH4.0-4.3,Zn2+酶浓度大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链酶浓度大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。作用：分析DNA:RNA杂交体的结构；去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端；打开双链cDNA合成中产生的发荚环。第九十九页，讲稿共一
50、百零七页哦第一百页，讲稿共一百零七页哦3核糖核酸酶A（RibonucleaseA或RNaseA）来源于牛胰，为内切核酸酶可特异攻击RNA上嘧啶残基的3端可用于o除去DNA:RNA中未杂交的RNA区，o确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。o广泛用来去除DNA样品中的RNA。第一百零一页，讲稿共一百零七页哦4脱氧核糖核酸酶（DNase）来源于牛胰，是内切核酸酶来源于牛胰，是内切核酸酶可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。产物是以5-磷酸为末端的寡核苷酸。在Mg2+存在下，独立作用于每条DNA链，且切割位点随机。在Mn2+存在下，在两条链的大致同一位置切割dsDNA，产生平端或1-2个核苷