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1、关于细胞的破碎(2)1第一页，讲稿共一百零一页哦2生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程原料液原料液预处理和固液分离预处理和固液分离细胞胞内产物细胞胞内产物路线一路线一路线二路线二细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离路线一路线一A A路线一路线一B B清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离(盐析、萃取、超过滤等盐析、萃取、超过滤等)纯化纯化(层析、电泳层析、电泳)脱盐脱盐(凝胶过滤、超过滤凝胶过滤、超过滤)浓缩浓缩(超过滤超过滤)精制精制(结晶、干燥结晶、干燥)包含体包含体溶解溶解(加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲)复性复性第二页，讲稿共一百零一页哦3常见的细胞壁结构细胞破碎技术本章的主要内容第三页，
2、讲稿共一百零一页哦4概述概述不同类型细胞生产目标产物的类型：不同类型细胞生产目标产物的类型：n动物细胞多分泌到动物细胞多分泌到细胞外细胞外培养液培养液n植物细胞多为植物细胞多为胞内胞内产物产物n微生物（细菌微生物（细菌/酵母酵母/霉菌等）霉菌等）胞内、胞外胞内、胞外 第四页，讲稿共一百零一页哦5概述概述(大多数情况下，大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸酸等目标产物存在于发酵液中。等目标产物存在于发酵液中。(有些目标产物存在于生物体中。有些目标产物存在于生物体中。l尤尤其其是是由由基基因因工工程程菌菌产产生生的的大大多多数数蛋蛋白白质质是是在细胞内沉
3、积。在细胞内沉积。l脂类物质脂类物质和一些和一些抗生素抗生素包含在生物体中。包含在生物体中。对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。第五页，讲稿共一百零一页哦6酶酶来源来源应用范围应用范围L-天冬酰氨酶天冬酰氨酶Eruinia CaratovoraEscherichia Coli治疗急性淋巴癌治疗急性淋巴癌过氧化氢酶过氧化氢酶Aspergillus niger牛奶灭菌后牛奶灭菌后H2O2的清除的清除胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶Nocardia hodochrous胆固醇浆液分析胆固醇浆液分析-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Kluyveromyces fragilisS
4、accharomyces lactis在牛奶在牛奶/乳清中乳糖的水解乳清中乳糖的水解作用作用葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶Aspergillus nigerPenicilluim notatum葡萄糖浆液分析葡萄糖浆液分析食品中氧的清除食品中氧的清除葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶Yeast临床分析临床分析蔗糖酶蔗糖酶Saccharomyces Cerevisiae糖果、蜜饯糖果、蜜饯青霉素酰化酶青霉素酰化酶Escherichia Coli苄青霉素的脱酰作用苄青霉素的脱酰作用表表1 胞内酶举例胞内酶举例细胞破碎的必要性第六页，讲稿共一百零一页哦7药物名药物名宿主宿主用途用途胰岛素胰岛素大肠杆菌
5、大肠杆菌治疗糖尿病治疗糖尿病人生长激素（人生长激素（HGH）大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病-干扰素干扰素大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤病和卡波济肉瘤表表2 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物第七页，讲稿共一百零一页哦8n细胞破碎细胞破碎（cell disruptioncell disruption）技术是指利用技术是指利用外力外力破坏细胞膜破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。n细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非
6、分泌型非分泌型生化物质（产生化物质（产品）的基础。品）的基础。n随着随着重组重组DNADNA技术和组织培养技术技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。获得的蛋白质现在可以大规模生产。n为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。物细胞壁的组成和结构。第八页，讲稿共一百零一页哦9Z微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
7、Z通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。Z不不同同细细胞胞壁壁的的结结构构和和组组成成不不完完全全相相同同，故故细细胞胞壁壁的的机机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。第一节第一节 细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构第九页，讲稿共一百零一页哦10细胞壁的组成与结构微生物微生物革兰氏阳性革兰氏阳性细菌细菌革兰氏阴性革兰氏阴性细菌细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚/nm20801013100300100250层次层次单
8、层单层多层多层多层多层多层多层主要组成主要组成肽聚糖肽聚糖（4090）、）、多糖、胞壁多糖、胞壁酸、蛋白质、酸、蛋白质、脂多糖（脂多糖（14）肽聚糖（肽聚糖（510）脂蛋白、脂蛋白、脂脂多糖多糖（1122）磷）磷脂、蛋白质脂、蛋白质葡聚糖葡聚糖（3040）甘露聚糖甘露聚糖（30）、）、蛋白质（蛋白质（68）、脂）、脂类（类（8.513.5）多聚糖多聚糖（8090）脂类、蛋白质脂类、蛋白质第十页，讲稿共一百零一页哦11细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构n几几乎乎所所有有细细菌菌的的细细胞胞壁壁都都是是由由肽肽聚聚糖糖组组成成，它它是是难难溶溶性性的的聚聚糖糖链；链；n相相邻邻聚聚糖糖链链上上的的短短肽
9、肽又又交交叉叉相相联联，构构成成了了细细胞胞壁壁的的三三维维网网状状结结构构，包围在细胞周围；包围在细胞周围；n使细胞具有一定的形状和强度。使细胞具有一定的形状和强度。第十一页，讲稿共一百零一页哦12细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构u破碎细菌的主要阻力是来自于破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。在的肽键的数量和其交联的程度。网状结构越致网状结构越致密，破碎的难度越大。密，破碎的难度越大。u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰
10、氏阳性菌有很大不同。大不同。革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固。性细菌的坚固。u革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌典典型型的的生生物物是是大大肠肠杆杆菌菌，通通过过这这种种细胞生产了很多细胞重组的产物。细胞生产了很多细胞重组的产物。第十二页，讲稿共一百零一页哦13 图图1 革兰氏菌细胞壁结构图革兰氏菌细胞壁结构图 （a）革兰氏阳性菌）革兰氏阳性菌 （b）革兰氏阴性菌）革兰氏阴性菌第十三页，讲稿共一百零一页哦14n最最里里层层是是由由葡葡聚聚糖糖的的细细纤纤维维组组成成，它它构构成成了了细细胞胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状；壁的刚性骨架，使细胞具有一定的
11、形状；n上面的是一层上面的是一层糖蛋白糖蛋白；n最最外外层层是是甘甘露露聚聚糖糖，由由1,6-1,6-磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接成成网网状。在该层的内部，有甘露聚糖状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物。酶的复合物。n破破碎碎酵酵母母细细胞胞壁壁的的阻阻力力主主要要决决定定于于壁壁结结构构交交联联的紧密程度和它的厚度。的紧密程度和它的厚度。第十四页，讲稿共一百零一页哦15 图图2 酵母细胞壁的结构示意图酵母细胞壁的结构示意图M甘露聚糖；甘露聚糖；P磷酸二酯键；磷酸二酯键；G葡聚糖葡聚糖第十五页，讲稿共一百零一页哦16霉菌的细胞壁霉菌的细胞壁l霉菌的霉菌的细胞壁较厚细胞壁较厚，主要由，主要由
12、多糖多糖组成，其次还含有组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。较少量的蛋白质和脂类。l不同的霉菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大不同的霉菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数霉菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数多数霉菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。含纤维素。l与与酵酵母母和和细细菌菌的的细细胞胞壁壁一一样样，霉霉菌菌细细胞胞壁壁的的强强度度和和聚聚合合物物的的网网状状结结构构有有关关，不不仅仅如如此此，它它还还含含有有几几丁丁质质或或纤纤维维素素的的纤纤维维状状结结构构，所所以以强强度度有有所所提提高。高。第十六页，讲稿共一百零一页哦17l红红面面包包霉霉菌菌细细胞胞壁
13、壁具具有有同同心心圆圆层层状状结结构主要存在三种聚合物构主要存在三种聚合物l最最外外层层(a)(a)是是-和和-葡葡聚聚糖糖的的混混合物，合物，l第第2 2层层(b)(b)是糖蛋白的网状结构是糖蛋白的网状结构l第第3 3层层(c)(c)主要是蛋白质，主要是蛋白质，l最内层最内层(d)(d)主要是几丁质。主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图红面包霉菌细胞壁的结构示意图第十七页，讲稿共一百零一页哦18 微微生生物物细细胞胞壁壁的的形形状状、强强度度取取决决于于细细胞胞壁壁的的组组成成以及它们之间相互以及它们之间相互关联的程度关联的程度。内因：连接细胞壁网状结构的共价键。内因：连接细胞壁网状结
14、构的共价键。外外因因：各各类类微微生生物物的的遗遗传传信信息息、培培养养条条件件、菌菌龄、外界环境等。龄、外界环境等。第十八页，讲稿共一百零一页哦19植物细胞壁的结构植物细胞壁的结构l对对于于已已生生长长结结束束的的植植物物细细胞胞壁壁可可分分为为初初生生壁壁和和次次生生壁壁两两部部分。分。l初生壁初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄较薄（1 13m3m），富有弹性。），富有弹性。l初生壁初生壁由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-D-葡聚糖，
15、许多这葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。样的长链形成微纤丝。l它是构成细胞壁的骨架，它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。丝。第十九页，讲稿共一百零一页哦20植物次生细胞壁植物次生细胞壁 某某些些植植物物细细胞胞，当当生生长长停停止止后后，在在细细胞胞质质和和初初生生细细胞胞壁壁之之间间形形成成了了次次生生细细胞胞壁壁。次次生生壁壁一一般般较较厚厚(4m(4m以以上上)，常有三层组成。，常有三层组成。n在在次次生生壁壁中中，纤纤维维素素和和半半纤纤维维素素含含量量比比初初生生壁壁增增加加很很多多，纤纤维维素素的的微微纤纤丝丝排排列列得得更更紧紧密
16、密和和有有规规则则，而而且且存存在在木木质质素的沉积。素的沉积。因因此此次次生生壁壁的的形形成成提提高高了了细细胞胞壁壁的的坚坚硬硬性性，使使植植物物细细胞具有很高的机械强度。胞具有很高的机械强度。第二十页，讲稿共一百零一页哦21n不同种类的细胞结构差别很大，破碎的不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：顺序为：植物细胞真菌（如酵母菌）植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。动物细胞。第二十一页，讲稿共一百零一页哦22第二节第二节 细胞破碎技术细胞破碎技术n目的：目的：释放细
17、胞内含物释放细胞内含物。n分类：分类：按照是否存在外加作用力按照是否存在外加作用力分为机械法和非机械法。分为机械法和非机械法。问题：问题：破碎率是否越高越好？破碎率是否越高越好？以大肠杆菌为宿以大肠杆菌为宿主的药物多为胞主的药物多为胞内产物内产物第二十二页，讲稿共一百零一页哦23研研 磨磨第二十三页，讲稿共一百零一页哦24机械破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使通过
18、各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎细胞破碎方法分类细胞破碎方法分类第二十四页，讲稿共一百零一页哦25细胞破碎方法原理细胞破碎方法原理分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达可达较高破碎率较高破碎率，可较大规模操作可较大规模操
19、作，大分，大分子目的产物子目的产物易失活易失活，浆液分离困难浆液分离困难高压匀浆法高压匀浆法液体剪切作用液体剪切作用可达可达较高破碎率较高破碎率，可大规模操作可大规模操作，不适合，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作不适合大规模操作X-pressX-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合的产物不适合非非机机械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性，条件温和，
20、浆液易分离，具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差溶酶价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改变细胞膜的渗透性改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，低，通用性差通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低破碎率较低，常与其他方法结合使用，常与其他方法结合使用冻结融化法冻结融化法反复冻结反复冻结-融化融化破碎率较低破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法干燥法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，条件变化剧烈，易引起大分子物质失活易引起大分子物质失活第二十五页，讲稿共一
21、百零一页哦26其他新的细胞破碎方法：其他新的细胞破碎方法：激光破碎法激光破碎法 冷冻冷冻-喷射法喷射法 高速相向流撞击法高速相向流撞击法第二十六页，讲稿共一百零一页哦27细胞细胞声波声波搅拌搅拌液压液压冷冻压力冷冻压力动物细胞动物细胞7777革兰氏阴性芽孢杆菌和球革兰氏阴性芽孢杆菌和球菌菌6566革兰氏阳性芽孢杆菌革兰氏阳性芽孢杆菌5(4)54酵母酵母3.5342.5革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌3.5(2)32.5孢子孢子2(1)21菌丝菌丝16(1)5表表3 细胞对破碎的敏感度细胞对破碎的敏感度注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切
22、。第二十七页，讲稿共一百零一页哦28细胞破碎机理图细胞破碎机理图第二十八页，讲稿共一百零一页哦29一机械法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（homogenizationhomogenization）高速珠研磨破碎法（高速珠研磨破碎法（bead grindingbead grinding）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicationultrasonication）第二十九页，讲稿共一百零一页哦30采用采用高压匀浆器高压匀浆器（由（由高压泵和匀浆阀高压泵和匀浆阀组成）。组成）。1.高压匀浆法高压匀浆法（High-pressure homogeniza
23、tion）细胞悬浮液自高压室针细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，形阀喷出时，每秒速度每秒速度高达几百米高达几百米，高速喷出，高速喷出的浆液又射到静止的撞的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程这一系列高速运动过程中经历了中经历了高速剪切、碰撞高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破及压力骤降，造成细胞破碎。碎。第三十页，讲稿共一百零一页哦31高压匀浆阀结构示意图高压匀浆阀结构示意图进液口进液口出液口出液口阀座阀座碰撞环碰撞环阀杆阀杆高压匀浆器高压匀浆器第三十一页，讲稿共一百零一页哦32高压匀浆器高压匀浆器第三十二页，讲稿
24、共一百零一页哦33第三十三页，讲稿共一百零一页哦34大、中、小型高压匀浆器大、中、小型高压匀浆器第三十四页，讲稿共一百零一页哦35高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多高压匀浆器的种类较多：pWABWAB公司的公司的AVP Gaulin 31MRAVP Gaulin 31MR型型pBran and luebbe Bran and luebbe 公司公司SHL40SHL40型型p意大利意大利Niro SoaviNiro Soavi高压匀浆机高压匀浆机第三十五页，讲稿共一百零一页哦36高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆法使用时注意事项u高压匀浆器的操作温度上升约高压匀浆器的操作温度上升
25、约-/10MPa/10MPa为了控为了控制温度的升高，可在进口处用制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使干冰调节温度，使出口温度调节在出口温度调节在2020左右。左右。u可以采用可以采用单次单次通过匀浆器或通过匀浆器或多次多次循环通过等方式。循环通过等方式。u在在工工业业规规模模的的细细胞胞破破碎碎中中，对对于于酵酵母母等等难难破破碎碎的的及及浓浓度度高高或或处处于于生生长长静静止止期期的的细细胞胞，常常采采用用多多次次循环循环的操作方法。的操作方法。第三十六页，讲稿共一百零一页哦37高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围是大规模细胞破碎的常用方法是大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法适用
26、的范围：高压匀浆法适用的范围：n酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；n料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高压匀浆法的情况不宜使用高压匀浆法的情况：易造成堵塞的易造成堵塞的团状或丝状真菌团状或丝状真菌，较小较小的革兰氏的革兰氏阳性菌阳性菌，含有含有包含体包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）第三十七页，讲稿共一百零一页哦38影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细胞分率符合如下公式：被破碎的细胞分率符合如下公式：ln1/(1-R)=KNPln1/(1-R)=KN
27、P (15-1)(15-1)式中式中 R R 破碎率，为破碎率，为NN次循环后，蛋白次循环后，蛋白质的释放量质的释放量RnRn与最大释放量与最大释放量RmRm之比；之比；K K 与温度有关的速度常数；与温度有关的速度常数；P P 操作压力，操作压力，MPaMPa；与微生物种类有关的常数。与微生物种类有关的常数。第三十八页，讲稿共一百零一页哦39影响破碎的主要因素压力压力温度温度 有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450-450-750kg/m750kg/m3 3时，时，温度温度由由30300 0C C提高到提高到50500 0C C，破碎率约提高，破碎率约提高1.
28、51.5倍。倍。通过均浆器阀的次数通过均浆器阀的次数 第三十九页，讲稿共一百零一页哦40图图7细胞浓度及压力大小对破碎率的影响细胞浓度及压力大小对破碎率的影响 匀浆次数匀浆次数图图8 匀浆次数对破碎效果的影响匀浆次数对破碎效果的影响 第四十页，讲稿共一百零一页哦41l升高压力升高压力有利于破碎有利于破碎减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小可避免细胞碎片不至过小。但但p p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p p超生超生一
29、定值时，一定值时，R R增加但很慢。增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。l破碎性能还随破碎性能还随菌体种类菌体种类和和生长环境生长环境的不同而不同的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎；破碎；生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容比生长在复杂培养基上容易破碎。易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素第四十一页，讲稿共一百零一页哦42X-Press挤压机挤压机l改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至改进的高压方法：将浓缩的菌体
30、悬液冷却至-2525至至-30-30形成形成冰晶体冰晶体，利用，利用500MPa500MPa以上的以上的高压高压冲击冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。l细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。冰中的细胞变形所引起的。l主要用于实验室中主要用于实验室中。l优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。碎程度低以及活性的保留率高。l对冷冻对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。融解敏感的生化物质不适用。第四十二页，讲稿共一百零一页哦43X-P
31、ress挤压机挤压机第四十三页，讲稿共一百零一页哦442.珠磨法 bead millu珠磨是常用的方法u细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等石英砂、氧化铝等研磨剂研磨剂（直（直径小于径小于1mm1mm）一起快速搅拌或研）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。释放出内含物。u在工业规模的破碎中，常采用高在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机速珠磨机WSK卧式高效全能珠磨机第四十四页，讲稿共一百零一页哦45高速珠磨机工作原理l磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园
32、盘搅拌器高速旋磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；l细胞破碎是由细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起引起l在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。挡玻离小珠，使不被料液带出。l由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。但在大型设备中，采用但在大型设备中，采用夹套冷却带走热量是一个需要
33、考虑的问题夹套冷却带走热量是一个需要考虑的问题。第四十五页，讲稿共一百零一页哦46高速珠磨机高速珠磨机第四十六页，讲稿共一百零一页哦47Netzsch LM-20型珠磨机A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘C-环形震动侠缝分离器D-变速马达1和2料液进出口3和4 搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷却剂进出口n园盘以两种位置交错地安装在轴上，n一种处于径向，一种与轴倾斜，n径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。n由于交错的运动，提高了破碎效率。第四十七页，讲稿共一百零一页哦48珠磨机破碎作用方程u破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符破碎作用是相对于时间的一级反应速度
34、过程，符合下列公式：合下列公式：ln1/(1-R)=Kt 15-2ln1/(1-R)=Kt 15-2 uR R 破碎率；破碎率；K K一一 一级反应速度常数；一级反应速度常数；t t一一 时间。时间。uK K与搅拌与搅拌转速转速、细胞悬浮液、细胞悬浮液浓度浓度和循环和循环速度速度、玻璃小珠、玻璃小珠装量装量和珠体和珠体直径直径，以及，以及温度温度等相关。等相关。第四十八页，讲稿共一百零一页哦49 破碎的速率和效率与操作参数有关如：破碎的速率和效率与操作参数有关如：珠体的大小珠体的大小、珠体的装量、细胞浓度、操、珠体的装量、细胞浓度、操作温度、料液性质、搅拌器转速与构型等。作温度、料液性质、搅拌
35、器转速与构型等。此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构也有关系，如转盘外缘速度等。构也有关系，如转盘外缘速度等。第四十九页，讲稿共一百零一页哦50 一一般般来来说说，磨磨珠珠越越小小，细细胞胞破破碎碎速速度度越越快快，但但太太小小易易于于漂漂浮浮，并并难难以以保保留留在在研研磨磨机机的的腔腔体体中中。通通常常实实验验室室规规模模，珠珠体体直直径径为为0.2mm0.2mm较好，工业规模不得小于较好，工业规模不得小于0.4mm0.4mm。不不同同的的细细胞胞类类别别及及所所需需提提取取的的酶酶在在细细胞中的胞中的位置位置等也是应考虑的因素。等也是应考虑的因素。第五十页，
36、讲稿共一百零一页哦51 有有研研究究表表明明，减减小小磨磨珠珠直直径径起起先先会会提提高高卡卡乐乐酵酵母母蛋蛋白白质质的的释释放放速速度度，但但磨磨珠珠再再小小一一些些，蛋蛋白白质质的的释释放放速速度度反反而而稍稍有有下降。下降。eg.eg.从从酵酵母母细细胞胞中中提提取取D-D-葡葡萄萄糖糖-6-6-磷磷酸酸脱脱氢氢酶酶，最最好好使使用用0.55-0.85mm0.55-0.85mm大大小小的的玻玻璃璃珠珠，而而在在提提取取-D-D-葡葡萄萄糖糖苷苷酶酶时时，则最好使用较大尺寸（如则最好使用较大尺寸（如1mm1mm直径）磨珠。直径）磨珠。第五十一页，讲稿共一百零一页哦52 在在一一定定范范围围
37、内内，增增加加珠珠体体装装填填量量可可以以提提高高细细胞胞破破碎碎率率。但但超超过过某某一一限限度度时时，反反不不利利于细胞破碎和蛋白质的释放。于细胞破碎和蛋白质的释放。为为消消除除这这种种影影响响，必必须须提提高高搅搅拌拌器器的的功功率率，这这样样又又会会增增大大释释放放的的热热量量，给给破破碎碎带带来来困难。困难。一一般般研研磨磨机机腔腔体体内内的的填填充充密密度度控控制制在在80%-90%80%-90%，并随珠体大小变化。，并随珠体大小变化。第五十二页，讲稿共一百零一页哦53 细细胞胞浓浓度度对对悬悬浮浮液液的的流流变变特特性性具具有有影影响响，最最佳佳的的细细胞胞浓浓度度应应用用实实验
38、验来来确确定定。一一般般用用Netzsch Netzsch LM20LM20研研磨磨机机破破碎碎时时，细细胞胞浓浓度度控控制制在在40%40%左右。左右。第五十三页，讲稿共一百零一页哦54 CurrieCurrie等等人人的的研研究究表表明明，操操作作温温度度控控制制在在5-405-400 0C C范围内对破碎物的影响较小。范围内对破碎物的影响较小。常常采采用用冷冷却却夹夹套套和和搅搅拌拌轴轴的的方方式式来来调调节节磨室的温度。磨室的温度。n采用夹套冷却的方式实现温控采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好效果较好;n能耗与细胞破碎率成正比能耗与细胞破碎率成正比;第五十四页，讲稿共一百零一页哦55
39、 珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下以下,原因：原因：降低能耗、减少大分子目的产物的失降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。易分离而给后续操作带来的困难。第五十五页，讲稿共一百零一页哦56n实验室规模的细胞破碎设备有实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速高速组织捣碎机、组织捣碎机、Braun匀浆器。匀浆器。n中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理。中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理。n在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国
40、西门子机械公司制造）。公司和德国西门子机械公司制造）。第五十六页，讲稿共一百零一页哦57几种常见珠磨器几种常见珠磨器第五十七页，讲稿共一百零一页哦58第五十八页，讲稿共一百零一页哦59胶体磨胶体磨德国进口珠磨机德国进口珠磨机第五十九页，讲稿共一百零一页哦60高压匀浆法与高速珠磨法的比较高压匀浆法与高速珠磨法的比较项目项目高压匀浆法高压匀浆法高速珠磨法高速珠磨法操作参数操作参数少少多，液体损耗大多，液体损耗大连续操作时连续操作时配备热换器进行级配备热换器进行级间冷却间冷却兼具破碎和冷却，兼具破碎和冷却，减少产物失活减少产物失活达到较高破碎率达到较高破碎率需循环需循环2-42-4次次一次操作一次操
41、作适用范围适用范围团状、丝状真菌、团状、丝状真菌、较小革兰阳性菌不较小革兰阳性菌不宜，宜，包含体不宜包含体不宜几乎所有几乎所有的微生物的微生物细胞，包括含有包细胞，包括含有包含体的基因工程菌含体的基因工程菌的破壁的破壁第六十页，讲稿共一百零一页哦613.超声波破碎l超声波破碎法（超声波破碎法（Ultrasonication)Ultrasonication)利用超声波振荡利用超声波振荡器发射的器发射的15-25kHz15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。的超声波探头处理细胞悬浮液。l超声波振荡器以可分为超声波振荡器以可分为槽式和探头槽式和探头直接插入介质两直接插入介质两种型式，一般破碎效果
42、后者比前者好。种型式，一般破碎效果后者比前者好。l超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。的声频、声能有关。第六十一页，讲稿共一百零一页哦62超声波破碎的机理JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机(一般认为在超声波作用下液体发生一般认为在超声波作用下液体发生空化作用空化作用（cavitation),cavitation),(液体中液体中局部空穴局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液
43、体发生流动，从而使细胞破碎。切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。(操作过程操作过程产生大量的热产生大量的热，因此操作需在，因此操作需在冰水冰水或外部或外部冷却的容器中进行。冷却的容器中进行。第六十二页，讲稿共一百零一页哦63n空化现象空化现象：在强声波作用下，引在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。起气泡形成，胀大和破碎的现象。锡箔纸测试空化强度与空化密度锡箔纸测试空化强度与空化密度看得到的空化现象看得到的空化现象第六十三页，讲稿共一百零一页哦64振幅振幅细胞悬浮液的黏度细胞悬浮液的黏度表面张力表面张力被处理悬浮液的体积被处理悬浮液的体积珠粒的体积和直径珠粒的体积和直径探头的
44、形状和材料探头的形状和材料细胞悬浮液的流速细胞悬浮液的流速影响参数影响参数第六十四页，讲稿共一百零一页哦65超声波破碎的适用范围超声波破碎是超声波破碎是很强烈很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。的破碎。一般一般杆菌杆菌比球菌易破碎，比球菌易破碎，G-G-细菌细菌比比G+G+细菌易破碎，细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。对酵母菌的效果较差。优点：优点：操作简便，液量损失少。操作简便，液量损失少。缺点：缺点：超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质活性物质失活失活；大容量时能量利用率极低；噪声；大容量时能量利用率极低；噪声
45、大；大；对冷却的要求相当苛刻对冷却的要求相当苛刻，所以，所以不易放大，但不易放大，但在在在在实验室小规模细胞破碎中常用实验室小规模细胞破碎中常用实验室小规模细胞破碎中常用实验室小规模细胞破碎中常用。第六十五页，讲稿共一百零一页哦66图图10 USB600型微电脑控制超声波细胞粉碎机型微电脑控制超声波细胞粉碎机图图9 超声波细胞破碎仪的结构示意图超声波细胞破碎仪的结构示意图第六十六页，讲稿共一百零一页哦67技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例匀浆法匀浆法(孔型孔型)须使细胞通过的小孔，须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而使细胞受到剪切力而破碎破碎剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液细胞悬浮液大规
46、模大规模处理处理珠磨破碎珠磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁珠细胞被玻璃珠或铁珠捣碎捣碎剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物细胞的细胞的大规模大规模处理处理超声波法超声波法用超声波的空穴作用用超声波的空穴作用使细胞破碎使细胞破碎适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液细胞悬浮液小规模小规模处理处理研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中 便宜便宜匀浆法匀浆法(片型片型)细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎适中适中 适中适中动物组织及动物细动物组织及动物细胞胞不同机械破碎方法的比较第六十七页，讲稿共一百零一页哦68二、非机械破碎方法二、非机械破碎方法酶溶破碎法（酶溶破碎法（enzyme lys
47、isenzyme lysis）化学破碎法（化学破碎法（chemical treatmentchemical treatment）去垢剂破碎法（去垢剂破碎法（detergentsdetergents）渗透压冲击破碎法（渗透压冲击破碎法（osmotic shockosmotic shock）冻融破碎法（冻融破碎法（freezing and thawingfreezing and thawing）第六十八页，讲稿共一百零一页哦69非机械方法很多1 酶解2 化学法溶胞3 物理法n渗透压冲击n冻结和融化n干燥法其中酶法和化学法溶胞酶法和化学法溶胞应用最广。二第六十九页，讲稿共一百零一页哦70 1 酶解（
48、酶溶法 Enymatic lysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶等壳多糖酶等第七十页，讲稿共一百零一页哦71外加酶法n酶解法的特点是酶解法的特点是专一性强专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。细胞的结构和化学组成来选择。n溶菌酶溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能专一性地分
49、解细胞壁上能专一性地分解细胞壁上肽聚糖肽聚糖分子的分子的-1,4-1,4糖苷键，因此主要用于糖苷键，因此主要用于细菌细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTAEDTA一起使用一起使用。n放线菌放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，主要成分，所以也能采用溶菌酶，n酵母和霉菌酵母和霉菌由于细胞壁的组分主要是
50、纤维素、葡聚糖、几由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。等。n植物植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。裂解。第七十一页，讲稿共一百零一页哦72外加酶法有时采用几种有时采用几种酶的混合物酶的混合物会产生更好的效果，加入时需会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶蛋白酶作用蛋白作用蛋白质质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚