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1、关于蛋白质的共价结构(3)现在学习的是第1页，共34页一、蛋白质的分子大小一、蛋白质的分子大小l单体蛋白质：有的蛋白质是由一条多肽链组成，如溶菌酶、肌红蛋白单体蛋白质：有的蛋白质是由一条多肽链组成，如溶菌酶、肌红蛋白 寡聚蛋白质：血红蛋白（寡聚蛋白质：血红蛋白（2、2）、）、己糖激酶（己糖激酶（4）l不含辅基的简单蛋白质分子量不含辅基的简单蛋白质分子量=aa数目数目*110现在学习的是第2页，共34页二、二、肽肽现在学习的是第3页，共34页（一）肽和肽键的结构（一）肽和肽键的结构一一个个氨氨基基酸酸的的氨氨基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸的的羧羧基基之之间间失失水水形形成成的的酰酰胺胺键键称称
2、为为肽肽键键，所所形成的化合物称为形成的化合物称为肽肽。氨基酸借肽键联结成多肽链。氨基酸借肽键联结成多肽链。由由两两个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称称为为二二肽肽，由由多多个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽则则称称为为多多肽肽。组组成成肽肽链的氨基酸由于参加肽键的形成已经不是原来完整的分子因此称为氨基酸残基。链的氨基酸由于参加肽键的形成已经不是原来完整的分子因此称为氨基酸残基。现在学习的是第4页，共34页肽的命名肽的命名l在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。氨基酸顺序。l通常在多肽链的一端含有一个游离的通常
3、在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基，称为氨基端或氨基端或N-N-端端；在另一端含有；在另一端含有一个游离的一个游离的-羧基，称为羧基，称为羧基端或羧基端或C-C-端。端。l氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-N-端的端的氨基酸残基开始，以氨基酸残基开始，以C-C-端端氨基酸残基为终点的排列顺序。氨基酸残基为终点的排列顺序。如下五肽可表示为：如下五肽可表示为：名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸(5(5肽，肽，4 4个肽键个肽键)写法：写法：Ser-Gly-Try-Ala-LeuSer-Gly-Try-Ala-Leu或，（或，（*反过来写是另外的肽）
4、反过来写是另外的肽）现在学习的是第5页，共34页*肽键的结构特点：肽键的结构特点：（1 1）肽键即）肽键即-C-CNH-NH-这种结构是蛋白质分子这种结构是蛋白质分子中的主要共价键，其中中的主要共价键，其中C-NC-N键具有约键具有约40%40%的部分的部分双双键性质，而不能自由旋转。键性质，而不能自由旋转。o现在学习的是第6页，共34页（2 2）组组成成肽肽键键的的4 4个个原原子子和和它它相相邻邻的的两两个个-碳碳原原子子（CC）都都处处于于同一个平面内，此平面称为肽平面（或酰胺平面）。同一个平面内，此平面称为肽平面（或酰胺平面）。现在学习的是第7页，共34页多肽链可以看成由无数个酰胺平面
5、被多肽链可以看成由无数个酰胺平面被CC串联起来组成的；串联起来组成的；现在学习的是第8页，共34页（3 3）在肽平面内，两个）在肽平面内，两个C C原子及其原子及其氨基酸的侧链氨基酸的侧链R互相远离形成反式构型，互相远离形成反式构型，肽链中的肽键一般是肽链中的肽键一般是反式构型反式构型，反式构型比顺式稳定。，反式构型比顺式稳定。CNCHCO肽键的反式构型肽键的反式构型现在学习的是第9页，共34页(二二)肽的物理和化学性质肽的物理和化学性质1.1.旋光性旋光性 短肽短肽的旋光度约等于其各个氨基酸的旋光度的总和；但长肽和蛋白质并的旋光度约等于其各个氨基酸的旋光度的总和；但长肽和蛋白质并不是氨基酸的
6、简单加和。不是氨基酸的简单加和。2.2.肽的酸碱性质肽的酸碱性质l短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子形式存在。短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子形式存在。N端端NH l肽的酸碱性质主要取决于肽的酸碱性质主要取决于 C端端COOH 侧链上可解离的基团侧链上可解离的基团l在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。现在学习的是第10页，共34页3.肽的化学反应肽的化学反应l 肽肽的的-羧羧基基、-氨氨基基和和侧侧链链R基基上上的的活活性性基基团团都都可可以以发发生生与与游游离离氨氨基基酸酸中中相应的基团类似的反应，如茚三酮反应（相应的
7、基团类似的反应，如茚三酮反应（NH2末端氨基酸残基）。末端氨基酸残基）。l双缩脲反应双缩脲反应*一一般般含含有有两两个个或或两两个个以以上上肽肽键键结结构构的的化化合合物物与与CuSO4碱碱性性溶溶液液都都能能发发生生双双缩缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物，是脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物，是肽和蛋白质肽和蛋白质所特有的。所特有的。双缩脲反应可用于定量分析；游离氨基酸无此反应。双缩脲反应可用于定量分析；游离氨基酸无此反应。现在学习的是第11页，共34页(三三)天然存在的活性肽天然存在的活性肽 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也在生物体中，多肽最重要的存在形式
8、是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。殊的生理功能，常称为活性肽。1.还原型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽 GluCysGly（GSH）即谷氨酰半胱胺酰甘氨酸即谷氨酰半胱胺酰甘氨酸l 红红细细胞胞中中的的巯巯基基缓缓冲冲剂剂，维维持持血血红红蛋蛋白白和和红红细细胞胞中中其其它它蛋蛋白白质质的的半半胱胱氨氨酸酸残基（巯基）处于还原状态；残基（巯基）处于还原状态；2GSH GSSGl参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基。参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自
9、由基。H2O2+2GSH 2H2O+GSSGGSHPX现在学习的是第12页，共34页2.脑啡肽（脑啡肽（5肽）肽）具有镇痛作用。具有镇痛作用。Met-脑啡肽：脑啡肽：TyrGlyGlyPheMet Leu-脑啡肽：脑啡肽：TyrGlyGlyPheLeu现在学习的是第13页，共34页四、蛋白质测序的策略四、蛋白质测序的策略蛋白质的一级结构测定包括组成蛋白质的多肽蛋白质的一级结构测定包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸顺序，以及二硫键位链数目、多肽链的氨基酸顺序，以及二硫键位置的确定。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺置的确定。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。序，它是
10、蛋白质生物功能的基础。现在学习的是第14页，共34页测定步骤测定步骤(1)(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。l通过测定末端氨基酸残基通过测定末端氨基酸残基(N端或端或C端端)的摩尔数与蛋白质的摩尔数与蛋白质相对分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。相对分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。N端端现在学习的是第15页，共34页(2)多肽链的拆分多肽链的拆分l由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。l有些寡聚蛋白质，多肽链靠非共价键连接的；有些寡聚蛋白质，多肽链靠非共价键连接的；用变性剂：用变性剂：8 8mol
11、/Lmol/L 尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐盐 酸胍处理，酸胍处理，SDS-PAGE SDS-PAGE。有些多肽链间是通过有些多肽链间是通过二硫键交联的二硫键交联的现在学习的是第16页，共34页 (3)(3)断开多肽链内的二硫桥断开多肽链内的二硫桥 几条多肽链通过二硫键交联在一起，如下方法断开：几条多肽链通过二硫键交联在一起，如下方法断开：可在可在8mol/L尿素或尿素或6mol/L盐酸胍存在下：盐酸胍存在下：l用过量的用过量的-巯基乙醇（还原剂）巯基乙醇（还原剂）处理，使二硫键还原为巯基处理，使二硫键还原为巯基。l过甲酸氧化：过甲酸氧化：SS+HCOOOH SO3H 现在学习的是
12、第17页，共34页(4)(4)分析每条多肽链的氨基酸组成分析每条多肽链的氨基酸组成l分离、纯化的部分分离、纯化的部分多肽链样品完全多肽链样品完全水解水解（酸、碱酸、碱）后）后，测，测定其氨基酸组成，并定其氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的分子比或各种残基的数目数目，便于选择裂解，便于选择裂解方法及试剂。方法及试剂。现在学习的是第18页，共34页 (5)(5)鉴定多肽链的鉴定多肽链的N N末端和末端和C C末端残基末端残基l多肽链端基氨基酸分为两类：多肽链端基氨基酸分为两类：N-N-端氨基酸和端氨基酸和C-C-端氨基酸。端氨基酸。l在肽链氨基酸顺序分析中，最重要
13、的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。N末端末端现在学习的是第19页，共34页vSangerSanger法：法：2,4-2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯（SangerSanger试剂）试剂）在碱性条件下，能够与肽链在碱性条件下，能够与肽链N-N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。v在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的的DNP-DNP-氨基酸可以用层析法、色谱法进行鉴定。氨基酸可以用层析法、
14、色谱法进行鉴定。N-N-末末端端氨氨基基酸酸测测定定 二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB或或FDNBFDNB）法法现在学习的是第20页，共34页v在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨基发生端氨基发生酰基化作用，得到丹磺酰酰基化作用，得到丹磺酰-氨基酸氨基酸,水解氨基酸不需提取直接电泳或薄水解氨基酸不需提取直接电泳或薄层层析加以鉴定层层析加以鉴定。v此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol，比比DNFB
15、DNFB法高法高100100倍。倍。丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法法现在学习的是第21页，共34页vEdman法：多肽或蛋白质的末端氨基酸与苯异硫氰酸酯法：多肽或蛋白质的末端氨基酸与苯异硫氰酸酯（PITC,Edman 试剂）作用，生成无色试剂）作用，生成无色PTH氨基酸，有氨基酸，有机溶剂抽提，层析、色谱法鉴定。机溶剂抽提，层析、色谱法鉴定。vPTC基的引入只是降低第一个肽键的稳定性，可测定氨基的引入只是降低第一个肽键的稳定性，可测定氨基酸序列。基酸序列。苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（PITCPITC）法法现在学习的是第22页，共34页v氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的氨肽酶是一种肽
16、链外切酶，它能从多肽链的N-N-端逐个的端逐个的向里水解。向里水解。v反应时间反应时间氨基酸种类和数量氨基酸种类和数量动力学曲线动力学曲线，N-末端残基顺末端残基顺序。序。v酶对各种肽键的敏感性不一样。酶对各种肽键的敏感性不一样。氨肽酶法氨肽酶法现在学习的是第23页，共34页v多肽与无水肼加热，多肽与无水肼加热，C-C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸的氨基酸氨基酸酰肼化物。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，上氨基酸酰肼化物。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，上清中的清中的C C端游离氨基酸借助端游离氨基酸借助FDNB或或DNS法、层析鉴定。法、层析鉴定。vGln、Asn、
17、Cys、Arg不能用此法。不能用此法。肼解法肼解法C-C-末末端端氨氨基基酸酸测测定定无水无水现在学习的是第24页，共34页v羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的道蛋白质的C-末端残基顺序。末端残基顺序。羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶羧肽酶A：除除Pro、Arg、Lys 外的所有外的所有C端端a.a 羧肽酶羧肽酶B：只水解只水解Arg、Lysv目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,
18、C和和Y；A和和B来自胰脏；来自胰脏；C来来 自柑桔叶；自柑桔叶；Y来自面包酵母。来自面包酵母。现在学习的是第25页，共34页(6)(6)裂解多肽链成较小片段裂解多肽链成较小片段 采用不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段采用不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，对每段肽分离纯化、氨基酸鉴定。或肽碎片，对每段肽分离纯化、氨基酸鉴定。现在学习的是第26页，共34页v较高专一性，水解产率高，所以使用广泛。常见的蛋白酶（内切酶）有：较高专一性，水解产率高，所以使用广泛。常见的蛋白酶（内切酶）有：v胰蛋白酶：胰蛋白酶：Lys（Arg）X v胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）胰凝乳蛋白酶（糜
19、蛋白酶）Tyr（Trp、Phe）Xv胃蛋白酶：胃蛋白酶：Phe(Trp、Try、Leu)Phe(Trp、Try、Leu)v葡萄球菌蛋白酶（葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：蛋白酶）：GluXv梭菌蛋白酶（梭菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：蛋白酶）：ArgX多肽链的选择性降解多肽链的选择性降解酶酶裂裂解解法法C现在学习的是第27页，共34页v溴化氰水解法，溴化氰水解法，MetX v羟羟胺胺（NHNH2 2OHOH）断断裂裂，AsnGly AsnGly 专一性不强专一性不强化学裂解法化学裂解法现在学习的是第28页，共34页(7)(7)测定各肽段的氨基酸序列测定各肽段的氨基酸序列最常用的肽段测序方法是最常用
20、的肽段测序方法是Edman化学降解法，此外还有酶解法、化学降解法，此外还有酶解法、质谱法。质谱法。现在学习的是第29页，共34页vEdman反应反应:（苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯，PITC法）法）N-末端氨基酸分析法。此法的末端氨基酸分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链特点是能够不断重复循环，将肽链N-端端氨基酸残基逐一进行标记和解离。氨基酸残基逐一进行标记和解离。Edman化学降解法化学降解法肽肽肽肽段段段段氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸顺顺顺顺序序序序分分分分析析析析法法法法现在学习的是第30页，共34页耦联耦联环化断裂环化断裂转化转化产产物物：苯苯乙乙内内酰酰硫硫脲脲衍衍生生物物（PTH
21、-PTH-氨氨基基酸酸），无无色色，可可以用层析法分离鉴定。以用层析法分离鉴定。被被EdmanEdman用用来来鉴鉴定定多多肽肽的的NHNH2 2末末端端氨基酸氨基酸 。现在学习的是第31页，共34页v酶降解法：外肽酶如氨肽酶、羧肽酶，局限性大；酶降解法：外肽酶如氨肽酶、羧肽酶，局限性大；其它方法其它方法现在学习的是第32页，共34页(8)(8)重建完整多肽链的一级结构（氨基酸序列）重建完整多肽链的一级结构（氨基酸序列）l 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。整条多肽链的氨基酸顺序。v 例如：例如：16肽，端肽，端H 端端 法裂解肽段：法裂解肽段：ONS PS EOVE RLA HOWT 法裂解肽段：法裂解肽段：SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定结果：重叠法确定结果：ONHOWTSEOVERLAPS现在学习的是第33页，共34页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第34页，共34页