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1、江南大学硕士学位论文古越龙山黄酒的特征风味物质及其成因的初步研究姓名：吴春申请学位级别：硕士专业：发酵工程指导教师：陆健20090601摘要摘要本文利用现代色谱技术对黄酒中风味物质进行了研究。通过主成分分析确定古越龙山黄酒特征风味物质，并检测了风味物质在古越龙山黄酒发酵醪液与原酒中的变化。应用传统培养法，研究了黄酒发酵醪液中的原核微生物及其变化过程。通过实验室规模发酵实验，初步确定了风味物质的成因。本研究共考察了黄酒中9 1 种风味物质，其中1 6 种醇，2 9 种酯，9 种醛，9 种有机酸、1 7 种氨基酸，1 1 种脂肪酸，研究发现各地区间黄酒在风味物质种类与含量上差异明显。通过主成分分析
2、，最终确定古越龙山黄酒1 8 种特征风味物质，它们是苯甲醛、乙醛、异丁醛、2 羟基4 甲基戊酸乙酯、丁酸乙酯、异丁酸苯乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、十二酸甲酯、油酸甲酯、十二酸乙酯、丁醇、3 乙氧基丙醇、庚醇、十二醇、乳酸、富马酸、月桂酸。它们在古越龙山黄酒中含量明显大于其他地区黄酒，其中十二醇只在古越龙山黄酒中检出。通过检测古越龙山黄酒风味物质及特征风味物质在发酵醪液和原酒中的变化，发现醛、有机酸、脂肪酸主要在前酵阶段产生；酯类物质主要在后酵阶段产生。高级醇和氨基酸在前酵与后酵中都有明显的增加。特征风味物质中，苯甲醛、乙醛、3 乙氧基丙醇、庚醇、十二醇、异丁酸苯乙酯、苯甲酸乙酯、十二酸甲酯、
3、油酸甲酯、丁酸乙酯、乳酸、富马酸和月桂酸在前酵阶段产生。异丁醛在发酵前7 天没有检测到，后期才出现。丁醇虽然在酒精产生阶段有一定的积累，但主要还是在后酵中产生并显著增加。十二酸乙酯和2 一羟基4 甲基戊酸乙酯在酒精积累停滞的后酵阶段才有大幅的增加。通过传统培养方法分析了黄酒发酵过程中原核微生物的种类和数量。在黄酒的整个发酵过程中，共检出1 3 种原核微生物，B a c i l l u ss u b t i l i s，B a c i l l u ss p M 0 1 5，B a c i l l u ss p E p b a s 6，B a c i l l u sl i c h e n i f
4、o r m b z，B a c i l l u ss o n o r e n s 括，B a c i l l u sp u m i l u s，B a c i l l u sa l t i t u d i n i s，L a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m，B a c i l l u ss p D 6(2 0 0 7)，B a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s，B a c i l l u sv e l e z e n s i s，B a c i l l u sa t r o p h a e u
5、 s，B a c i l l a c e a eb a c t e r i u mN J-2 5。其中B a c i l l u ss u b t i l i s，B a c i l l u sp u m i l u s 为主要的原核微生物，出现在整个发酵过程中。通过实验室规模发酵实验，发现没有麦曲微生物参与的单一酵母发酵醪液中辛酸乙酯、亚油酸乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、十二酸乙酯和富马酸未能检测到；而麦曲中微生物参与的发酵，醛、酯、脂肪酸、有机酸和乙醇的总量都高于相同条件下单一酵母进行的发酵。虽然单纯酵母能产生大部分风味物质，但是麦曲中微生物参与发酵可以大幅度提高醪液中的有机酸和酯类物质的含量
6、。1 8 种特征风味物质大部分可由酵母产生，但是麦曲微生物对他们含量也有影响。庚醇、十二酸甲酯、油酸甲酯在实验室条件下发酵都没有被检出，他们可能和发酵液中厌氧菌相关。十二酸乙酯、富马酸在单一酵母发酵下没有被检测出，可能由麦曲中微生物产生。比较实验室进行的小规模发酵与工厂大罐发酵，除了有机酸的含量显著高于大罐发酵，其余各类风味物质醛、醇、酯、脂肪酸总量和乙醇的含量都低于大罐发酵结果，其中高级醇的总量远远低于大罐发酵的情况。关键词：黄酒，古越龙山，发酵醪液，特征风味物质，原核微生物A b s t r a c tA b s t r a c tT h ef l a v o rc o m p o u n
7、 d so fC h i n e s er i c ew i n ew e r es t u d i e db yc h r o m a t o g r a p h yt e c l m o l o g y T h r o u g hp r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s(P C A)，18k i n d so ff l a v o rc o m p o u n d sw e r ec o n s i d e r e da st h ec h a r a c t e r i s t i cf l a v o rc o m p o u
8、n d si nG u y u eL o n g s h a nr i c ew i n e F l a v o rc o m p o u n d si nG u y u eL o n g s h a nr i c ew i n ef e r m e n t a t i o nb r o t ha n dw i n eb a s ew e r ed e t e c t e d 1 1 1 es p e c i e sa n dq u a n t i t i e so fp r o k a r y o t i cm i c r o b e so ft h er i c ew i n ef e r
9、 m e n t a t i o np r o c e s sw e r ea n a l y z e db yt h et r a d i t i o n a lc u l t u r em e t h o d T h r o u g ht h ef e r m e n t a t i o nt e s ta tl a b o r a t o r ys c a l e，t h ec a u s eo ff o r m a t i o no ff l a v o rc o m p o u n d sW a sc o n f i r m e d 91k i n d so ff l a v o r
10、c o m p o u n d sw e r ed e t e c t e d，i n c l u d i n g16k i n d so fa l c o h o l s(e x c e p te t h a n 0 1)，2 9k i n d so fe s t e r s，9k i n d so fa l d e h y d e s，9k i n d so fo r g a n i ca c i d s，17k i n d so fa m i n oa c i d sa n dl1k i n d so ff a t t ya c i d s T h r o u g ha n a l y
11、s i s，t h ev a r i e t ya n dc o n t e n to ff l a v o rc o m p o u n d sw e r eo b v i o u s l yd i f f e r e n ta m o n gC h i n e s er i c ew i n e sp r o d u c e di nd i f f e r e n ta e r a s T h r o u g hp r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s(P C A)，b e n z a l d e h y d e，a l d e h
12、 y d e，i s o b u t y r a l d e h y d e，e t h y l2-h y d r o x y-4-m e t h y l v a l e r a t e，e t h y lb u t y r a t e，p h e n y le t h y li s o b u t y r a t e，e t h y lb e n z o a t e，e t h y lp h e n y l a c e t a t e，m e t h y l o l e a t e，m e t h y ld o d e c a n o a t e，e t h y ld o d e c a n
13、 o a t e，b u t a n o l，3-e t h o x y 1 p r o p a n o l，1-e n a n t h o l，d o d e c a n o l，l a c t i ca c i d，f u m a r i ca c i da n dl a u r i ca c i dw e r ec o n s i d e r e da st h ec h a r a c t e r i s t i cf l a v o rc o m p o u n d si nG u y u eL o n g s h a nr i c ew i n e F l a v o rc o m
14、 p o u n d si nG u y u eL o n g s h a nr i c ew i n ef e r m e n t a t i o nb r o t ha n dw i n eb a s ew e r ed e t e c t e d T h er e s u l t ss h o w e da l d e h y d e s，o r g a n i ca c i d s，f a t t ya c i d sw e r ep r o d u c e dm a i n l yi np r i m a r yf e r m e n t a t i o n E s t e r sw
15、 e r em i a n l yf o r m e di np o s tf e r m e n t a t i o n A l c o h o l sa n da m i n oa c i d sw e r ep r o d u c e db o t hi np r i m a r ya n dp o s tf e r m e n t a t i o n B e n z a l d e h y d e，a l d e h y d e3-e t h o x y 一1-p r o p a n o l，e n a n t h o l，d o d e c a n o l，p h e n y le
16、t h y li s o b u t y r a t e，e t h y lb e n z o a t e，e t h y lp h e n y l a c e t a t e，m e t h y ld o d e c a n o a t e，m e t h y lo l e a t e，e t h y lb u t y r a t e，l a c t i ca c i d，f u m a r i ea c i da n dl a u r i ca c i dw e r ef o r m e di np r i m a r yf e r m e n t a t i o n I s o b u
17、t y r a l d e h y d eW a sn o td e t e c t e di nf i r s t7d a y s I tm a i n l yf o r m e di np o s tf e r m e n t a t i o n B u t a n o l，e t h y ld o d e c a n o a t ea n de t h y lb u t y r a t ew e r em a i n l yf o r m e di np o s tf e r m e n t a t i o n T h es p e c i e sa n dq u a n t i t i
18、 e so fp r o k a r y o t i cm i c r o b e so ft h er i c ew i n ef e r m e n t a t i o np r o c e s sw e r ea n a l y z e db yt h et r a d i t i o n a lc u l t u r em e t h o d D u r i n gt h ew h o l ef e r m e n t a t i o np r o c e s s，t h i r t e e nk i n d so fp r o k a r y o t i cm i c r o b e
19、 sw e r ef o u n d T h e yw e r eB a c i l l u ss u b t i l i s，B a c i l l u ss p M o l5。B a c i l l u ss p E p b a s 6，B a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s，B a c i l l u ss o n o r e n s i s，B a c i l l u sp u m i l u s，B a c i l l u sa l t i t u d i n i s，L a c t o b a c i l l u sp l a n t a
20、r u m，B a c i l l u ss p D 6(2 0 0 矽，B a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s、B a c i l l u sv e l e z e n s i s，B a c i l l u sa t r o p h a e u sa n dB a c i l l a c e a eb a c t e r i u mN J 25 B a c i l l u ss u b t i l i sa n dB a c i l l u sp u m i l u sw e r et h ed o m i n a t i n gp
21、 r o k a r y o t i cm i c r o b e s，w h i c hw e r ef o u n dd u r i n gt h ew h o l ef e r m e n t a t i o np r o c e s s T h r o u g ht h ef e r m e n t a t i o nt e s t a tl a b o r a t o r ys c a l e，e t h y lc a p r y l a t e，e t h y ll a u r a t e，e t h y ll i n o l e a t e，d i i s o b u t y l
22、p h t h a l a t ea n df u m a r i ca c i dw e r en o td e t e c t e di nf e r m e n t a t i o nb r o t hw h i c hw e r ef e r m e n t e do n l yb yp u r ey e a s t E x c e p ta l c o h o l s，t h ec o n t e n to fa l d e h y d e s，e s t e r s，f a t t ya c i d sa n do r g a n i ca c i d si nf e r m e
23、n t a t i o nb r o t hb ym i x i n gm i c r o o r g a n i s mw e r em o r et h a nt h o s ef e r m e n t e db yp u r ey e a s t T h o u g hm a j o r i t yf l a v o rc o m p o u n d sw e r ep r o d u c e db yy e a s t，t h ec o n t e n to fo r g a n i ca c i d sa n de s t e r sw e r eo b s e r v a b l
24、 yi n c r e a s e db ym i c r o o r g a n i s mi nw h e a tq u A b s t r a c tM a j o r i t yo fc h a r a c t e r i s t i cf l o v e rc o m p o u n d sc o u l db ep r o d u c e db yy e a s t，e x c e p te n a n t h o l，m e t h y lo l e a t e，m e t h y ld o d e c a n o a t ea n de t h y ll a u r a t e
25、 C o m p a r et of a c t o r ys c a l ef e r m e n t a t i o n，t h ec o n t e n to fa l d e h y d e s，a l c o h o l s，e s t e r sa n df a t t ya c i d sw e r el o w e ri nl a b o r a t o r ys c a l ef e r m e n t a t i o n，e x c e p t i o n a l l yt h ec o n t e n to fa l c o h o l s C o n t r a r i
26、 l y,t h ec o n t e n to fo r g a n i ca c i d si nl a b o r a t o r ys c a l ef e r m e n t a t i o nw e r eq u i t em o r et h a nt h a ti nf a c t o r ys c a l ef e r m e n t a t i o n K e y w o r d s：G u y u eL o n g s h a n，r i c ew i n e，f e r m e n t a t i o nb r o t h，c h a r a c t e r i s t
27、 i cf l a v o rc o m p o u n d，p r o k a r y o t i cm i c r o o r g a n i s m独创性声明本人声明所呈交的学位论文是蕾人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：炎砉日期：伽7 厂I5签名：久酱日期：伽7 石5关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论
28、文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：昊痞导师签名：日期：第一章绪论第一章绪论1 1 立题背景和意义黄酒是我国特有的、历史最为悠久的传统酒种，是世界最古老的三大酿造酒之一。黄酒在世界酿造史上独树一帜，它酒性柔顺，酒体丰满，酒昧醇厚。体现了华夏民族内在醇厚、寓刚于柔的文化精神；它以其美妙的色泽、丰富的营养、独特的滋味而著称于世。近年来受益于经济持续增
29、长，酿酒行业也体现出消费升级带来的结构性变化：对酒的需求从“单纯嗜好 向“营养保健 转变，高度、烈性的不良饮酒观逐步被人们所摒弃，黄酒的低度、营养、保健的优势逐渐得到显现。2 0 0 1 年以来，黄酒逐步走出江苏、浙江、上海的地域限制，向全国市场发展。从产量来看，2 0 0 5 年，黄酒产量突破了2 0 0万千升，但是销售量与白酒和啤酒存在很大差距，仅占饮料酒总量的4 5。2 0 0 7 年黄酒行业各项经济技术指标又创新高，全国黄酒产量已达到2 3 0 万千升，销售收入比上年增长2 6 6。随着人们物质文化生活水平的日益提高，消费者对黄酒这一产品的要求也不断提高，黄酒的营养价值和口感，尤其是形
30、成黄酒风味的微量成分越来越受到消费者的普遍重视。近些年来，清爽型黄酒以其低度清爽、营养保健的天然属性迎合了当今社会新的消费价值趋向，相较传统黄酒，清爽型黄酒更加清淡。但是不论黄酒如何变化，黄酒的品质始终是黄酒生产和研究的核心内容，黄酒的风味和质量与其经济效益也是密切相关的，怎样在迎合消费者的同时保持各品牌黄酒的风味特征，这是每个生产者都需要重视的问题。绍兴古越龙山黄酒是中国黄酒的典型代表，保持其黄酒风味的典型性尤为重要。各地区黄酒在酿造工艺上差异并不是很大，但黄酒的风味随着生产地区的不同而表现出相当大的差异，这是由于黄酒的风味既与原料有关，也与各生产区域参与黄酒酿造中的微生物群落相关。传统黄酒
31、的魅力，在于产区特有的微生物群参与发酵，赋予酒产区特有的风味，要酿造好的黄酒，就要利用好微生物，揭示古越龙山黄酒酿造过程中有哪些功能性微生物尤其有意义。各地区黄酒的风味差异显著，而绍兴古越龙山黄酒在风味上又是如此的独特，因此采用现代先进的风味分析手段和技术，研究古越龙山黄酒风味组成及其特征风味物质，结合黄酒酿造中微生物的形成、代谢规律，推测特征风味物质的成因，是一项非常有意义的工作，并且对于丰富黄酒的酿造科学与理论，完善黄酒的质量评价体系，控制黄酒的风味和提高黄酒的质量具有重要的意义。1 2 国内外研究进展1 2 1 黄酒风味物质的研究进展黄酒作为中国特有的酒种，加上保密的原因，所以黄酒研究工
32、作的开展仅限于国内。江南大学硕士学位论文如同人们对世界上所有事物的认识那样，人们对黄酒的风味物质的了解程度，总是随着科技的日益进步而不断深化。对黄酒的挥发性物质的研究始于上世纪8 0 年代，表l l显示了黄酒的研究进展，从表中看出，前期研究的重点是摸索测定风味物质的方法，并没有全面的开展对黄酒风味物质的检测。表1 1 黄酒风味物质研究进展F i g 1 1T h er e s e a r c hd e v e l o p m e n to ff l a v o rc o u m p o u n d si nr i c ew i n e注：1 G C：气相色谱(g a sc h r o m a
33、t o g r a p h y)。2 S D E-G C M S：同时蒸馏一萃取气质联用(s i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o n-e x t r a c t i o ng a sc h r o m a t o g r a p h y-m a s ss p e c t r o m e t r y)。3 H S G C-M S：顶空进样气质联用(h e a ds p a c e-g a sc h r o m a t o g r a p h y-m a s ss p e c t r o m e t r y)。4 C,-C-M S：气相色谱-质谱联
34、用(g a sc h r o m a t o g r a p h y-m a s ss p e c t r o m e t r y)5 C a p-G C：毛细管电泳-气相色谱联用(c a p i l l a r yg a sc h r o m a t o g r a p h y)。近年来固相微萃取(s o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o n，S P M E)技术已发展的较为成熟，S P M E 是选择性地萃取气、液、固相物质的常用方法。该技术I 妇P a w l i s z y n 首创，并在过去的十年中得到了迅速发展，固相微萃取与液液萃
35、取相比，虽然不能分析更多的物质，但它具有操作时间短，样品量小，无需萃取溶剂，适于分析挥发性与半挥发性物质，重现性好等优点【7 1。国外研究人员已广泛应用固相微萃取技术对酒类【8，9，10 1，浆剥1，蜂蜜【1 2 1，烟草【1 3 1 等进行研究。2 0 0 4 年，郭翔【1 4】采用取固相微萃取技术(S P M E)与G C M S相结合来分析测定了两种品牌和实验室液化法新工艺黄酒的醇酯，并根据黄酒中挥发性风味物质的含量与强度，提出黄酒醇酯比的概念和划分区间。2 0 0 7 年，罗涛【l5 J 采用S P M E G C M S 分析了包括绍兴地区黄酒在内的六个不同黄酒企业的清爽型黄酒。国内
36、研究人员在利用S P M E 技术研究黄酒挥发性风味物质重点在于方法的建立与可靠性验证，在此基础上尽可能多的检测黄酒的风味物质，没有结合非挥发性物质深入开展不同地域间黄酒风味差异的研究。现将黄酒微量成分检测的结果列表1 2。总体而言，通过先前的研究，已在中国黄酒中检出总计达6 7 种挥发性风味物质，绍兴地区黄酒含有检出的全部挥发性风味物质，在绍兴以外地区黄酒中发现6 1 种挥发性风味物质风味，庚酸、苯丙酸乙酯、愈创木酚、2 乙酰基呋喃，糠酸乙酯、糠醇在绍兴以外地区黄酒中检测不到【l 卯。确定乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、异戊醇、苯乙醇、异丁醇【1 4】和琥珀酸二乙酯【4】是黄酒中主要的挥发性风味2
37、第一章绪论表l-2 中国黄酒微量成分检测结果T a b l el-2I d e n t i f i e dt r a c ec o m p o u n d si nC h i n e s er i c ew i n e注：+表不I I I 现在古越龙山黄滔中物质，并初步确定乙酰基苯、苯甲醛、3 甲硫基丙醇、苯甲酸乙酯、己醇与绍兴地区黄酒风味较为密切【l 引。目前在古越龙山黄酒中最多发现5 5 种挥发性风味物质【5】，还没有对其典型的风味物质有过系统的研究。俗话说：“无酸不成酒。酸类化合物是黄酒不挥发性物质的主要组成部分，而且酸类对黄酒的口感影响较大。国内外对酒类不挥发性酸类物质上的测定主要采用
38、高效液相色谱(1 l i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y,H P L C)，长链饱和脂肪酸经处理后用气相色谱(G C)测定。在黄酒研究上，只有郭翔【1 6 1 对黄酒不挥发性的酸类有过研究，其主要工作在方法的建立上。这方面，日本对于清酒的研究较为深入。西崎等研究者在1 9 0 8年分别定量了清酒中的乳酸和琥珀酸，在1 9 6 8 年，林田等人利用S G C(s i l l i c ag e lc h r o m a t o g r a p h y)对清酒醪液中有机酸的变化过程和4 5 种清酒中有机酸进行过
39、分析研究1 17。T a k a h a s h i 等人对普通清酒氨基酸成分分析的基础上，提出丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸对酒体及色、香、味影响显著，而一部分由酵母产生的氨基酸则对酒的风味影响较d,1 1 8 1。日本研究人员在清酒上的研究既全面又深入，中国黄酒这方面的工作需要迅速的开展。1 2 2 黄酒酿造过程中微生物的研究现状酵母是酒类酿造中的主要微生物，有关它在风味物质产生中的作用和影响，在以酵3江南大学硕士学位论文母纯种发酵形成啤酒风味物质的研究中最为透彻。普遍认为啤酒的风味物质主要由酵母在发酵过程中产生，而且在同等条件下，不同种类的啤酒酵母产生风味物质的能力差异很大【1 9】。黄酒与啤酒
40、在发酵时的最大区别在于黄酒是敞口式，而且除了黄酒酵母外，发酵体系中还有来自于麦曲和环境中的各种微生物，也都可以参与发酵，这也是造成黄酒风味及其成因比啤酒更为复杂的原因。研究黄酒酿造过程中的微生物存在情况可以为揭示黄酒风味物质成因打下基础。在研究黄酒酿造微生物过程中，人们主要研究麦曲中的微生物，麦曲在制作过程中自然网罗制曲环境中的微生物，在控制工艺条件下(制曲温、湿度和培养时间)使微生物等生长繁殖和物质代谢。2 0 世纪8 0 年代后期以来，随着对传统固态发酵白酒再认识的需要，对白酒大曲微生态的研究逐渐进入高潮。对于黄酒酿造微生物研究，主要集中在麦曲微生物的研究上，但整个麦曲中的微生物体系，及微
41、生物种群之间的相互影响的关系，即微生物生态，基本处于一个未知的状态。对麦曲中的真菌在黄酒发酵过程中的动态变化和所起的作用等均未见报道。另外，2 0 0 5 年以前基于麦曲中微生物的研究和认识都是采用传统的培养分离方法I z 0。为了弥补传统研究方法的不足，国际上逐渐发展起了基于分子生物学的研究方法，即分子生物学技术。分子生物学技术最大的优点是直接从样品中提取总D N A，中间没有任何筛选性的过程。因此，所得D N A 能够准确地反映样品中微生物的实际情况，弥补了传统培养方法的不足之处，能够对某一微生物在该环境下存在的数量作出估计【2，对于微生物多样性的研究提供了新的研究方法。本研究室对黄酒酿造
42、过程中的真核微生物有较为全面的研究。在成品麦曲方面，方华【2 2 1 采用3 种培养基分离绍兴古越龙山总厂麦曲中的微生物，共得到1 6 株丝状真菌，发现伞枝犁头霉、米根霉、微小毛霉、米曲霉、烟曲霉占了所有分离真菌的8 9。李旺军【2 3】在方华研究的基础上对另一分厂麦曲真菌微生物进行了较为详细的研究，认为麦曲主要真菌为伞枝犁头霉，米曲霉，烟曲霉，黑曲霉，小孢根霉，微小根毛霉，季氏毕赤氏酵母，异常毕赤酵母，米根霉，酿酒酵母，热带假丝酵母，构巢裸孢壳，鲁西坦念珠菌。在麦曲中首次发现小孢根霉，季氏毕赤氏酵母，异常毕赤酵母。陈建刻2 4】在前两人研究的基础上对所有分厂的1 4 种成品麦曲进行培养和免培
43、养法研究发现，成品黄酒麦曲中所含的真菌主要是米曲霉、聚多麴菌、桔青霉、微小根毛霉、伞枝犁头霉、热带假丝酵母、鲁西坦念珠菌、东方伊萨酵母、阿姆斯特丹散囊菌、构巢裸胞壳、S p o r i d i o b o l u sp a r a r o s e u s，其中米曲霉、伞枝犁头霉、构巢裸胞壳存在于所有分厂生产的黄酒麦曲中。通过以上三人的研究，麦曲中主要的真核微生物为伞枝犁头霉、米曲霉，烟曲霉，而且随着厂区的不同麦曲中主要真菌微生物的种类差异也较大。在制曲过程方面，黄酒麦曲所含真菌通过培养和免培养法研究发现，黄酒麦曲在制曲过程中出现的真菌属于犁头霉属、曲霉属、毛霉属、裸胞壳属、锁掷酵母属、共头霉属
44、、青霉属、散囊菌属、伊萨酵母属、棒孢酵母属、毕赤酵母属、平脐蠕孢属和复膜孢酵母属。在麦曲制曲的前期，主要真菌是伞枝犁头霉、米曲霉、微小根毛霉、桔青霉、S p o r i d i o b o l u s p a r a r o s e u s。随着制曲过程的进行，主要真菌演变成伞枝犁头霉、米曲霉、4第一章绪论缴小稠丢墨民S p o r i d i o b o l u s p a r a r o s e u s、构巢裸胞壳、阿姆斯特丹散囊菌【2 4 J。对于制曲环境中的微生物，考察了厂区空气，制曲原料，制曲工具中的微生物，主要有曲霉属、青霉属、犁头霉属、裸胞壳属、毕赤酵母属、红酵母属、毛霉属、锁掷
45、酵母属、镰刀霉属、平脐蠕孢属、尖孢属和链格孢属。发现黄曲霉与米曲霉是黄酒厂的主要真菌f 2 4】。在发酵过程中，检测出伞枝犁头霉，米曲霉，赛氏曲霉，构巢裸孢壳，黑曲霉，桔青霉，异常毕赤酵母，多变根毛霉，粘质红酵母，克鲁塞念珠菌，酿酒酵母。其中伞枝犁头霉，异常毕赤酵母和米曲霉一直处于主导地位【2 3 1。由以上可以看出黄酒在酿造过程中真菌微生物相当的丰富，而黄酒在发酵过程中的原核微生物研究鲜有报告。而且人们对原核微生物在黄酒发酵过程中的作用一直存在争议。由于黄酒是敞口式发酵，曲、酒母及原料、环境、设备中原核微生物都可以进入黄酒发酵醪液中，特别当醋酸菌和乳酸菌等产酸细菌的侵入，控制不好就会引起黄酒
46、的酸败。而有的乳酸杆菌分解淀粉、糊精为糖，分解胨、多肽为氨基酸，供给酵母发酵产酒精，继续推动发酵作用的进行。乳酸杆菌发酵糖产乳酸，提高黄酒酸度，降-j k 毳p H 值；乳酸杆菌自溶分解为多肽、少量氨基酸和其他成分，促进黄酒的呈香呈味，增强黄酒口味的丰满性和浓厚感【2 引。所以有必要将黄酒中的原核微生物组成研究清楚，并进一步研究其在发酵中作用。1 2 3 风味物质的生成途径黄酒是在酵母参与下的多菌种发酵的酒精饮品。发酵过程中，微生物代谢将醪液中的糖、有机酸、氨基酸、风味前体物质转化为醇类、酸类、酯类、羰基类、杂环类等产物，期间产生的风味物质多种多样，对黄酒的风味都有影响。酒类风味物质的形成过程
47、和调控相当复杂，而黄酒又是多菌种发酵，使其变得尤为复杂。在酒类风味物质研究中，国内外对酵母产风味物质研究较多，酵母中高级醇、酯类、酸类物质基本的合成途径如图1 1 所示1 2 6 l。从图1 1 可以看出，高级醇的来源与氨基酸代谢分不开的。在发酵过程中，高级醇可由氨基酸通过脱羧和脱氨作用产生，也可利用酵母的氨基酸生物合成途径生物合成产生【2 7,2 8 1。在氨基酸的代谢过程中，上述两种方式都有可能存在，而且分解途径和合成途径相互转换。每种氨基酸对应一种高级醇，如缬氨酸对应于异丁醇，亮氨酸对应于异戊醇，苯丙氨酸对应于p 苯乙醇。前期研究表明，改变发酵液中的氨基酸含量或通过基因手段控制微生物，可
48、以改变发酵液中单一高级醇的含量【2 9 1。图1 1 显示酵母的酯代谢有两条合成途径。一种是在醇酰基转移酶(A l c o h o lA c e t y l t r a n s f e r a s e，简称为A A T a s e，E C2 3 1 8 4)的作用下由醇和脂肪酰基辅酶A 形成，第二种途径是酵母在酯酶(E s t e r a s e)的作用下由酵母产生的醇和脂肪酸合成，由于酯酶是一种可逆酶，发酵液中的酯可能被该酶水解成相应的醇和脂肪酸【3 0 1。酵母生成乙酸乙酯是以图1 1 的两种途径合成，乙酸异戊酯仅以醇酰基转移酶途径合成。酯的合成途径随酵母种类、酯的种类不同有明显区别【3
49、l】。F o j i i l 3 2】等人通过分子生物学手段，对清酒酵母中的醇酰基转移酶进行多拷贝，获得酵母突变株，再用突变株发酵日本清酒，提高了清酒江南大学硕士学位论文图1-1 发酵过程中酵母形成风味物质的基本途径F i g 1-1B i o c h e m i c a lb a c k g r o u n do f y e a s tf l a v o rp r o d u c t i o n中乙酸异戊酯的含量，从而改善清酒质量。酯类的生成与乙醇或高级醇、脂肪酸、辅酶A 和酰基转移酶(即酯合成酶)等有关【3 3，3 4】。通过数年的研究发现【3 1 1，乙醇乙酰基转移酶的活性是发酵过程中影
50、响酯类生成最重要的因素。乙醇乙酰转移酶A A T a s e I 和A A T a s e l l 分别由A t f l p 和A t f 2 p 基因编码，催化乙醇和乙酰 C o A 合成乙酸乙酯。与此同时，高级醇和乙酰C o A 的含量对酯类的生成量也有一定的影响。目前还不能确定每个活性脂肪酰C o A 分子是否都有自己唯一的酰基转移酶，或者几个这样的酶能否催化所有酯类的形成。N o r d s t o m【3 4 J 指出虽然乙酰-C o A 能通过丙酮酸氧化脱羧作用形成，但其它酰基C o A 化合物大部分来自于由乙酰基-C o A 合成酶催化的酰基化作用。图1 1 显示，脂肪酸来源也有