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1、第二军医大学博士学位论文机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究姓名：张伟申请学位级别：博士专业：指导教师：陈德玉2011-03第二军医大学博士学位论文-6-机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究 机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究 摘 要 目目 的的 颈椎后纵韧带骨化（ossification of cervical posterior longitudinal ligament,OPLL）是以颈椎后纵韧带异位骨化为特点的一种疾病，在骨化过程中伴随着脊髓和神经受压，导致患者出现四肢感觉运动及大小便功能障碍等临床症状，严
2、重的影响患者的生活质量，在以日本为首的亚洲国家中具有较高发病率，其具体的发病机制目前并不完全清楚。最新临床研究发现，OPLL 患者行颈椎后路椎管成形术或者后路椎板切除术后，颈椎稳定性下降，活动度增加，随访期间发现患者的骨化进展速度较未手术患者明显加快；而 OPLL 患者行前路减压融合术后，因为病变节段活动度消失，骨化进展明显减慢或完全消失。同时，机械应力刺激因素在动物实验得到进一步证实：对大鼠尾端椎体进行牵张应力刺激 2 周后即发现大鼠近端椎体韧带出现明显骨化倾向。因此，可以肯定局部机械应力刺激是促进韧带异位骨化发生、发展的一个极其重要的环境因素。蛋白质组学（Proteomics）的概念自 2
3、0 世纪 90 年代后期提出以后，作为后基因组学时代的研究工具，在蛋白质组表达、蛋白质功能研究中发挥越来越大的作用，对发现疾病标志物、药物靶点的确证等方面有着十分重要的意义。差异凝胶电泳(DIGE)是对 2-DE 在技术上的改进，该技术结合了多重荧光分析的方法，通过花青染料的荧光素蛋白质中的赖氨酸残基进行结合，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入内标的概念。该技术可以使样本间的差异蛋白质点显示更加容易、更加准确，可以发现更多表达差异的蛋白质点。随后利用MALDI-TOF/TOF MS 质谱技术以及肤质量图谱(pePtidemassfingerprint，PMF)等多种
4、数据的组合来确定可靠的蛋白质。本研究采用蛋白组学研究方法，通过荧光差异凝胶电泳（differential gel electrophoresis,DIGE）及质谱技术筛选并鉴定颈椎后纵韧带成纤维细胞在机械应力诱导骨向分化过程中表达差异的蛋白质，并通过生物信息学分析，获得蛋白质水平上关于疾病发生过程的整体而全面的认识，分析多个细胞内信号传导途径在疾病发生过程中所起的作用，期望找到机械应力在颈椎后纵韧带骨化发生、发展过程中相关的细胞信号分子蛋白，探讨力学刺激在颈椎后纵韧带骨化发展过程中的可能的病理学和分子机制，为临床 OPLL 的治疗提供可能的药物靶点。机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维
5、细胞的蛋白组学研究-7-方方 法法 我院骨科从2009年3月至2010年4月共收治12例颈椎后纵韧带骨化患者，全部病例行颈椎前路椎体次全切除减压、植骨融合内固定术，术中获得患者后纵韧带组织，另外收集 10 例非骨化患者的颈椎后纵韧带骨化组织（颈椎病 2 例，颈椎外伤8 例），采用组织块贴壁法培养、鉴定骨化与非骨化后纵韧带成纤维细胞。将传至第 3代的成纤维细胞（骨化组与非骨化组）接种于 6 孔培养板内，贴壁后同步化 24 小时，采用 Flexercell4000 应力加载系统对细胞施加 10%-0.5 Hz 的机械应力，持续加载 24小时，以同样种于 Flexercell 板未施加机械应力为对照
6、组（骨化组与非骨化组），采用半定量 RT-PCR 技术检测机械应力诱导前后三个成骨特异指标骨钙素（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）及 I 型胶原（COL I）表达量的差异，明确成纤维细胞经机械应力诱导后有无发生骨向分化。DIGE 裂解液、超声破碎抽提骨化组细胞的总蛋白质样本，普通 2-DE 双向凝胶电泳分离，染色鉴定成纤维细胞蛋白质样本的量及确定电泳条件是否满意。然后加大上样量，以 Cy2、Cy3 及 Cy5 荧光素标记机械应力诱导前后的成纤维细胞蛋白样品各 50g，以所有样本的混合物 50g 作为内参，进行双向荧光差异凝胶电泳（DIGE）。获得荧光差异表达图谱，利用 DeCyder6.5 图谱
7、软件进行胶内及生物学差异分析，确定差异表达的蛋白质点。挑取差异表达的蛋白点，手工切胶后酶解以获得肽段样本。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrum,MALDI-TOF/TOF MS）进行鉴定并分析差异表达的蛋白质点。查阅相关参考文献，总结分析相关表达差异蛋白质的分子量、功能及细胞内的分布，推测其在 OPLL 进程中的可能作用及机制。选择有深入研究价值的蛋白-波形蛋白，采用 Western Blotting技术从蛋白水平进一步验证 DIGE 和质谱技术
8、筛选出来差异蛋白质表达水平差异的准确性。然后利用 RNAi 干扰技术，阻断波形蛋白的表达，再采用半定量 RT-PCR 技术检测机械应力诱导前后三个成骨特异性指标骨钙素（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）及 I 型胶原（COL I）表达量的差异，进一步验证波形蛋白是否在 OPLL 韧带成纤维细胞骨化进程中的重要作用，深入探讨其在力学因素诱导 OPLL 骨化中可能的分子机制。结结 果果 利用组织贴壁法成功的培养了骨化与非骨化颈椎后纵韧带成纤维细胞，经鉴定确认细胞为成纤维细胞。机械牵张应力可诱导来源于颈椎颈椎后纵韧带骨化患者的韧带组织成纤维细胞发生骨向分化，RT-PCR确认成纤维细胞经机械应力诱导后成骨
9、特异性标记物OCN、ALP、COL I表达量明显增高，而对于来源于非骨化患者的颈椎后纵韧带组织成纤维细胞却无相应作用，诱导前后OCN、ALP、COL I未见明显变化。提取骨化组后纵韧带成纤维细胞牵拉组和对照组细胞的总蛋白，然后行普通2-D第二军医大学博士学位论文-8-电泳实验，染色后得到的图谱显示蛋白质丰度、分离情况及电泳条件满意。荧光差异双向凝胶电泳（DIGE）获得的荧光胶图，胶间比较共筛选出34个差异表达蛋白质点，其中 4 个蛋白质在表达上调，30个蛋白质点下调；最大上调比例为1.58倍；最大下调比例为5.47倍。选择的标准为丰度具有显著性改变（比值1.2倍，P0.05)的蛋白质点被从考染
10、的制备胶上切下用于质谱分析。手工切胶获得蛋白质点的肽段样本，采用MALDI-TOF/TOF MS质谱技术成功鉴定了15个表达差异的蛋白，其中14个表达下调，1个表达上调。查阅相关文献，根据这些蛋白质的功能分为以下几类：代谢酶类、蛋白质翻译相关蛋白、细胞骨架蛋白和其它相关蛋白。多种蛋白质发现与骨化相关，选择可能在OPLL发生和发展过程中起关键作用的蛋白-波形蛋白（Vimentin）行进一步验证，通过Western blotting技术验证了DIGE的实验结果，并通过RNAi实验进一步验证了其在OPLL韧带成纤维细胞骨化进程中的重要作用。结结 论论 组织块培养法可成功进行颈椎后纵韧带成纤维细胞的培
11、养。机械应力刺激诱导 OPLL 组后纵韧带成纤维细胞后 OCN、ALP 及 COL I 的高表达说明机械应力刺激在后纵韧带骨化进展过程中的促进作用。通过 DIGE 及质谱技术筛选并鉴定成纤维细胞在机械应力诱导后表达差异的蛋白质，建立了比较蛋白质组学在 OPLL 发病过程中研究的技术路线。通过 RNAi 干扰试验发现波形蛋白在颈椎后纵韧带骨化症发展中有重要的调控作用。关关 键键 词词 后纵韧带骨化症；机械应力；双向凝胶电泳；质谱；成纤维细胞；波形蛋白 机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究-9-Proteomic Analysis of Osteogenic Differ
12、entiated Fibroblast of Cervical Posterior Longitudinal Ligamental Induced by Mechanical Stress Abstract OBJECTIVE Ossification of cervical posterior longitudinal ligament was characterized by ectopic spinal ligament ossification and at the same time spinal cord and nerve compression,resulting in pat
13、ients functional disorder of limbs and bowel and bladder dysfunction,which affected the quality of life of patients severely.The disease was popular in Asian,especially in Japan,and the pathogenesis was not fully understood.Clinical study found that compared with before-surgery,the progress of the o
14、ssification of the cervical posterior longitudinal ligament were significantly accelerated because of decreased cervical stability and increased cervical motion after laminectomy and laminoplasty.However,the progress of ossification of the cervical posterior longitudinal ligament slowed down or disa
15、ppear after anterior approach for OPLL,because the motion of cervical segment disappeared after the fusion surgery.Meanwhile,that the proximal vertebral ligament show significant ossification tendency after the mechanical stress stimuli the rat tail vertebrae for 2 weeks confirmed the fact that mech
16、anical stress had important role in ossification of the cervical posterior longitudinal ligament,and was an extremely important environmental factors.Proteomics used the complete protein of cell or tissue as the research object,the method provided a new means of detection of disease markers,the dise
17、ase-causing protein,drug targets and so and has a great significance meanings.In this study,these differentially expressed proteins of fibroblast of the cervical posterior longitudinal ligament induced by mechanical stress were screened and identified by fluorescence difference gel electrophoresis a
18、nd mass spectrometry,and analysis the protein level on the overall disease process by Bioinformatics technique,fund the effect of these protein in the comprehensive multiple intracellular signal transduction pathway,第二军医大学博士学位论文-10-understanding the pathogenesis of mechanical stress in the processes
19、 of OPLL,improved the possible drug targets.METHODS We obtain the posterior longitudinal ligament of OPLL patients(12 cases)and patients with non-ossification of posterior longitudinal ligament(10 cases)from March 2009 to April 2010 by anterior cervical corpectomy and fusion surgery.The fibroblast o
20、f cervical posterior longitudinal ligament was cultured by tissue adherent method.The two sets of passage 3 cells(OPLL group and non-OPLL group)were inoculated in 6-well culture plate,after the synchronization for 24h,and then imposed 10%-0.5 Hz mechanical Stress 24h with Flexercell4000 stress machi
21、ne.The control group(OPLL group and non-OPLL group)was synchronization for 24h without mechanical stress appalied.we extracted the total RNA of the two groups of cells,and detected the expression differences of osteogenic gene of osteocalcin,alkaline phosphatase and type I collagen,and make sure whe
22、ther the fibroblast occurred bone differentiation.And then we extracted the total protein of static and stress induced cells respectively,the strained and static cell proteins were labeled randomly with Cy3 or Cy5.We use the 2-DE techque to separated The labeled samples together with internal standa
23、rd.And then analyzed the Gels by Typhoon.The protein spots which had change overt were picked by hand.The digested peptides were identified by MALDI-TOF-TOF MS.According to the references articles,we analyzed the localization of the protein,function,localization of the protein.Western blot were also
24、 been used to confirm the different expression levels between static and strain OPLL ligament cells.Additionally,we performed shRNA interfering targeting vimentin cells cultured from spinal ligament specimens from OPLL,then evaluated the expressions of osteoblastic genes including osteocalcin(OCN),a
25、lkaline phosphatase(ALP)and type I collagen(Col I)via RT-PCR.RESULTS Our data showed mechanical stretch stress would induce the fibroblast of the cervical posterior longitudinal ligament of OPLL osteogenic differentiation,and the expression of gene of OCN,ALP,COLwas significantly increased,while the
26、 fibroblast of the cervical posterior longitudinal ligament of non-OPLL didnt show the osteogenic differentiation,and there was no significantly increase in the expression of gene of OCN,ALP,COL.The cultured fibroblast of the cervical posterior longitudinal ligament was divided in two groups,and the
27、 first group was treated with mechanical stress,and the second group was control group.And then,the respective total protein of two groups given two-dimensional gel electrophoresis,The result of 2-DE showed 34 differentially 机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究-11-expressed protein spots were selected,of
28、 which 4 proteins showed expression increased,and 30 protein spots show expression down.The largest percentage increase 1.58 times;the maximum reduction ration of 5.47 times.The all protein spots was used AMLDI-TOF/MS,and identified 15differentially expressed proteins successful,including 14 protein
29、s downregulation,and 1 protein upregulation.These proteins included metabolic enzymes,protein translation-related proteins,cytoskeletal proteins and other related proteins.Some proteins had something with the ossification of the cervical posterior longitudinal ligament.We picked the protein of vimen
30、tin which may play a key role in the process of ossification,western blotting and RNAi technique verified the hypothesis that vimentin may a very important role in the ossification of the cervical posterior longitudinal ligament.CONCLUSIONS Fibroblast of the cervical posterior longitudinal was cultu
31、red by tissue culture mothed.The expression of OCN,ALP,COLincreased after the induced stimulation of fibroblast by mechanical stress,which mean mechanical stress would acceleration the progression of ossification of the cervical posterior longitudinal.We found that the fibroblast of the cervical pos
32、terior longitudinal ligament occurred osteogenic differentiation and differential expression in lots of protein after induced mechanical stress,and we identified these protein and analysis the function of the protein by DIGE and mass spectrometry technique,and the technical proposal of the comparati
33、ve proteomics study in the pathogenesis of OPLL was established.Finally,the very important regulatory role of vimentin in cervical ossification of posterior longitudinal was found by RNAi technique.KEYWORDS Ossification of Posterior Longitudinal Ligament,Mechanical stress,2-dimensional electrophores
34、is,Mass spectrum,proteomics profiling 第二军医大学博士学位论文-12-词表词表 缩略词 英文全称 中文 OPLL Ossification of Posterior Longitudinal Ligament 后纵韧带骨化症 PMF Peptide mass fingerprint 肽质量指纹图谱 TRITC Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate罗丹明 OCN Osteocalcin 骨钙素 ALP Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶 Col I Collagen I I 型胶原 Tm 值 Meltin
35、g temperature 解链温度 shRNA Small hairpin RNA 小发卡 RNA RNAi RNA interfering RNA 干扰 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 RT Reversed transcriptation 逆转录 PCR Polymerase chain reaction 多聚酶链反应 cDNA Complementary DNA 互补 DNA DMEM Dulbeccos Modified Eagles Medium 杜氏改良 Eagle 培养基 EDTA Ethylene diamine tetraacetic aci
36、d 乙二胺四乙酸 Ep Eppendorf pipette 埃彭道夫吸管 ECM Extracellular matrix 细胞外基质 Vim Vimentin 波形蛋白 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 HE Hematoxylin-eosin 苏木素伊红 IGF Insulin-like growth factor 胰岛素样生长因子 缩略词 英文全称 中文 机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究-13-HRP Horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 Ln Laminin 层粘连蛋白 PAGE Polyacrylamide
37、gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PDGF Platelet derived growth factor isoforms 血小板来源生长因子 PI3K Phosphatidylinositol-3 kinase 磷脂酰肌醇-3 磷酸激酶 PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride 苯甲基磺酰氟 Rnase Ribonuclease 核糖核酸酶 WB Western Blotting 蛋白免疫印迹法 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠
38、 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 TBST Tris-buffered saline with 0.1%Tween20Tris 盐加 0.1%Tween20 TGF1 Transforming growth factor-1 转化生长因子 1 BMP2 Bone forming protein 2 骨形态形成蛋白 2 EF2 Elongation Factor 2 延伸因子 2 FAs Focal Adhesions 粘着斑 DLA Differential In-gel analysis 胶内差异分析 BVA Biological Variation Analysis 胶内
39、差异分析 DIGE Differential gel electrophorisis 差异凝胶电泳 MS Mass Spectrum 质谱 MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization 基质辅助激光解吸离子化 TOF Time Of Flight 飞行时间质量分析 LC/MS Liquid chromatography-Mass spectrum液相色谱串联质谱 第二军医大学博士学位论文-2-独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成
40、果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：日期：年 月 日 学位论文版权使用授权声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入中国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：日期：年 月 日 日期：年 月 日 第二
41、军医大学博士学位论文-14-第一章第一章 序论序论 颈椎后纵韧带骨化（ossification of cervical posterior longitudinal ligament,OPLL）是以颈椎后纵韧带异位骨化为特点的一种疾病，在骨化过程中常常伴随着脊髓和神经组织受压、损伤，导致患者出现四肢感觉运动及大小便功能障碍等临床症状，严重的影响患者的生活质量，给社会和家庭带来巨大的负担。该疾病在以日本为首的亚洲国家中具有较高发病率。日本学者报道该病在 30 岁以上人群中的总体发病率达到2%-41-2，国内尚无有关统计，但随着人均寿命的延长和影像诊断技术的不断进步，其发病率和确诊率呈逐年上升趋势
42、。近年来，世界各国尤其是东亚国家的发病率与发现率也日益增多。因而，临床函待深化对其发病机制的认识，以提高诊治水平。颈椎后纵韧带骨化的确切发病机制尚不完全清楚，但大多数学者都认为其发生和发展是遗传和环境多因素共同作用的结果。由于颈椎后纵韧带骨化尚无有效的药物治疗方法，缺乏早期诊断指标，而且由于 OPLL 的致瘫几率显著高于其他颈椎退变性疾病，发病隐匿、临床表现复杂，普通影像学检查不易发现病灶，易与其它脊柱脊髓疾患相混淆，误诊、漏诊时有发生3-4，给患者带来巨大的痛苦；且本病常有多个骨化灶、范围广泛，各节段骨化程度不一，难以判断其成熟度，因此手术治疗有盲目性大、治疗不彻底，效果较差等缺点，因此迫切
43、需要明确颈椎后纵韧带骨化的发病机制，找出其病理过程中起关键作用的相关蛋白和信号分子，阐明可能的分子机制，对于后纵韧带骨化症的诊断、研制针对其发病机制有效而可行的药物或基因治疗都有重要的指导意义。在颈椎后纵韧带骨化的发生和发展过程中，机械应力刺激是目前公认的一个局部环境因素。临床研究发现研究颈椎运动度与骨化进展快慢之间有密切关系：颈椎活动度大的患者骨化进展的速度相对较快5-6。Nakmura 等研究发现颈椎活动度越大的区域骨化的程度越严重，而且韧带骨化的进展与椎间盘局部异常应力分布密切相关，且骨化进展较快的区域通常发生在后纵韧带拉伸作用下的椎间盘变形区7-8。有学者在颈椎后纵韧带骨化患者术后的随
44、访期间也发现骨化的进展速度与颈椎活动度有关系，OPLL 患者行颈椎后路椎板切除或椎管成形术后骨化进展的速度较未手术患者明显加快，这是由于颈椎后部结构缺失，颈椎的稳定性下降，活动度增加导致的。随访发现骨化病灶平均每年横向增厚 0.3mm，纵向扩大 1mm，致使超过 10的患者再次出现脊髓压迫症状；而行前路融合内固定术的患者，因为病变节段已经融合，去除了颈椎节段不稳因素，所以骨化进展明显减慢或完全消失9-13。同时，机械应力刺激因素机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究-15-促进骨化的作用在动物实验得到进一步证实，研究发现大鼠尾端椎体行牵张应力刺激2 周后即发现大鼠近端椎
45、体韧带出现明显骨化倾向14。因此，可以肯定局部机械应力刺激是促进颈椎后纵韧带骨化发生、发展的一个极其重要的环境因素。近年来，国外部分学者开始进行体外牵张应力刺激和诱导颈椎后纵韧带成纤维细胞骨向分化的实验研究，以期探索机械应力促进颈椎 OPLL 发生、发展的致病机理。目前已有的研究表明，牵张应力确实可诱导来源于颈椎后纵韧带骨化患者的颈椎后纵韧带组织成纤维细胞发生骨向分化，细胞基质中骨钙素表达和碱性磷酸酶活性明显增高，而对于来源于非骨化患者的后纵韧带组织成纤维细胞却无相应作用。进一步研究发现，在韧带组织成纤维细胞的骨向分化过程中，多种细胞生长因子、信号转导蛋白和转录因子表达增高，包括骨形成蛋白（B
46、MP-2、BMP-4）、前列腺素 I2、血管内皮素（ET）以及 Cbfa1 等成骨特异转录因子，据此推测钙通道、腺嘌呤/单磷酸盐系统以及细胞分裂素表达激活是韧带组织细胞发生骨向分化可能的细胞内信号传导通路15-19。然而，后纵韧带组织成纤维细胞骨向分化过程是一个涉及多种细胞因子和功能蛋白表达的系统过程，而既往的研究均为采用针对单个基因或蛋白表达的研究模式，缺乏对多种蛋白表达的系统研究。已研究表明细胞内不同信号传导通路之间往往具有相互抑制或增强作用，抑制单个信号传导通路，难于达到阻断细胞骨向分化整个病理改变过程的目的；同时，某些蛋白质也可能参与多个细胞内信号传导通路，因此有必要全面、系统的研究细
47、胞骨向分化过程中多种蛋白质的表达差异，从而准确、全面地推断机械应力促进后纵韧带骨化的致病机制，并寻找可靠、有效的药物和基因治疗点。目前研究蛋白质功能所采用的方法，是通过检测 mRNA 的表达情况来间接反应蛋白质的表达情况，该方法的前提条件是细胞的 mRNA 水平反映了蛋白质的表达水平，具有一定的相关性。然而事实上，大量的研究发现组织细胞中的 mRNA 表达情况与蛋白质表达情况的相关性并不好，尤其是表达量低的蛋白质。而且蛋白质翻译后复杂的修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质与蛋白质的相互作用等则几乎无法从 mRNA 水平来判断。蛋白质组学（Proteomics）的概念自 20 世纪 90 年代
48、后期提出以后，作为后基因组学时代的研究工具，在蛋白质组表达、蛋白质功能研究中发挥越来越大的作用，对发现疾病标志物、药物靶点的确证等方面有着十分重要的意义。利用蛋白质组学的研究方法，使用双向电泳能够能够分离表达差异的蛋白质，能够大规模分析蛋白质，可以建立起相应的技术路线及蛋白质组数据的参考图。此外，通过对样本的预处理、特殊标记或电泳条件的控制，还可以对特定范围内的蛋白进行鉴定；并通过生物信息学分析，获得蛋白质水平上关于疾病发生过程的整体而全面的认识，分析多个细胞内信号传导途径在疾病发生过程中所起的作用，寻找起关键作用的基因和蛋白质表达，从而提供新的、有效的药物和基因治疗靶点20-23。第二军医大
49、学博士学位论文-16-荧光差异显示双向电泳(2D-DIGE)的定量蛋白质组学分析方法可以使样本间的差异蛋白质点显示更加容易、更加准确，可以发现更多表达差异的蛋白质点24-26。差异凝胶电泳(DIGE)是对 2-DE 在技术上的改进，该技术结合了多重荧光分析的方法，通过花青染料的荧光素蛋白质中的赖氨酸残基进行结合，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入内标的概念。两个相互比较的样品蛋白质使用不同的荧光染料染色，比如 cy2、cy3 或 cy5 荧光染料染色，然后进行 2-DE电泳。电泳凝胶图片经不同波长的激光激发后可获得不同颜色的图片，荧光染料信号可单独分离，根据每个点的
50、标记率来定量分析样本间各自点的影像27。因为每个蛋白质有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准。因此该技术方法极大的提高了结果的准确性、可靠性和重复性，保证了所检测到的蛋白质丰度变化是真实的。除此之外,在灵敏度方面，DIGE 可与对微量样本进行蛋白质组学分析，也可以检测到样品间10%的蛋白表达差异，统计学可信度达到95%28。目前，DIGE 技术已经成为具有较好应用前景的定量蛋白质组学的研究方法。近年来质谱技术已经在生命科学、生物医学、生物化学等领域得到广泛应用，为蛋白质组的分析鉴定提供了快速、准确、灵敏和高通量的检测方法，它已成为蛋白质组研究中主要的支撑技术。基