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1、分子克隆技术第一部分第一页，讲稿共八十七页哦将某载体上的水稻将某载体上的水稻DNA片段亚片段亚克隆到另一载体上克隆到另一载体上第一部分：分子克隆技术第一部分：分子克隆技术第二页，讲稿共八十七页哦第三页，讲稿共八十七页哦pUC19第四页，讲稿共八十七页哦pU1301第五页，讲稿共八十七页哦pU1301+1.5KB外源双酶切：BamHI+KpnI第六页，讲稿共八十七页哦1.1.两种载体的抽提两种载体的抽提2.2.琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量的质量3.3.两种载体的限制性内切酶消化两种载体的限制性内切酶消化4.4.目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化目的片段的回收及亚克隆载体的去
2、磷酸化5.5.载体与外源载体与外源DNA的连接的连接6.6.感受态细胞的制备感受态细胞的制备7.7.连接子转化感受态细胞连接子转化感受态细胞8.8.重组子筛选及鉴定重组子筛选及鉴定亚克隆的主要步骤亚克隆的主要步骤第七页，讲稿共八十七页哦质粒载体的提取质粒载体的提取第八页，讲稿共八十七页哦1.是是一一个个复复制制子子，载载体体在在受受体体细细胞胞中中能能大大量量繁繁殖殖，其其携携带带的的外外源源基因才能在受体细胞中得到大量扩增基因才能在受体细胞中得到大量扩增2.2.有有1 1到到多多个个限限制制内内切切酶酶的的单单一一识识别别 与与切切割割位位点点，便便于于外外源源基基因的插入因的插入3.3.具
3、具有有选选择择性性的的遗遗传传标标记记(如如抗抗生生素素抗抗性性标标记记等等)以以此此知知道道它它是是否否已已进进入入受受体体细细胞胞，并并据据此此标标记记将将携携带带载载体体的的细细胞胞从从其其他细胞中分离出来他细胞中分离出来载体必备条件载体必备条件第九页，讲稿共八十七页哦质质粒粒是是携携带带外外源源基基因因进进入入宿宿主主细细胞胞、扩扩增增或或表表达达外外源源基基因因的的主主要要载载体体，它它在在基基因因操操作作中中具具有有重重要要作作用用。质质粒粒的的分分离离与与提提取取是是最常用、最基本的实验技术。最常用、最基本的实验技术。第十页，讲稿共八十七页哦双双链链闭闭合合环环状状DNA分分子子
4、，具具有有自自主主复复制制和和转转录录能能力力，能能使使子子代代细细胞胞保保持持它它们们恒恒定定的的拷拷贝贝数数，可可表表达达它它所所携携带带的的遗遗传传信信息息。它它可可独独立立游游离离于于细细胞胞质质中中，也可整合到细菌染色体上。也可整合到细菌染色体上。质质粒粒在在细细胞胞内内的的复复制制可可分分为为严严谨谨型型（只只在在细细胞胞周周期期的的一一定定阶阶段段进进行行复复制制，一一个个细细胞胞内内只只有有1至至几几个个拷拷贝贝）和和松松弛弛型型（细细胞胞周周期期中中随随时时可可以以复复制制，拷拷贝贝数数较较多多，一般在细胞内有一般在细胞内有20个以上）个以上）质粒的基本特点质粒的基本特点第十
5、一页，讲稿共八十七页哦碱裂解法，碱裂解法，主要主要包括包括4个步骤：个步骤：1.1.细菌的培养：细菌的培养：从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期基中，培养至对数生长后期2.2.菌体的收集和裂解：菌体的收集和裂解：通过离心收集菌体，通过离心收集菌体，NaOH/SDS处理裂处理裂解细胞解细胞3.3.染色体染色体DNA、RNA 及其它杂质的去除：及其它杂质的去除：碱处理后用冰冷的碱处理后用冰冷的KAC 缓冲液处理后离心缓冲液处理后离心4.4.质粒的纯化及沉淀：质粒的纯化及沉淀：苯酚氯仿抽提，乙醇或异丙醇沉淀苯酚氯仿抽提，乙醇或异
6、丙醇沉淀质粒的提取质粒的提取第十二页，讲稿共八十七页哦Solution I:Tris.HCl（pH 7.5）50 mMEDTA 10 mMRNase A100 g/mlSolution II:NaOH 0.2 MSDS1%Solution III:Final concentrationKAC 1.32 MUsing HAC to adjust pH to 4.8TE(pH 8.0)：Tris.HCl（pH 8.0）10 mM EDTA （pH 8.0）1 mM苯酚苯酚/氯仿氯仿无水乙醇或异丙醇无水乙醇或异丙醇碱裂解法用到的试剂碱裂解法用到的试剂第十三页，讲稿共八十七页哦solution I s
7、olution I 重悬细菌重悬细菌solution solution IIII，其其中中的的SDSSDS破破坏坏细细胞胞壁壁、膜膜，使使细细胞胞内内容容物物释释放放出出来来，NaOH NaOH 使使DNADNA变变性性、碱碱基基对对打打开开，使使宿宿主主染染色色体体DNADNA双双链链分分开开，而而闭闭合合环环状状的的质质粒粒DNADNA处处于于拓拓扑缠绕状态，两个环并不分开扑缠绕状态，两个环并不分开试剂的作用（一）试剂的作用（一）第十四页，讲稿共八十七页哦Solution Solution III III 中中和和后后，宿宿主主DNADNA由由于于很很大大，碱碱基基还还未未来来得得及及配配
8、对对就就在在冰冰冷冷的的条条件件下下与与SDSSDS、蛋蛋白白质质、高高分分子子量量的的RNARNA等等缠缠绕绕在在一一起起沉沉淀淀下下来来，而而质质粒粒DNADNA由由于于很很小小且且双双链链未未分分开开，能能够够迅迅速速配配对对重重新新形形成成超超螺螺旋，处于溶解状态旋，处于溶解状态。试剂的作用（二）试剂的作用（二）第十五页，讲稿共八十七页哦试剂的作用（三）试剂的作用（三）1.苯酚/氯仿：纯化质粒，去除质粒溶液中残留的蛋白质等杂质；2.无水乙醇或95%乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNA3.TE 或H2O：溶解质粒DNA第十六页，讲稿共八十七页哦实验材料实验材料携带携带pUC19pUC19质粒载体
9、的质粒载体的大肠杆大肠杆菌菌液菌菌液携携带带含含有有水水稻稻DNADNA片片段段的的pU1301pU1301载载体体的的大大肠肠杆杆菌菌液。菌菌液。第十七页，讲稿共八十七页哦操作步骤操作步骤1.取取含含有有相相应应载载体体的的大大肠肠杆杆菌菌菌菌液液于于含含有有相相应应抗抗生生素素的的LA培培养养基基上上涂涂布布或或划划线线分分离离单单菌菌落落，37过过夜夜培养）；培养）；2.用用无无菌菌牙牙签签或或接接种种环环挑挑取取单单菌菌落落，接接种种于于含含有有相相应应抗抗生生素素的的LB培培养养基基中中，37摇摇床床250 r/min过夜培养过夜培养第十八页，讲稿共八十七页哦3.吸吸取取1.5 ml
10、菌菌液液，12000 g离离心心2钟钟，收收集集菌菌体体，倒倒掉掉上上清清；再再次次吸吸取取1.5 ml菌菌液液收收集集菌菌体体，尽尽量量将将菌菌液液倒倒干净；干净；4.加加入入300 l 溶溶液液I振振荡荡打打匀匀，重重新新悬悬浮浮细细胞胞，震震荡荡混混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；5.5.加入加入300 l 溶液溶液II，轻柔颠倒混匀轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一，放置至清亮，一般不超过般不超过5分钟（最好不超过分钟（最好不超过2 2分钟）；分钟）；6.加入加入300 l 溶液溶液III颠倒混匀，放置于冰上颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使分钟，使杂质充分
11、沉淀；杂质充分沉淀；第十九页，讲稿共八十七页哦7.12000 g离心离心10分钟；分钟；8.吸吸取取800 l 上上清清液液（注注意意：不不要要吸吸取取到到飘飘浮浮的的杂杂质质）至至另另一一个个1.5ml 离离心心管管中中，加加入入2/3体体积积的的异异丙丙醇醇，室温下放置室温下放置5分钟；分钟；9.12000 g 常温离心常温离心10分钟；分钟；10.弃弃上上清清，加加500 l 75乙乙醇醇，浸浸洗洗片片刻刻后后离离心心5分分钟钟（注意离心管的放置方向），弃上清；（注意离心管的放置方向），弃上清；11.加加40 l 灭菌超纯水或灭菌超纯水或TE溶解；溶解；12.12.质粒的质量检测，质粒的
12、质量检测，-20保存。保存。第二十页，讲稿共八十七页哦氨氨苄苄青青霉霉素素（ampicillin）：其主要是通过阻碍细胞壁的合成最终导致细胞的裂解。氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因（ampr）：合成-内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解(使用浓度100g/ml)卡卡那那霉霉素素（Kanamycin sulfate）：核糖体结合，抑制蛋白质的合成（使用浓度：50g/ml)RNaseA:C或U的3P与相邻的5OH处切开RNA。配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分钟，分装成小份储存于20。试验中用到的抗生素和酶试验中用到的抗生素和酶第二十一页，讲稿共八十七页哦1.1.
13、DNADNA纯纯度度：吸吸光光值值检检测测：检检测测260nm260nm、280nm280nm吸吸光光值值，紫紫外外分分光光光光度度计计A A260260/A/A280280=1.8=1.81.91.9；1.81.8最最佳佳，低低于于1.81.8说明有蛋白质，大于说明有蛋白质，大于1.81.8说明有说明有RNARNA。2.2.质质量量检检测测：琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳：一一般般有有一一至至三三条条带带（超超螺螺旋旋、线线型型、开开环环三三种种构构型型），点点样样孔孔附附近近无无DNADNA带带（无染色体（无染色体DNADNA污染）。污染）。质粒质粒DNA质量检测质量检测第二十二页，讲稿共八
14、十七页哦Hoechst33258:可与纳克级的DNA结合，而几乎没有RNA亲和性，激 发 波 长365nm，发 射 波 长460nm。0.1g/ml Hoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度，染料增加到1g/ml，分析范围可延至15g/ml，但会降低一定的灵敏度。缺点：更易于结合AT丰富区，对DNA组成敏感。EB:与DNA组成无关，但不如Hoechst33258敏感，且能结合RNA，激发波长302nm，发射波长590nm。3.DNA的定量的定量（1）荧光检测仪）荧光检测仪1 OD50 g/ml DS-DNA 或 1 OD 40 g/ml RNA or SSDNA（2.）分
15、光光度计分光光度计第二十三页，讲稿共八十七页哦DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。常用方法。第二十四页，讲稿共八十七页哦在在pHpH值为值为8.08.08.38.3时，核酸分子带负电，在电时，核酸分子带负
16、电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如中嵌入荧光染料（如EBEB）后，在紫外灯下可观察到核）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。酸片段所在的位置。实验原理：实验原理：第二十五页，讲稿共八十七页哦影响影响DNA迁移速率的因素迁移速率的因素 DNADNA分分
17、子子大大小小：迁迁移移速速率率U U与与logNlogN成成反反比比（N N为为碱碱基基对对数数目目）。分分子子大大小小相相等等，电电荷荷基基本本相相等等（DNADNA结结构构重重复复性性）。分分子子越越大，迁移越慢。大，迁移越慢。琼琼脂脂糖糖浓浓度度：logU=logUlogU=logU0 0-Kr-Kr 胶胶浓浓度度，U U为为迁迁移移率率，U U0 0 为为DNADNA的的自自由由电电泳泳迁迁移移率率，为为胶胶浓浓度度，KrKr为为介介质质阻阻滞滞系系数数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA DNA AgaroseAgarose：0.5%0.5%：1-30
18、 kb1-30 kb；0.7%0.7%：0.8-12 kb0.8-12 kb 1.2%1.2%：0.4-7 kb0.4-7 kb；1.5%1.5%：0.2-3 kb.0.2-3 kb.第二十六页，讲稿共八十七页哦DNADNA构构象象：一一般般迁迁移移速速率率超超螺螺旋旋环环状状 线线状状DNA DNA 开开环环；当当条条件件变变化化时时，情情况况会会相相反反，还还与与琼琼脂脂糖糖的的浓浓度度、电电流流强强度度、离离子子强强度度及及EBEB含量有关。含量有关。所所加加电电压压：低低电电压压时时，线线状状DNADNA片片段段的的迁迁移移速速率率与与所所加加电电压压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电
19、压不应超过成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm5V/cm碱基组成与温度碱基组成与温度：4-30 4-30 一般影响不大一般影响不大第二十七页，讲稿共八十七页哦嵌嵌入入染染料料的的存存在在：降降低低线线性性DNADNA迁迁移移率率，(不不提提倡倡加加在电泳液中在电泳液中)电泳缓冲液的组成及其离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度：影响影响DNADNA的迁移率，的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致大产热厉害，熔化凝胶并导致DNADNA变性，一般采变性，一般采用用1TAE1TAE，0.50.5或或1TBE
20、1TBE，1TPE1TPE（均含（均含EDTA EDTA pH8.0pH8.0）第二十八页，讲稿共八十七页哦实验步骤：实验步骤：1.1.将将洗洗净净、干干燥燥的的制制胶胶板板放放入入制制胶胶槽槽中中，水水平平放放置在工作台上；置在工作台上；2.2.配配制制0.8%0.8%的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶：称称取取0.24g0.24g琼琼脂脂糖糖于于30ml 30ml 0.5TBE0.5TBE中中，在在微微波波炉炉中中使使琼琼脂脂糖糖颗颗粒粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；完全溶解，冷却至温热时倒胶；3.3.凝胶凝固后，小心拔去梳子凝胶凝固后，小心拔去梳子第二十九页，讲稿共八十七页哦5.5.将将DNADNA
21、样样品品与与上上样样缓缓冲冲液液混混合合后后将将样样品品依依次次加加入入点样孔中；点样孔中；6.6.将将制制胶胶板板放放入入电电泳泳槽槽中中，加加入入电电泳泳缓缓冲冲液液，打打开开电电泳泳仪仪，将将电电压压调调至至不不高高于于5V/cm5V/cm，使使核核酸酸样样品品向向正正极极泳泳动动（注注意意点点样样孔孔在在电电泳泳槽槽的的负负极极一端）一端）；7.7.电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 0.5 g/mlg/ml的溴化乙锭（的溴化乙锭（EBEB）中浸泡）中浸泡101015 min15 min，在，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。紫外透射仪上观察
22、电泳结果并照相记录。第三十页，讲稿共八十七页哦电电泳泳指指示示剂剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。1.含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中2.含有电泳指示剂，以指示电泳的进程上样缓冲液：上样缓冲液：第三十一页，讲稿共八十七页哦EB：溴化乙锭，可嵌入DNA分子中，受紫外光激发而发出荧光，利用它可检测DNA。是诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时应注意防护。操作时应戴手套，尽量减少台面污染。1000贮存液(0.5mg/mL)
23、，使用时按1：1000稀释配制染色液。第三十二页，讲稿共八十七页哦质粒电泳检测：质粒电泳检测：一般有一至三条带（质粒一般有一至三条带（质粒DNA的三种构型）的三种构型）超螺旋超螺旋线型线型开环开环第三十三页，讲稿共八十七页哦质粒电泳检测质粒电泳检测第三十四页，讲稿共八十七页哦本科生试验图片第三十五页，讲稿共八十七页哦质粒载体的抽提，外源质粒载体的抽提，外源DNA的准备的准备琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量的质量亚克隆载体与外源亚克隆载体与外源DNA的限制性内切酶消化的限制性内切酶消化(目的片段的回收，亚克隆载体的去磷酸化目的片段的回收，亚克隆载体的去磷酸化)载体与外源载体与外源
24、DNA的连接的连接感受态细胞的制备感受态细胞的制备连接子转化感受态细胞连接子转化感受态细胞重组子的转化及筛选、鉴定重组子的转化及筛选、鉴定利用质粒克隆外源利用质粒克隆外源DNA片段的主要步骤片段的主要步骤第三十六页，讲稿共八十七页哦外源外源DNA克隆的要求克隆的要求特点特点不同的突出端不同的突出端用两种限制酶消化用两种限制酶消化后需纯化质粒以提后需纯化质粒以提高连接效率高连接效率一般酶切位点可保留一般酶切位点可保留,非重组克隆背景低非重组克隆背景低不需不需CIP处理处理外源外源DNA只以一个方向插入重组质粒中只以一个方向插入重组质粒中相同的突出端相同的突出端线状质粒线状质粒DNA常常需用磷酸酶
25、需用磷酸酶（CIP）处理）处理一般酶切位点常可保留一般酶切位点常可保留外源外源DNA会以两个方向插入会以两个方向插入重组质粒可带有外源重组质粒可带有外源DNA的串联拷贝的串联拷贝末端为平端末端为平端要求较高的要求较高的DNA及连接酶及连接酶不同酶切的平头可连接不同酶切的平头可连接非重组克隆的背景高非重组克隆的背景高质粒及外源质粒及外源DNA连接处的酶切位点消失连接处的酶切位点消失（不同平端酶）（不同平端酶）重组质粒可能带有外源重组质粒可能带有外源DNA的串联拷贝的串联拷贝第三十七页，讲稿共八十七页哦1.载体及外源片段的限制酶消化:限制性内切酶切出相互匹配的粘性末端（一种酶）或不相匹配的粘性末端
26、（不同酶消化）或平端；2.载体的去磷酸化:碱性磷酸酶去除载体的5P基团，以防载体自连；3.线状载体与外源片段的连接:连接酶使双链DNA 5P与相邻的3OH之间形成新的共价键，若质粒载体的两条链都带有5磷酸基团，则可形成4个新的磷酸二酯键，但如质粒已去磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，且产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂合体导入到感受态细胞后可被修复。第三十八页，讲稿共八十七页哦限制性内切酶限制性内切酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶连接酶连接酶几种工具酶几种工具酶第三十九页，讲稿共八十七页哦有有特特定定的的识识别别序序列列，通通常常为为46碱碱基基的的回回文文对对称称序序列。列。切切割割位位点点
27、位位于于识识别别序序列列内内的的固固定定位位置置上上，切切割割后后在在5末端有磷酸基团，末端有磷酸基团，3末端有羟基。末端有羟基。切切割割后后形形成成粘粘性性末末端端或或平平末末端端，前前者者又又分分为为3突突出端（如出端（如PstI）和）和5突出端突出端(如如EcoRI)两种两种其活性发挥只需其活性发挥只需Mg2作辅酶。作辅酶。II类限制性内切酶的特点类限制性内切酶的特点第四十页，讲稿共八十七页哦限限制制酶酶的的一一个个活活性性单单位位（1U）：原原则则上上指指在在50l 反反应应体体系系中中，37下下，经经过过1小小时时的的反反应应将将1 g 的的DNA完全分解所需要的酶量。完全分解所需要
28、的酶量。限限制制酶酶的的star活活性性：限限制制酶酶在在极极端端非非标标准准条条件件下下使使用用时时对对底底物物DNA的的特特异异性性可可能能降降低低，即即可可将将与与原原来来识识别别的的特特定定DNA序序列列不不同同的的碱碱基基序序列列切切断断，这这种种现现象象叫叫限限制制酶酶的的star活活性性。它它的的出出现现的的频频率率与与酶酶、底底物物及及反应条件有关。反应条件有关。第四十一页，讲稿共八十七页哦高浓度的甘油（高浓度的甘油（55）；）；酶过量（酶过量（100U/ug100U/ug）；）；低离子强度（低离子强度（25mMpH8.0)pH(pH8.0)；有机溶剂（有机溶剂（DMSODMS
29、O，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二价阳离子代替用其他二价阳离子代替MgMg2+2+(Mn(Mn2+2+,Cu,Cu2+2+,Co,Co2+2+,Zn,Zn2+2+)不同的酶对上述因素的敏感程度不同不同的酶对上述因素的敏感程度不同引起星星活性的主要因素：引起星星活性的主要因素：第四十二页，讲稿共八十七页哦氯化镁、氯化钠氯化镁、氯化钠/钾、钾、TrisTris盐酸盐、盐酸盐、巯基乙醇或二硫苏糖醇（巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTTDTT）牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSABSA）典型的限制性内切酶作用的典型的限制性内切酶作用的缓冲体系缓冲体系成分包括：成分包括：第四十
30、三页，讲稿共八十七页哦BamH I：GGATT CC CTAAGKpn I:G GTACCCCATG G 第四十四页，讲稿共八十七页哦含外源含外源DNA片段的片段的载体载体(M812)（50 l反应体系，用反应体系，用1.5ml tube，冰上操作），冰上操作）质粒质粒 DNA 30 lBamH I(10u/l)1 lKpn I(10u/l)1 l 10buffer5 lddH2O13 l分别取分别取5 l 酶切产物酶切产物用用0.80.81.2%凝胶检测酶切效果凝胶检测酶切效果 50 lTotal目的目的 载体（载体（Puc19)的限制性内切酶消化的限制性内切酶消化第四十五页，讲稿共八十七页
31、哦电泳检测1.Marker2.pUC19质粒对照3.pUC19 质粒酶切产物4.M812 质粒对照5.M812 质粒酶切产物点样顺序：第四十六页，讲稿共八十七页哦2011本科生酶切图片lane1-4,pUC19酶切产物Lane5,pUC19质粒Lane6，M812质粒Lane7-10,M812 酶切产物Lane11,DL-2000 marker,1 11第四十七页，讲稿共八十七页哦造成造成DNA酶切不完全的主要原因有：酶切不完全的主要原因有：DNA不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；操作不当，酶或操作不当，酶或DNA加至管壁上，反应体系没完全混合；加至管壁上，反
32、应体系没完全混合；反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适；反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适；酶的活力不够酶的活力不够第四十八页，讲稿共八十七页哦DNA样品中抑制酶活的污染物主要有：DNA 样品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性解决办法：1.增加酶作用的单位数（10-20U/g DNA)2.增大反应体积以稀释可能的抑制剂3.延长反应时间4.消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5m mol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物。5.纯化DNA第四十九页，讲稿共八十七页哦酶切反应的终止酶切反应的终止1.加入终农度为12.5
33、m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应2.多数酶在65C 10分钟可被不可逆灭活，少数65C不失活的酶在75 C 15分钟也能失活3.若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化第五十页，讲稿共八十七页哦pUC19酶切产物的纯化：酶切产物的纯化：加加入入ddH2O 150 l（扩扩大大体体积积），加加入入200200l l氯氯仿仿/异异戊戊醇醇（24:1），颠倒混匀后离心），颠倒混匀后离心10 min；吸吸出出上上清清，加加1/10体体积积3M NaAc和和两两倍倍体体积积乙乙醇醇，-20放放置置15分钟以上；分钟以上；12000 rpm 4冷冻离心冷冻离心15分钟；分钟；倒去上
34、清，用倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后溶于乙醇浸洗沉淀，风干后溶于10 l ddH2O；第五十一页，讲稿共八十七页哦氯氯仿仿对对眼眼睛睛、皮皮肤肤、粘粘膜膜及及呼呼吸吸道道都都有有刺刺激激作作用用，它它是是致致癌癌剂剂并并可可损损伤伤肝肝脏脏和和肾肾脏脏，操操作作时时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯苯酚酚是是强强腐腐蚀蚀剂剂，能能引引起起严严重重烧烧伤伤。操操作作时时应应戴戴手手套套、安安全全镜镜、穿穿防防护护服服，并并在在通通风风橱橱中中进进行。行。注意注意第五十二页，讲稿共八十七页哦当一个体系中有多种DNA分子，而我们只需要其中的某种DNA 时或者
35、反应体系中含有目的DNA 子以外的其它分子如各种工具酶、dNTPs、引物及矿物油等时，可以利用凝胶电泳分离各种DNA，然后挖胶回收目的DNA 带。回收方法主要有：1.低熔点琼脂糖 2.透析带电洗脱法 3.glass milk 纯化 4.柱回收试剂盒DNA的回收纯化：第五十三页，讲稿共八十七页哦柱式DNA胶回收试剂盒操作步骤：1.通过琼脂糖凝胶将目的通过琼脂糖凝胶将目的DNA 带与载体带分开；带与载体带分开；2.紫外灯下用干净的刀片切下含目的紫外灯下用干净的刀片切下含目的DNA 带的胶块放入带的胶块放入1.5ml离心管中；离心管中；（注意：不含DNA 的胶尽可能切除，在长波长的紫外灯下切胶，并尽
36、量缩短DNA 暴露在紫外光下的时间）3.按按400l/100mg 胶的比例加入胶的比例加入Binding Buffer II,50-60C 水浴中水浴中10分分钟钟，使胶融化，使胶融化，每每2-3分钟混匀一次；分钟混匀一次；（注意若胶的浓度较大需增加Binding Buffer II 的比例、增加融胶的时间，若胶块体积较大也需增加融胶的时间）4.将融化的胶溶液转移到套放在将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的收集管内的UNIQ-10 柱中，放置柱中，放置2分钟，分钟，8000rpm离心离心1分钟；分钟；第五十四页，讲稿共八十七页哦5.取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-
37、10 柱放入同一个收集管内，加入500l Wash Solution,8000rpm 室温离心1分钟；6.重复5步一次，7.取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内，12000rpm 室温离心15秒；8.将UNIQ-10 柱放入一个新的1.5ml 离心管内，在柱子膜中央加40l Elution Buffer 或水（pH7.0），室温或37C 放置2分钟；（提高洗脱温度到55C-80C有利于提高DNA 的洗脱效率）9.12000rpm室温离心1分钟，离心管中的溶液即为回收的DNA 片段第五十五页，讲稿共八十七页哦注意1.首次使用前，必须在Wash Sol
38、ution 中加入4倍体积的无水乙醇，充分摇匀后使用，每次使用后将瓶盖拧紧，以保持Wash Solution 中的乙醇含量。2.Elution Buffer 为2.0mmol/L Tris-HCl,pH8.5.4C保存。也可用PH8.0 的TE 或PH7.0 的水代替。第五十六页，讲稿共八十七页哦载体去磷酸化载体去磷酸化第五十七页，讲稿共八十七页哦细细菌菌碱碱性性磷磷酸酸酶酶（BAPBAP）,牛牛小小肠肠碱碱性性磷磷酸酸酶酶（CIAPCIAP）以以及及小小虾虾碱碱性性磷磷酸酸酶酶（SAPSAP）都都能能催催化化磷磷酸酸单单脂脂键键的的水水解解（包包括括DNADNA、RNARNA、dNTPdNT
39、P和和NTPNTP上上的的5 5磷磷酸酸残残基基），不不能能催化磷酸三脂的水解。催化磷酸三脂的水解。比比较较而而言言，CIAPCIAP的的活活性性比比BAPBAP的的高高10102020倍倍,CIAP,CIAP经经加加热热处处理理，容容易易失失活活但但不不能能完完全全失失活活,若若要要使使酶酶完完全全失失活活，不不论论是是BAPBAP还还是是CIAPCIAP还还需需要要经经苯苯酚酚处处理理。而而SAPSAP经经6565C C 加加热热1515分分钟钟就可完全失活。就可完全失活。活活性性定定义义：在在37 37 C C、pH9.8pH9.8的的条条件件下下，1 1分分钟钟内内水水解解对对硝硝基基
40、苯苯磷磷酸酸盐盐（-nitrophenyl-nitrophenyl phosphate)phosphate)生生成成1M1M的的对对硝硝基基苯苯(-nitrophenol)(-nitrophenol)所需的酶量定义为所需的酶量定义为1 1个活性单位（个活性单位（U U）.碱性磷酸酶碱性磷酸酶第五十八页，讲稿共八十七页哦载体去磷酸化反应体系：载体去磷酸化反应体系：DNA20 lCIAP（TaKaRa）0.5 l10 buffer4.0 lddH2O15.5 l 37 或或50反应反应30 min 以上以上 Total 40 l 第五十九页，讲稿共八十七页哦去磷酸化载体的纯化去磷酸化载体的纯化加加
41、0.4 0.4 l 0.5M的的EDTA（终终浓浓度度5mM)，7575水水浴浴10 10 min,min,使使CIAPCIAP失活；失活；加加入入ddH2O 150 l（扩扩大大体体积积），加加入入等等体体积积苯苯酚酚/氯氯仿仿/异异戊戊醇醇（25:25:24:1），颠倒混匀后离心），颠倒混匀后离心10 min；吸吸出出上上清清，加加1/10体体积积3M NaAc和和两两倍倍体体积积乙乙醇醇，-20放放置置15分分钟以上；钟以上；12000 rpm 4冷冻离心冷冻离心15分钟；分钟；倒去上清，用倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后溶于乙醇浸洗沉淀，风干后溶于10 l ddH2O（0.5ml
42、tube中）中）第六十页，讲稿共八十七页哦载体与外源载体与外源DNA片段的连接片段的连接第六十一页，讲稿共八十七页哦连接酶使双链DNA 5P与相邻的3OH之间形成新的共价键，若质粒载体的两条链都带有5磷酸基团，则可形成4个新的磷酸二酯键，但如质粒已去磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，且产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂合体导入到感受态细胞后可被修复。第六十二页，讲稿共八十七页哦大肠杆菌连接酶大肠杆菌连接酶T4噬菌体连接酶。噬菌体连接酶。连接酶连接酶第六十三页，讲稿共八十七页哦各种连接酶特性的比较：各种连接酶特性的比较：T4DNA Ligase E.coli DNA LigaseT4
43、RNA LigaseLigases of thermophilic bacteria最适最适pH辅酶辅酶7.2-7.8ATP7.5-8.0NAD7.2-8.4ATPNAD平滑末端平滑末端可能可能*不能不能NODNA 5P末末端端和和RNA 3OH末端末端可能可能可能可能不能不能NORNA 5P末末端端和和DNA 3OH末端末端可能可能不能不能不能不能NORNA和和RNA少数少数 可能可能不能不能可能可能NO第六十四页，讲稿共八十七页哦外源DNA4 l目的载体DNA 4 l10 buffer1 lT4 ligase(1U/l)1 l 连接反应体系：连接反应体系：16 C 水浴保温过夜水浴保温过夜
44、Total 10 l第六十五页，讲稿共八十七页哦感受态细胞的制备及质粒的转化感受态细胞的制备及质粒的转化转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。方法筛选和鉴定目的克隆。第六十六页，讲稿共八十七页哦感受态细胞的制备感受态细胞的制备体外连接的体外连接的DNADNA重组分子导入合适的受体重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源细胞
45、才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNADNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和于感受态。目前主要采用电转化法和CaClCaCl2 2法将法将外源外源DNADNA导入受体细胞中，因此需要相应地制备电导入受体细胞中，因此需要相应地制备电转化感受态细胞和转化感受态细胞和CaClCaCl2 2感受态细胞。感受态细胞。第六十七页，讲稿共八十七页哦将外源将外源DNA导入大肠杆菌主要有两种方法：导入大肠杆菌主要有两种方法：CaCl2法法：利利用用冰冰冷
46、冷的的CaCl2处处理理对对数数生生长长期期的的细细胞胞，可可以以诱诱导导其其产产生生短短暂暂的的“感感受受态态”，易易于于摄摄取取外外源源DNA。106 107转化子转化子/g DNA。电电转转化化法法：利利用用瞬瞬间间高高压压在在细细胞胞上上打打孔孔。因因而而需需用用冰冰冷冷的的超超纯纯水水多多次次洗洗涤涤处处于于对对数数生生长长前前期期的的细细胞胞，以以使使细细胞胞悬悬浮浮液液中中应应含含有有尽尽量量少少的的导导电电离离子子。1091010 转化子转化子/g DNA；第六十八页，讲稿共八十七页哦1.所有操作均应在无菌条件和冰上进行；所有操作均应在无菌条件和冰上进行；2.所所使使用用的的器
47、器皿皿必必须须干干净净。迹迹量量的的去去污污剂剂或或其其它它化化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。操作注意事项操作注意事项第六十九页，讲稿共八十七页哦1.1.前前夜夜接接种种受受体体菌菌（DH5），挑挑取取单单菌菌落落于于LB培培养养基基中中37摇摇床培养过夜（约床培养过夜（约16小时）；小时）；2.2.取取1ml过过夜夜培培养养物物于于100ml添添加加有有20mM MgCl2的的LB培培养养基基中中，在在37摇床上剧烈振荡培养约摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（小时（300rpm）；）；3.3.将将0.1M CaCl2溶溶液液置置于于冰冰上上预
48、预冷冷；以以下下步步骤骤需需在在超超净净工工作作台台和和冰冰上上操作操作4.4.吸取吸取1.5ml培养好的菌液至培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却离心管中，在冰上冷却10分钟；分钟；CaCl2感受态细胞的制备（一）感受态细胞的制备（一）第七十页，讲稿共八十七页哦5.5.44下下4000rpm4000rpm冷冻离心冷冻离心1010分钟；分钟；6.6.弃弃去去上上清清，加加入入100100 l l预预冷冷0.1M 0.1M CaClCaCl2 2溶溶液液，用用移移液液枪枪轻轻轻轻上上下下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置2020分钟；分钟；7.7.44下
49、下4000 rpm4000 rpm冷冻离心冷冻离心1010分钟；分钟；8.弃弃去去上上清清，加加入入100 l预预冷冷0.1M CaCl2溶溶液液，用用移移液液枪枪轻轻轻轻上上下下吸吸动打匀，使细胞重新悬浮，动打匀，使细胞重新悬浮，4下下4000 rpm冷冻离心冷冻离心10分钟；分钟；9.9.弃弃去去上上清清，加加入入2020 l l预预冷冷0.1M 0.1M CaClCaCl2 2溶溶液液，用用移移液液枪枪轻轻轻轻上上下下吸吸动打匀，使细胞重新悬浮；动打匀，使细胞重新悬浮；10.10.细细胞胞悬悬浮浮液液可可立立即即用用于于转转化化实实验验,48,48小小时时内内使使用用，可可以以暂暂时时保
50、保存存在在4.长长时时间间保保存存，需需添添加加冷冷冻冻保保护护剂剂（15%15%20%20%甘甘油油）后后超超低低温温冷冷冻贮存备用（冻贮存备用（7070）。）。CaCl2感受态细胞的制备（二）感受态细胞的制备（二）第七十一页，讲稿共八十七页哦操作注意事项操作注意事项1.1.密密切切注注视视细细菌菌的的生生长长状状态态和和密密度度，尽尽量量使使用用对对数数生生长长期期的的细细胞胞（一一般般通通过过检检测测ODOD600600来来控控制制。DH5DH5 菌株菌株ODOD600600为为0.50.5时细胞密度是时细胞密度是5105107 7/ml/ml）；）；2.2.所有操作均应在无菌条件和冰上