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1、第三章生物物证常见技术本讲稿第一页，共四十四页第一节第一节 电泳技术电泳技术电泳是指在电场中的带电粒子向电泳是指在电场中的带电粒子向电性相反方向发生位移的现象。是蛋白电性相反方向发生位移的现象。是蛋白质、核酸分析鉴定的主要技术之一。质、核酸分析鉴定的主要技术之一。本讲稿第二页，共四十四页电泳原理电泳原理 在同一电泳条件下，不同带电颗粒因其分子大小和带电量的不同具有不同的泳动速度。因此电泳一定时间，就能相互分开。本讲稿第三页，共四十四页电泳的分类电泳的分类 v自由界面电泳：电泳可以直接将样品放在缓冲液中进行。v区 带 电 泳：将样品放在固体支持物上进行电泳，因待测样品各组分的泳动率不同被分离成不
2、同的区带。本讲稿第四页，共四十四页区带电泳分类区带电泳分类v（一）据电场强度分：（一）据电场强度分：高压；常压；低压高压；常压；低压。v（二）据支持物种类分：滤纸；醋酸纤维薄膜；（二）据支持物种类分：滤纸；醋酸纤维薄膜；琼脂糖凝胶；聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶；聚丙烯酰胺凝胶。v（三）据支持物形状分：水平板；垂直板；（三）据支持物形状分：水平板；垂直板；柱状；圆盘；柱状；圆盘；U U 形管；毛细管。形管；毛细管。v（四）据原理分（四）据原理分 ：等速；免疫；等电聚焦。：等速；免疫；等电聚焦。v（五）据方向分（五）据方向分 ：单向；双向。：单向；双向。v（六）据目的分：分析；制备。（六）据目的分：
3、分析；制备。v（七）据缓冲液（七）据缓冲液 pH pH 分分 ：连续：连续 pH pH；非连续；非连续 pHpH。本讲稿第五页，共四十四页电泳槽电泳槽电泳仪本讲稿第六页，共四十四页本讲稿第七页，共四十四页本讲稿第八页，共四十四页电泳步骤电泳步骤v电泳的一般操作程序包括支持物的准备、加电泳的一般操作程序包括支持物的准备、加样、电泳、固定、染色、脱色、定性观察及样、电泳、固定、染色、脱色、定性观察及定量测定等过程。定量测定等过程。请观看视频请观看视频本讲稿第九页，共四十四页v1、高压电极槽与进样机构 2、填灌清洗机构 3、毛细管 4、检测器 5、铂丝电极 6、低压电极槽 7、恒温机构 8、记录/数
4、据处理 本讲稿第十页，共四十四页本讲稿第十一页，共四十四页第二节第二节 层析法层析法 所有的层析系统都由两个相组成：一是所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。当待分离的混合物固定相，另一是流动相。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。分部收各组分不断地在两相中进行
5、再分配。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。从而达到将各组分分离的目的。本讲稿第十二页，共四十四页本讲稿第十三页，共四十四页本讲稿第十四页，共四十四页层析操作层析操作本讲稿第十五页，共四十四页本讲稿第十六页，共四十四页本讲稿第十七页，共四十四页本讲稿第十八页，共四十四页本讲稿第十九页，共四十四页本讲稿第二十页，共四十四页第三节第三节比色技术比色技术v分光光度法是通过测定被测物质在特分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和度或发光强
6、度，对该物质进行定性和定量分析的方法。定量分析的方法。本讲稿第二十一页，共四十四页比色技术分类比色技术分类v光谱分析技术可分为发射光谱、吸收光谱和光谱分析技术可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱三大类。基于发射光谱分析的方法散射光谱三大类。基于发射光谱分析的方法有火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱有火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法，基于吸收光谱分析的方法有紫外法，基于吸收光谱分析的方法有紫外-可见可见光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光谱法；基于散射光谱分析的方法有比浊法。光谱法；基于散射光谱分析的方法有比浊法。本讲稿第二十二页，共四十四页vA=
7、abcv式中式中A为吸光度，为吸光度，b为溶液层厚度（为溶液层厚度（cm），），c为溶液的浓度（为溶液的浓度（g/dm3)，a为吸光系数。为吸光系数。v当固定溶液层厚度当固定溶液层厚度l和吸光系数和吸光系数a时，吸光度时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。与溶液的浓度成线性关系。本讲稿第二十三页，共四十四页比色仪器比色仪器v紫外分光光度计，可见分光光度计（或紫外分光光度计，可见分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。光光度计。本讲稿第二十四页，共四十四页722本讲稿第二十五页，共四十四页第四节第四节离心技术离心技术v离心技术是实验室常采用的
8、技术，主要离心技术是实验室常采用的技术，主要是利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速是利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分沉降，借以分离比重不同的各种物质成分的方法。的方法。本讲稿第二十六页，共四十四页vF重力浮力重力浮力VPgVgVg（p）v式中式中:vF下沉力；下沉力；vV微粒体积；微粒体积；vP微粒密度；微粒密度；v介质密度；介质密度；vg重力加速度。重力加速度。v当当P时，微粒下沉；时，微粒下沉；P与与差值差值越大，微粒下沉速度越快。因此，加大离心越大，微粒下沉速度越快。因此，加大离心机转速可加快离心微粒的沉降速度机转速可加快离心微粒的沉降速度本讲稿第二十
9、七页，共四十四页离心机分类离心机分类v（一）根据转速 分类v1、常速离心机：转速少于 5000r/min，用于一般液体可沉淀颗粒的分离，或制备一般的组织匀浆。v2、高速离心机：转速 5000-25000r/min，用于细胞器的分离和生物大分子的制备。v3、超速离心机：转速超过 25000-85000r/min，多用于亚细胞结构的分离和生物大分子的制备。v本讲稿第二十八页，共四十四页v（二）根据温度 分类v1、常温离心机：室温（25 ）下工作。常速离心时使用。v2、低温离心机：在 4 下工作。高速离心时使用。v3、冷冻离心机：在 0 25 工作。超速离心时使用。本讲稿第二十九页，共四十四页v（三
10、）根据体积大小和放置方式分类（三）根据体积大小和放置方式分类1 1、台式离心机：体积小，放在操作台上，用、台式离心机：体积小，放在操作台上，用于微量物质的提取。于微量物质的提取。2 2、落地式离心机：体积大，放在地面上，用、落地式离心机：体积大，放在地面上，用于大量物质的提取。于大量物质的提取。本讲稿第三十页，共四十四页v（四）根据供能方式（四）根据供能方式 分类分类1 1、自动式离心机：设置程序后，电脑程序控、自动式离心机：设置程序后，电脑程序控制离心速度和时间。制离心速度和时间。2 2、电动式离心机：由操作者接通电源、电动式离心机：由操作者接通电源、利用旋钮控制离心速度和时间的离心机。利用
11、旋钮控制离心速度和时间的离心机。3 3、手动式离心机：、手动式离心机：本讲稿第三十一页，共四十四页第五节显微镜技术本讲稿第三十二页，共四十四页一、发明一、发明 最早的显微镜是16世纪末期在荷兰制造出来的。发明者可能是札恰里亚斯詹森（眼镜商）或汉斯利珀希（科学家），他们用两片透镜制作了简易的显微镜，但并没有用于观察。第一个使用者是伽利略。第二个是荷兰商人安东尼凡列文虎克。1931年，恩斯特鲁斯卡研制了电子显微镜，1986年他被授予诺贝尔奖。本讲稿第三十三页，共四十四页二、分类二、分类（一）（一）光学显微镜光学显微镜：通常皆由光学部分、照明部分和机械部：通常皆由光学部分、照明部分和机械部分组成。目
12、前光学显微镜主要有分组成。目前光学显微镜主要有明视野显微镜明视野显微镜（普通光学（普通光学显微镜）、显微镜）、暗视野显微镜暗视野显微镜、荧光显微镜荧光显微镜、相差显微镜相差显微镜、激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜、偏光显微镜偏光显微镜、微分干涉差显微微分干涉差显微镜镜、倒置显微镜倒置显微镜。（二）电子（二）电子显微镜显微镜：有与光学显微镜相似的基本结构特征，：有与光学显微镜相似的基本结构特征，但它将电子流作为一种新的光源，使物体成像。可把物体但它将电子流作为一种新的光源，使物体成像。可把物体放大到放大到200万倍。种类有万倍。种类有扫描电镜扫描电镜、分析电镜、超高压、分析电镜、超高压电
13、镜等。电镜等。本讲稿第三十四页，共四十四页三、显微镜的使用方法三、显微镜的使用方法v1.对光：对光：（1）将低倍镜转至镜筒下方与镜筒成一直线。）将低倍镜转至镜筒下方与镜筒成一直线。（2）拨动反光镜，调节至视野最亮无阴影。反光镜有平、）拨动反光镜，调节至视野最亮无阴影。反光镜有平、凹两面，光源强时用平面，较暗时用凹面，需要强光时，凹两面，光源强时用平面，较暗时用凹面，需要强光时，将聚光器提高，光圈放大；需要弱光时，将聚光器降低，将聚光器提高，光圈放大；需要弱光时，将聚光器降低，或光圈适当缩小。或光圈适当缩小。（3）将待观察的标本置载物台上，转动粗调节器使镜筒）将待观察的标本置载物台上，转动粗调节
14、器使镜筒下降至接物镜接近标本。于转动粗调节器的同时，须俯下降至接物镜接近标本。于转动粗调节器的同时，须俯身在镜旁仔细观察接物镜与标本之间的距离。身在镜旁仔细观察接物镜与标本之间的距离。（4）左眼于接目镜观察，同时左手转动粗调节，使镜筒）左眼于接目镜观察，同时左手转动粗调节，使镜筒徐徐上升以调节焦距，使视野内的物象看到上时即停，徐徐上升以调节焦距，使视野内的物象看到上时即停，再调微调节器，至标本清晰为止。再调微调节器，至标本清晰为止。本讲稿第三十五页，共四十四页v2接物镜的使用及光线的调节：接物镜的使用及光线的调节：显微镜一般具有三个接物镜，即低倍、显微镜一般具有三个接物镜，即低倍、高倍及油镜，
15、固定于接物镜转换盘孔中。观高倍及油镜，固定于接物镜转换盘孔中。观察标本时，察标本时，先先使用使用低倍低倍接物镜，此时，视野接物镜，此时，视野较大，标本较易查出，但放大倍数较小。较大，标本较易查出，但放大倍数较小。后后高倍高倍接物镜放大的倍数较大，能观察微小的接物镜放大的倍数较大，能观察微小的物体或结构。物体或结构。再再使用使用油镜油镜观察，一般加一观察，一般加一滴油后直接将油镜头浸入油滴中进行镜检滴油后直接将油镜头浸入油滴中进行镜检观察。观察。本讲稿第三十六页，共四十四页v3低倍、高倍、油镜头的识别：（1）标明放大倍数10，40，100，或10/0.25，40/0.65，100/1.30。（2
16、）低倍镜最短，高倍镜较长，油镜最长。（3）镜头前面的镜孔低倍镜最大，高倍镜较大，油镜最小。（4）油镜头上常刻有黑色环圈，或“油”字。本讲稿第三十七页，共四十四页v4（1）光线对好后，移动推进器寻找需要观察）光线对好后，移动推进器寻找需要观察的标本。的标本。（2）如标本的体积较大，不能清楚查见其）如标本的体积较大，不能清楚查见其构造因而不能确认时，则将标本移至视野构造因而不能确认时，则将标本移至视野中央，再旋转高倍接物镜于镜筒下方。中央，再旋转高倍接物镜于镜筒下方。（3）旋转微调节器至物象清晰为止。）旋转微调节器至物象清晰为止。（4）调节聚光器及光圈，使视野内的物象达）调节聚光器及光圈，使视野内
17、的物象达到最清晰的程度。到最清晰的程度。本讲稿第三十八页，共四十四页v5油镜的使用方法：油镜的使用方法：（1）原理：）原理：v油镜的透气孔最小，这样进入的光线就少，油镜的透气孔最小，这样进入的光线就少，物体不易看清楚。物体不易看清楚。v同时又因自玻片透过的光线，由于发生了折同时又因自玻片透过的光线，由于发生了折射散光，因此射入镜头的光线就更少，物体射散光，因此射入镜头的光线就更少，物体更看不清楚。更看不清楚。v采用一种采用一种和玻片折光率相接近的介质如香柏和玻片折光率相接近的介质如香柏油油，加于标本与玻片之间，使光线不通过空，加于标本与玻片之间，使光线不通过空气，这样射入镜头的光线就较多，物象
18、就看气，这样射入镜头的光线就较多，物象就看得清楚。得清楚。本讲稿第三十九页，共四十四页v（2）油镜的使用：）油镜的使用：a将光线调至最强（聚光器提高，光圈开将光线调至最强（聚光器提高，光圈开放）。放）。b转粗调节器使镜筒上升，滴香柏油转粗调节器使镜筒上升，滴香柏油1小滴小滴于接物镜正下方标本上。于接物镜正下方标本上。c转动接物镜转换盘，使油镜头于镜筒下转动接物镜转换盘，使油镜头于镜筒下方。方。d俯身镜旁侧面在肉眼的观察下，转动粗调俯身镜旁侧面在肉眼的观察下，转动粗调节器使油镜头徐徐下降浸入香柏油内，轻轻节器使油镜头徐徐下降浸入香柏油内，轻轻接触玻片为止。接触玻片为止。本讲稿第四十页，共四十四页
19、e慢慢转动粗调节器，使油镜头徐徐上升至慢慢转动粗调节器，使油镜头徐徐上升至见到标本的物象为止。见到标本的物象为止。f转动微调节器，使视野物象达到最清的程转动微调节器，使视野物象达到最清的程度。度。g左手徐徐移动推进器，并转动微调节器左手徐徐移动推进器，并转动微调节器以观察标本。以观察标本。h标本观察完毕后，转动粗调节器将镜筒升标本观察完毕后，转动粗调节器将镜筒升起，取下标本玻片。立即用擦镜纸将镜头上起，取下标本玻片。立即用擦镜纸将镜头上的香柏油擦净。的香柏油擦净。本讲稿第四十一页，共四十四页v6注意事项：注意事项：（1）使用显微镜之前，应熟悉显微镜的各部名）使用显微镜之前，应熟悉显微镜的各部名
20、称及使用方法，特别应掌握识别三种接物镜称及使用方法，特别应掌握识别三种接物镜之特征。之特征。（2）观察无色和颜色较浅的标本时，必须注意）观察无色和颜色较浅的标本时，必须注意光线的调节。光线的调节。（3）新鲜标本观察时，须加盖玻片，以免）新鲜标本观察时，须加盖玻片，以免标本因蒸发而干燥变形或污染侵蚀接物镜，标本因蒸发而干燥变形或污染侵蚀接物镜，同时可使标本表面匀平，光线得以集中，同时可使标本表面匀平，光线得以集中，有利于观察。有利于观察。本讲稿第四十二页，共四十四页四、显微镜的保养四、显微镜的保养v1显微镜在从木箱中取出或装箱时，右手紧显微镜在从木箱中取出或装箱时，右手紧握镜臂，左手稳托镜座，轻
21、轻取出。不要只握镜臂，左手稳托镜座，轻轻取出。不要只用一只手提取，以防显微镜坠落，然后轻轻用一只手提取，以防显微镜坠落，然后轻轻放在实习台上或装放在实习台上或装入木箱内。入木箱内。v2显微镜放到实习台上时，先放镜座的一端，显微镜放到实习台上时，先放镜座的一端，再将镜座全部放稳，切不可使镜座全面同时再将镜座全部放稳，切不可使镜座全面同时与台面接触，这样震动过大，透镜和微调节与台面接触，这样震动过大，透镜和微调节器的装置易损坏。器的装置易损坏。v3显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘附着。如透镜部分不洁时，用擦镜纸轻擦，附着。如透镜部分不洁时，用擦镜纸轻擦，如有
22、油污，先将擦镜纸蘸少许二甲苯拭去。如有油污，先将擦镜纸蘸少许二甲苯拭去。本讲稿第四十三页，共四十四页v4显微镜不能在阳光下暴晒和使用。显微镜不能在阳光下暴晒和使用。v5接目镜和接物镜不要随便抽出和卸下必须接目镜和接物镜不要随便抽出和卸下必须抽取接目镜时，须将镜筒上口净用布遮盖，抽取接目镜时，须将镜筒上口净用布遮盖，避免灰尘落入镜筒内。更换接物镜时，卸下避免灰尘落入镜筒内。更换接物镜时，卸下后应倒置在清洁的台面下，并随即装入木箱后应倒置在清洁的台面下，并随即装入木箱的置放接物镜的管内。的置放接物镜的管内。v6显微镜用完后，取下标本片，经聚光器降显微镜用完后，取下标本片，经聚光器降下，再将物镜转成下，再将物镜转成“八八”字形，转动粗调节字形，转动粗调节器使镜筒下降，以免接物镜与聚光器相碰。器使镜筒下降，以免接物镜与聚光器相碰。v7显微镜应放在干燥的地方，以防生霉。显微镜应放在干燥的地方，以防生霉。本讲稿第四十四页，共四十四页