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1、关于实验紫外吸收法测定蛋白质含量现在学习的是第1页，共16页一、一、实验目的：实验目的：学习紫外分光光度法测定蛋白学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计测定熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用方法。原理及使用方法。现在学习的是第2页，共16页二、二、实验原理：实验原理：由于蛋白质中存在着由于蛋白质中存在着酪氨酸、色氨酸及苯酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸丙氨酸残基，它们的结构中具有残基，它们的结构中具有共轭双键共轭双键，对紫外光有吸收作用，其吸收高峰在对紫外光有吸收作用，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值密度值
2、OD280nm与其浓度（范围是与其浓度（范围是0.11.0mg/ml）成正比关系，）成正比关系，280nm的吸的吸光度故可作为蛋白质定量测定的依据。光度故可作为蛋白质定量测定的依据。现在学习的是第3页，共16页现在学习的是第4页，共16页本法操作简便迅速，且不消耗样品本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收可以回收)，低浓度，低浓度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备及其它的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备及其它研究中应用广泛，多用于纯化之蛋白质的微量测定，研究中应用广泛，多用于纯化之蛋白质的微量测定，尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情
3、况的检测。核酸在核酸在280nm波长下也有一定吸收能力，可能发生干扰。波长下也有一定吸收能力，可能发生干扰。混有核酸时必须分别测定混有核酸时必须分别测定280nm和和260nm两处的两处的OD值，值，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量，再按公式以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量，再按公式推算蛋白质含量。推算蛋白质含量。现在学习的是第5页，共16页三、三、实验材料、主要仪器和试剂实验材料、主要仪器和试剂1试验材料：待测的蛋白质溶液。试验材料：待测的蛋白质溶液。2 主要仪器：主要仪器：（1
4、）紫外分光光度计）紫外分光光度计（2）试管与试管架）试管与试管架（3）移液管）移液管3试剂：浓度为试剂：浓度为1mg/mL标准酪蛋白溶液标准酪蛋白溶液现在学习的是第6页，共16页四、操作步骤四、操作步骤1标准曲线制作标准曲线制作按表按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为匀。以光程为1cm的石英比色杯，在的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。标，绘出标准曲线。现在学习的是第7页，共16页2样品测定：样品测
5、定：取待测蛋白质溶液取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水，加入蒸馏水9mL，混匀，按上述方法测定，混匀，按上述方法测定280nm的光密度，的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。的浓度。现在学习的是第8页，共16页现在学习的是第9页，共16页分光光度计的使用分光光度计的使用现在学习的是第10页，共16页分光光度计的分类分光光度计的分类分分光光光光度度计计的的分分类类红外分光光度计红外分光光度计:可见光分光光度计可见光分光光度计:紫外分光光度计紫外分光光度计:测定波长范围为测定波长范围为大于大于760 nm的红外光区的红外光区 测定波长范围为测定波
6、长范围为400760 nm的可见光区的可见光区测定波长范围为测定波长范围为200200400 nm400 nm的紫外光区的紫外光区现在学习的是第11页，共16页分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括无论哪一类分光光度计都包括 ：光源、：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示的次序如图所示:5个基本部件个基本部件现在学习的是第12页，共16页紫外分光光度计紫外分光光度计 1光源：钨灯或卤钨灯光源：钨灯或卤钨灯可见光源可见光源 400760nm氢灯或氘灯氢灯或氘灯紫外光源紫外光源 200
7、400nm 2单色器：单色器：把混合光波分解为单把混合光波分解为单波长光的波长光的装置装置3吸收池吸收池（比色皿）（比色皿）：玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区石英石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区见光区4检测器：将光信号转变为电信号的装置检测器：将光信号转变为电信号的装置5记录装置：讯号处理和显示系统记录装置：讯号处理和显示系统现在学习的是第13页，共16页紫外可见分光光度计使用方法（紫外可见分光光度计使用方法（1 1）（1）测试准备测试准备 仪器预热仪器预热30min后方可进行测试。后方可进行测试。将盛有将盛有“空白空白”或
8、或“对照对照”溶液的比色皿处于试样室光路位置；溶液的比色皿处于试样室光路位置；选择波长选择波长 确定光源确定光源 （2）测试过程）测试过程 数字显示透光度数字显示透光度“100.0”(或吸光度或吸光度“0.00”)23s后，将盛有后，将盛有标准溶液的比色皿移至光路标准溶液的比色皿移至光路 将盛有样品溶液的比色皿移至光路，记录该样品的数据。将盛有样品溶液的比色皿移至光路，记录该样品的数据。待第一个样品数据记录完毕后，将第二个样品置于试样室光路待第一个样品数据记录完毕后，将第二个样品置于试样室光路，若有多个样品，操作以此类推。，若有多个样品，操作以此类推。现在学习的是第14页，共16页分光光度计使
9、用注意事项分光光度计使用注意事项 （1）预热是保证实验结果准确可靠的必要步骤，不可忽略。预热是保证实验结果准确可靠的必要步骤，不可忽略。（2）在在波波长长320nm以以下下的的实实验验范范围围一一定定要要选选用用石石英英比比色色皿皿，绝绝不不可可以以玻璃比色皿替代。玻璃比色皿替代。（3）比比色色皿皿的的清清洁洁程程度度，直直接接影影响响实实验验结结果果。因因此此，特特别别要要将将比比色色皿皿清清洗洗干干净净。先先用用自自来来水水将将用用过过的的比比色色皿皿反反复复冲冲洗洗，然然后后用用蒸蒸馏馏水水淋淋洗洗，倒倒立立于于滤滤纸纸片片上上，待待干干后后再再收收回回比比色色皿皿盒盒中中。必必要要时时，还还要要对对比比色色皿皿进进行行更更精精细细的的处处理理，如如用用浓浓硝硝酸酸或或铬铬酸酸洗洗液液浸浸泡、冲洗。泡、冲洗。（4）比色皿与分光光度计应配套使用，否则会引起较大的实验误差。比色皿与分光光度计应配套使用，否则会引起较大的实验误差。现在学习的是第15页，共16页感谢大家观看现在学习的是第16页，共16页