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1、人类细胞质提取的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用2022/9/25第一页，讲稿共四十四页哦人类细胞质人类细胞质RNARNA提取提取第二页，讲稿共四十四页哦2022/9/25电泳电泳PCR提取总提取总RNA合成合成cDNA第第一链一链第三页，讲稿共四十四页哦2022/9/25真核细胞真核细胞RNA的种类的种类真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。大多数真核细胞mRNA在其3端均有一多聚A(PolyA)尾巴。第四页，讲稿共四十四页哦2022/9/25实验前的准备实验前
2、的准备RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。第五页，讲稿共四十四页哦2022/9/25常用的常用的RNA酶抑制剂酶抑制剂1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，进而使RNA酶失活，有高致癌性。（实验准备阶段使用）2、异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。3、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸
3、性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用）第六页，讲稿共四十四页哦2022/9/25实验原理实验原理Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。第七页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 提取提取RNA（一）、准备试剂氯仿异丙醇75乙醇无RNase的水或0.5SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)第八页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 提取提取RN
4、A（二）、操作步骤取材取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约用生理盐水漱口后，含生理盐水约23min，用，用15ml离心管（离心管（4000rpm5min）收集细胞）收集细胞(同管多次离心同管多次离心)，弃上清，弃上清沉淀中加入沉淀中加入1mlTRIzol，旋涡震荡，旋涡震荡10s重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转移至重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转移至1.5mlEP管，管，1530放置放置5min加入加入0.2ml氯仿氯仿，用手摇晃，用手摇晃15s，1530放置放置5min12000rpm离心离心15min第九页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 提取提取RNA（二）、操作步骤小心吸取上清，转移至新的
5、小心吸取上清，转移至新的1.5mlEp管，加入等体积的异丙醇，管，加入等体积的异丙醇，1530放置放置10min12000rpm离心离心15min，小心去上清，加入，小心去上清，加入1ml70%乙醇乙醇，震荡数秒，震荡数秒，8000rpm离心离心5min小心去上清，室温干燥小心去上清，室温干燥5min，加入，加入10ulDEPC水，打匀水，打匀55水浴水浴10分钟助溶分钟助溶第十页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 提取提取RNA（三）、注意事项1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。2、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温
6、10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。3、所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6h或更长时间。4、配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。第十一页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 提取提取RNA（三）、注意事项6、设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。7、防止RNA酶污染（1）RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等（2）严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RN
7、A酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。（3）最大限度地抑制内源性的RNA酶；而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。第十二页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 RNA保存保存溶解在无RNase的水或TE中，在-70或更低温度中保存时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需溶解在去离子甲酰胺中存于-70，至少可以保存一年。需使用RNA时，可以加入NaAc至终浓度0.3M，12000g离心5分钟，70%乙醇洗涤后再用无RNase的水或TE溶解。第十三页
8、，讲稿共四十四页哦RT-PCRRT-PCR的原理、方法的原理、方法第十四页，讲稿共四十四页哦2022/9/25实验原理实验原理1、单拷贝基因表达存在逐步放大机制。2、PCR技术，即聚合酶链式反应。反应分三步：变性，退火，延伸。3、逆转录酶。可以以RNA为模板合成cDNA第一条链，或者以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。principedoes matter 可见，RT-PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法。第十五页，讲稿共四十四页哦RNA模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA杂化双链杂化双链RNaseRNase降解降解RNARNA单链单链DNADNA
9、DNA聚合酶聚合酶c cDNART-PCRTaqTaq酶酶第十六页，讲稿共四十四页哦2022/9/251、引物的特异性决定PCR反应特异性。2、引物设计原则的把握：（1）引物长度:一般为1530bp（2）碱基分布（3）3端要求（4）引物自身二级结构（5）引物之间的二级结构（6）同源序列（7）5端无严格限制 操作步骤操作步骤（一）引物设计第十七页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 操作步骤操作步骤（二）RNA的提取第十八页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 操作步骤操作步骤（二）RNA的提取第十九页，讲稿共四十四页哦2022/9/25（1 1）两步法）两步法RT-PCRRT-PCR 操作步骤
10、操作步骤（三）cNDA合成a常用的反应体系常用的反应体系10RT反应缓冲液反应缓冲液 2uldNTP Mixture（各（各10mM）2ulRNAase inhibitor(40U/ul)0.5uloligo(dT)18 1ul逆转录酶逆转录酶 1ul总总RNA 0.51ugDEPCfree水水 补足体系至补足体系至20ul第二十页，讲稿共四十四页哦2022/9/25（1 1）两步法）两步法RT-PCRRT-PCR 操作步骤操作步骤（三）cNDA合成b操作操作在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul总总RNA溶液溶液0.2mlEp管，迷
11、你离心机离心数秒，放置管，迷你离心机离心数秒，放置PCR仪中仪中4230min（合成（合成cDNA第一链）第一链）855min（灭活逆转录酶）（灭活逆转录酶）第二十一页，讲稿共四十四页哦2022/9/25（2 2）一步法）一步法RT-PCRRT-PCR 操作步骤操作步骤（三）cNDA合成 在一步法在一步法RT-PCRRT-PCR中，逆转录和中，逆转录和PCRPCR在同时为逆转录和在同时为逆转录和PCRPCR优化的条件下，在同一管内进行。优化的条件下，在同一管内进行。优势：在处理大量样品时易于操作；减少残余污染；优势：在处理大量样品时易于操作；减少残余污染；可以得到更高的灵敏度。可以得到更高的灵
12、敏度。缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重新提取缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重新提取总总RNARNA。第二十二页，讲稿共四十四页哦2022/9/25（2 2）一步法）一步法RT-PCRRT-PCR 操作步骤操作步骤（三）cNDA合成0.1-1ug总RNA200一500umol/L的dNTP(每种)0.5umolL基因特异引物（上下游）200UAMV逆转录酶1Taq聚合酶缓冲液0.5-15mmolLMgCI21mmo1LDTT1.5UTaq聚台酶终体积为50ul。第二十三页，讲稿共四十四页哦2022/9/25（1 1）50ulPCR50ulPCR体系的组成（即一步法）：体系的组成（
13、即一步法）：操作步骤操作步骤（四）PCR扩增第二十四页，讲稿共四十四页哦2022/9/25（2 2）PCRPCR反应反应过程过程：操作步骤操作步骤（四）PCR扩增第二十五页，讲稿共四十四页哦2022/9/25（1）引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下2变化寻找最佳退火温度。（2）此外Mg2浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2mM左右。（3）引物和模板的量等。操作步骤操作步骤（五）PCR条件的优化第二十六页，讲稿共四十四页哦2022/9/25根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度）。取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔
14、中，10V/cm电泳4560min。成像系统成像分析。操作步骤操作步骤（六）产物的电泳和结果的测定 第二十七页，讲稿共四十四页哦琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用第二十八页，讲稿共四十四页哦2022/9/25实验原理实验原理1、琼脂糖为链状多糖绳状琼脂糖束大网孔型凝胶分离、鉴定、纯化DNA2、影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成principedoes matter琼脂糖浓度与琼脂糖浓度与DNA分离范围分离范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度/%线状线状DNA大小大小/kb0.50.71.01.21.52.030-112-0.810-0
15、.57-0.43-0.22-0.05第二十九页，讲稿共四十四页哦2022/9/25染色和照相染色和照相电泳电泳样品的制备样品的制备与加样与加样选择电泳类型选择电泳类型选择电泳缓冲选择电泳缓冲体系体系琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶的制备的制备第三十页，讲稿共四十四页哦2022/9/25选择电泳类型选择电泳类型用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。STEPSdoes matter第三十一页，讲稿共四十四页哦2022/9/25选择缓冲液系统选择缓冲液系统常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50m
16、mol/L(pH7.57.8)。STEPSdoes matter第三十二页，讲稿共四十四页哦2022/9/25凝胶的制备凝胶的制备 以稀释的电泳缓冲液为溶剂，用微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。STEPSdoes matter第三十三页，讲稿共四十四页哦2022/9/25样品配制与加样样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，使样品集中。STEPSdoes matter第三十四页，讲稿共四十四页哦2022/9/25电泳电泳 在低电压条件下，线
17、性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。STEPSdoes matter第三十五页，讲稿共四十四页哦2022/9/25染色与照相染色与照相 常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。STEPSdoes matter第三十六页，讲稿共四十四页哦第三十七页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 结果分析结果分析（一）、影响琼脂糖凝胶电泳的因素DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比；琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段
18、在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大第三十八页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 结果分析结果分析（二）、常见问题的原因和解决常见问题原因对策电泳时ladder扭曲配胶的缓冲液与电泳的缓冲液不是同时配制。同时配制，电泳缓冲液高出胶的1-2mm即可。电泳时电压过高电泳时电压不应超过20V/cm。第三十九页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 结果分析结果分析（二）、常见问题的原因和解决常见问题原因对策DNA带缺尖DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确凝胶浓度
19、DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上个分析。第四十页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 结果分析结果分析（二）、常见问题的原因和解决常见问题原因对策带弱或无DNA带DNA上样量不够增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低。DNA降解实验过程中应避免核酸酶污染。DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。EB染色的DNA所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源。第四十一页，讲稿共四十四页哦2022/9/25 结果分析结果分析（二）、常见问题的原因和解决常见问题原因对策出
20、现片状拖带或涂抹带酶量多或者酶的质量差，dNTP浓度高，Mg2+浓度高，退火温度过低，循环次数多。减少酶量或更换酶，减少dNTP浓度，适当降低Mg2+浓度，增加模板量，减少循环次数。不规则DNA带迁移电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度30，巨大DNA链电泳，温度15，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。第四十二页，讲稿共四十四页哦常见问题原因对策DNA条带模糊DNA降解实验过程中应避免核酸酶污染。电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。TBE建议使用10就更换。所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度30，巨大DNA链电泳，温度15，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量DNA含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分。有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白。DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。第四十三页，讲稿共四十四页哦2022/9/25应用应用 1、PCR产物在琼脂糖凝胶上进行的电泳检测。does matter icationappl第四十四页，讲稿共四十四页哦