干扰技术基本原理与应用.ppt

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1、关于干扰技术基本原理与应用现在学习的是第1页，共48页什么是什么是RNA干扰干扰RNA干扰干扰(RNA interference，RNAi),又称转又称转录后基因沉默录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指将特异性同源双链，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降表达或表达水平下降.2001、2002年连续被年连续被Science评为年度十大成就评为年度十大成就!现在学习的是第2页，共48页目前应用的基因干扰技术目前应用的基因干扰技术DNA水平的基因干扰技术水

2、平的基因干扰技术基因敲除技术基因敲除技术寡核苷酸与双链寡核苷酸与双链DNA 杂交杂交采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子现在学习的是第3页，共48页目前应用的基因干扰技术目前应用的基因干扰技术mRNA水平的基因干扰技术水平的基因干扰技术用反义用反义RNA 技术阻遏翻译过程技术阻遏翻译过程,破坏内源性破坏内源性mRNA设计寡核苷酸来破坏与设计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白质结合的蛋白质,使使mRNA 不稳定不稳定双链双链RNA 干扰技术（干扰技术（RNAi）现在学习的是第4页，共48页RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程1984 年年,Jonat

3、han 研究小鼠研究小鼠L 细胞时发现反义细胞时发现反义mRNA 会干扰同源基因的表达，机制不清会干扰同源基因的表达，机制不清1990年年 Jorgensen等等 矮牵牛颜色加深实验矮牵牛颜色加深实验“共抑制共抑制(co-suppresion)”现在学习的是第5页，共48页RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程19951995年年 Su Guo 和和Ken Emphues 反义反义RNA阻断秀丽小杆线虫阻断秀丽小杆线虫par-1par-1基因的表达基因的表达 实验实验 首次发现首次发现 RNA干扰现象干扰现象1998年年 Andrew FireAndrew Fire和和和和Craig Mel

4、lo 发现单链发现单链发现单链发现单链RNARNA抑制作用较弱，而纯化的抑制作用较弱，而纯化的dsRNAdsRNA可高可高效、特异地抑制基因的表达效、特异地抑制基因的表达 Nature1998Nature1998；391:806-11391:806-11 正式提出正式提出正式提出正式提出RNA干扰的概念干扰的概念干扰的概念干扰的概念现在学习的是第6页，共48页RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程1999年年 Tuschl等等 报道在哺乳动物中也存在报道在哺乳动物中也存在RNAi2001 年年 Berstein 等等 提出只有提出只有22 核苷酸核苷酸dsRNA才有特异性的阻才有特异性的阻断

5、效应，并发现体内分解断效应，并发现体内分解dsRNA 为为siRNAs(short/small interfering RNA)的的DICER 酶酶现在学习的是第7页，共48页RNAi的发现和发展历程的发现和发展历程2002 年年 Novina 等等 用用RNAi 技术实现了对技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑病毒的阻抑2004年年 Morris 等等 用用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制技术实现了对人细胞基因的抑制 Science 2004(August 27)；305：1289-1292现在学习的是第8页，共48页RNAi的主要特点和优势的主要特点和优势诱导转录后水平的基因沉默诱导转录

6、后水平的基因沉默具有高度的特异性具有高度的特异性抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间传递甚抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去至传到子代中去 “基因沉默系统化基因沉默系统化”现在学习的是第9页，共48页siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶共同点共同点 特异性特异性 靶向性靶向性现在学习的是第10页，共48页siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶不同点不同点独特的双链结构独特的双链结构需要需要Dicer、RdRp、解旋酶、激酶等协同因、解旋酶、激酶等协同因子子siRNA 本身无催化活性本身无催化活性在细胞内

7、可能具有相对的稳定性在细胞内可能具有相对的稳定性具有一定的可遗传性具有一定的可遗传性现在学习的是第11页，共48页RNAi的主要过程的主要过程启动阶段启动阶段 dsRNA(500nt左右最佳左右最佳)被被Dicer 酶特异性酶特异性识别，以一种识别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成依赖的方式逐步切割成siRNA长度：长度：21-25nt结构：结构：3端悬垂两个未配对的碱基端悬垂两个未配对的碱基UU现在学习的是第12页，共48页细胞中内源性细胞中内源性dsRNA的形成的形成基因组中基因组中DNA 反向重复序列的转录产物反向重复序列的转录产物同时转录反义和正义同时转录反义和正义RNA 病毒病毒RN

8、A 复制中间体复制中间体以单链以单链RNA 为模板由细胞或病毒的为模板由细胞或病毒的RNA 依赖依赖RNA 聚合酶聚合酶(RdRp)催化合成催化合成dsRNA现在学习的是第13页，共48页Dicer酶酶RNAase III超家族成员。结构中包括一个螺旋酶超家族成员。结构中包括一个螺旋酶结构域，两个结构域，两个RNA酶酶结构域，一个双链结构域，一个双链RNA结合位点结合位点对单链对单链RNA没有活性没有活性对对200500nt的的dsRNA作用效果最好，能降解作用效果最好，能降解成成25nt左右的左右的siRNA广泛存在广泛存在现在学习的是第14页，共48页RdRp（RNA dependent

9、RNA polymerase）使异常的使异常的RNA转变为转变为dsRNA参与细胞内参与细胞内dsRNA和和siRNA的扩增的扩增siRNA与靶与靶mRNA 的结合可激活的结合可激活RdRp，形成，形成大量的大量的dsRNA现在学习的是第15页，共48页RNAi的主要过程的主要过程效应阶段效应阶段RNA诱导沉默复合体（诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）的形成的形成RISC的激活：的激活：ATP依赖的解双链过程依赖的解双链过程在在siRNA反义链的指导下反义链的指导下(靶序列的识别），靶序列的识别），RISC特异性切特异性切 割、降解靶割、降解

10、靶mRNA，导致基因，导致基因表达失活表达失活 现在学习的是第16页，共48页现在学习的是第17页，共48页RNAi技术的实验方法技术的实验方法siRNA的设计原则的设计原则序列大小序列大小 19-21nt，最好以，最好以A或或G开始开始从从mRNA的的AUG开始，寻找开始，寻找AA二连序列，二连序列，作为潜在的作为潜在的RNAi靶位点靶位点不要针对不要针对5和和3端非编码区（端非编码区（untranslated regions，UTRs)现在学习的是第18页，共48页RNAi技术的实验方法技术的实验方法siRNA的设计原则的设计原则设计设计24个序列个序列,BLAST 比对基因序列以确保比对

11、基因序列以确保序列设计的特异性序列设计的特异性优先选择优先选择 GC 含量含量30-50%的序列的序列设计适当的阴性对照序列设计适当的阴性对照序列现在学习的是第19页，共48页阴性对照序列的设计阴性对照序列的设计特异性特异性siRNA中的碱基进行随机排列，且行中的碱基进行随机排列，且行BLAST基因比对基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG在特异性在特异性siRNA引入引入12个错配碱基个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG现在学习的是第20页，共48页目标序列筛选的相关网站目标序列筛

12、选的相关网站http:/www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp:/sfold.wadsworth.org/sirna.plhttp:/sfold.wadsworth.org/sirna.plhttp:/ 现在学习的是第21页，共48页查找已经证实的查找已经证实的siRNA的网站的网站http:/ 现在学习的是第22页，共48页siRNA的制备方法的制备方法体外制备方法体外制备方法化学合成化学合成siRNA体外转录获取体外转录获取siRNA利用利用Dicer或或 RNase消化长的消化长的dsRNA成成siRNA现在学习的是第23页，共48页化学合成

13、法制备化学合成法制备siRNA优点：优点：纯度高纯度高 合成量不受限合成量不受限 能被标记能被标记缺点：价格昂贵、合成周期长缺点：价格昂贵、合成周期长用途：已经找到最有效的用途：已经找到最有效的siRNA的情况下，需的情况下，需要大量要大量siRNA进行研究进行研究 现在学习的是第24页，共48页体外转录法制备体外转录法制备siRNA优点：简单优点：简单 成本低成本低 速度快速度快 毒性小毒性小 稳定性好稳定性好 缺点：反应规模和量始终有一定的限制缺点：反应规模和量始终有一定的限制用途：筛选用途：筛选siRNAs，特别是需要制备多种，特别是需要制备多种 siRNAs 现在学习的是第25页，共4

14、8页siRNA的制备方法的制备方法细胞内制备方法细胞内制备方法依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNA通过通过PCR介导的介导的siRNA表达试剂盒获取表达试剂盒获取siRNA现在学习的是第26页，共48页siRNA载体载体依赖依赖RNA聚合酶聚合酶III 启动子启动子(pol III)，操纵一段，操纵一段小的发夹小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。在哺乳动物细胞中的表达。人源人源U6启动子启动子 鼠源的鼠源的U6启动子启动子 人人H1启动子启动子pol III可在细胞中表达许多的小分子可在细胞中表达许多的小分子RNA，通，通过添加一串（过添加一串（

15、36个）个）U来终止转录的来终止转录的需要订购需要订购2段编码短发夹段编码短发夹RNA序列的序列的DNA单链单链再克隆到载体中再克隆到载体中 现在学习的是第27页，共48页表达载体法制备表达载体法制备siRNA优点：可以进行较长期研究。载体可以在细胞优点：可以进行较长期研究。载体可以在细胞中持续抑制靶基因达数星期或更久中持续抑制靶基因达数星期或更久缺点：需要进行克隆，周期长，质粒载体表缺点：需要进行克隆，周期长，质粒载体表达效率较低达效率较低用途：唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法用途：唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法现在学习的是第28页，共48页基于基于PCR的的siRNA表达框架表达框架

16、(SECs)组成：组成：RNA pol III启动子启动子 发夹结构发夹结构siRNA RNA pol III终止位点终止位点制备：制备：PCR，无需克隆和测序，无需克隆和测序现在学习的是第29页，共48页用用SECs制备制备siRNA优点：优点：可直接由可直接由PCR得到，方法简便，时间短得到，方法简便，时间短在在PCR片段两端添加酶切位点，筛选出片段两端添加酶切位点，筛选出 最有最有效的效的siRNA可用于构建表达载体可用于构建表达载体可以用来筛选特定研究体系中启动子和可以用来筛选特定研究体系中启动子和siRNA的最适搭配的最适搭配 现在学习的是第30页，共48页用表达框架制备用表达框架制

17、备siRNA缺点：缺点：PCR产物很难转染到细胞中产物很难转染到细胞中不能进行序列测定，不能进行序列测定，PCR和和DNA合成时可能产合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想生的误读不能被发现导致结果不理想 用途：用途：筛选筛选siRNA序列序列在将在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子克隆到载体前筛选最佳启动子 现在学习的是第31页，共48页现在学习的是第32页，共48页现在学习的是第33页，共48页现在学习的是第34页，共48页shRNA(short hairpin RNA)文库文库 Nature 2004；428：427-431(25 March427-431(25 March)针

18、对：针对：9,610 human genes9,610 human genes 5,563 mouse genes 5,563 mouse genes 构建成：构建成：28,00028,000个个个个shRNAshRNA表达盒表达盒(cassettes)(cassettes)商品化试剂盒：商品化试剂盒：Expression Arrest(美国冷泉港实验室美国冷泉港实验室美国冷泉港实验室美国冷泉港实验室 Open BiosystemsOpen Biosystems公司公司)网上数据库中选择特定的网上数据库中选择特定的网上数据库中选择特定的网上数据库中选择特定的shRNAshRNA克隆，无需再耗克

19、隆，无需再耗时耗力进行时耗力进行siRNAsiRNA的设计、合成和验证过程的设计、合成和验证过程现在学习的是第35页，共48页CAM:氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因 hr：同源重组位点：同源重组位点Barcode：每个每个shRNA独特的识别序列独特的识别序列 MSCV：病毒载体骨架：病毒载体骨架 PKG-Puro：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择Kan、oriT、RK6：逆转录病毒信号序列：逆转录病毒信号序列现在学习的是第36页，共48页siRNAsiRNAshRNAshRNA使用代价使用代价使用代价使用代价高高高高相对较低相对较低相对较低相对较低持久性持久性持久

20、性持久性最多最多最多最多2 2周周周周可选择获得稳定整合的细胞可选择获得稳定整合的细胞可选择获得稳定整合的细胞可选择获得稳定整合的细胞宿主类型宿主类型宿主类型宿主类型细胞系细胞系细胞系细胞系原代细胞，胚胎干细胞、细胞原代细胞，胚胎干细胞、细胞原代细胞，胚胎干细胞、细胞原代细胞，胚胎干细胞、细胞系系系系设计设计设计设计复杂的设计方法复杂的设计方法复杂的设计方法复杂的设计方法完成完成完成完成获取获取获取获取需要合成需要合成需要合成需要合成完成完成完成完成应用应用应用应用瞬时转染瞬时转染瞬时转染瞬时转染瞬时转染、稳定转染、病毒侵瞬时转染、稳定转染、病毒侵瞬时转染、稳定转染、病毒侵瞬时转染、稳定转染、

21、病毒侵染染染染检测方法检测方法检测方法检测方法WesternWestern杂交、表型分杂交、表型分杂交、表型分杂交、表型分析析析析RT-PCRRT-PCR、芯片检测、芯片检测、芯片检测、芯片检测WesternWestern杂交、表型分析、杂交、表型分析、杂交、表型分析、杂交、表型分析、RT-PCRRT-PCR、芯片检测、芯片检测、芯片检测、芯片检测研究领域研究领域研究领域研究领域细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养&体内研究体内研究体内研究体内研究现在学习的是第37页，共48页现在学习的是第38页，共48页现在学习的是第39页，共48页现在学习的是第40页，共48页

22、siRNA转染细胞转染细胞.磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀 电穿孔法电穿孔法 DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene 机械法机械法：显微注射和基因枪：显微注射和基因枪 阳离子脂质体试剂阳离子脂质体试剂 现在学习的是第41页，共48页提高转染效率的方法提高转染效率的方法纯化的纯化的siRNA避免使用抗生素避免使用抗生素避免避免RNA酶污染酶污染 较低传代数的细胞较低传代数的细胞 合适的转染试剂合适的转染试剂 合适的阳性对照合适的阳性对照荧光标记的荧光标记的siRNA 现在学习的是第42页，共48页RNAi技术的应用技术的应用基因组功能研究的新方法基因组功能研究的新方法研究信号传导通路的新途径研究

23、信号传导通路的新途径 开展基因治疗的新策略开展基因治疗的新策略（抗病毒、抗肿瘤等）（抗病毒、抗肿瘤等）筛选药物靶点的新工具筛选药物靶点的新工具现在学习的是第43页，共48页RNAi技术抗病毒技术抗病毒作用作用阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录自然界中普遍存在自然界中普遍存在在医学上的应用在医学上的应用RNA病毒：如病毒：如HIV、HCV、脊髓灰质炎病毒、脊髓灰质炎病毒DNA病毒：如病毒：如HBV现在学习的是第44页，共48页RNAi技术阻止技术阻止HIV的入侵的入侵Novina将针对将针对CD4的的dsRNA导入导入 能表达能表达CD4、CCR 5、CXCR4

24、的的M agi2CCR 5 细胞系），细胞系），能使细胞表面能使细胞表面CD4 表达减少表达减少75%；转染后；转染后60 小时后小时后,再用再用H IV 感染感染,结果发现结果发现CD4-siRNA 转染的细胞很少有包涵体出现转染的细胞很少有包涵体出现其它试验的受体：其它试验的受体：CCR 5、CXCR4现在学习的是第45页，共48页RNAi技术抑制技术抑制HIV的复制的复制将将HIV-1编码编码rev的基因和同源的的基因和同源的dsRNA共转染共转染到到293细胞中，细胞中，rev基因的表达被显著抑制基因的表达被显著抑制siRNA抑制抑制HIV rev-EGFP的表达，其抑制率可的表达，其抑制率可达到达到90；而反义；而反义RNA，核酶组与对照组无显，核酶组与对照组无显著差异著差异现在学习的是第46页，共48页RNAi技术抑制技术抑制HCV的复制的复制NS5B-6133siRNANS3-1948siRNAGAPDHsiRNA+HCV表达质粒表达质粒Huh-7 细胞细胞共转染共转染HCV RNA 21倍倍HCV RNA 23倍倍HCV RNA 无变化无变化现在学习的是第47页，共48页感谢大家观看现在学习的是第48页，共48页