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1、关于实验四蛋白酶活力的测定现在学习的是第1页，共9页一、一、实验目的实验目的n掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底物和生掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关性，以及本反应的环境条件。成物的相关性，以及本反应的环境条件。n进一步理解酶活力和比活力的概念进一步理解酶活力和比活力的概念n巩固比色法测定物质含量的基础，巩固比色法测定物质含量的基础，掌握分光光度计使用方法，掌握分光光度计使用方法，学习绘制标准曲线的方法学习绘制标准曲线的方法现在学习的是第2页，共9页二、实验原理实验原理1胰蛋白酶是一种水解酶，将胰蛋白酶是一种水解酶，将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。酪蛋
2、白水解成酪氨酸等物质。2所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质。所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质。酚试剂又名酚试剂又名Folin试剂试剂，是磷钨酸和磷钼酸，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物，的混合物，680nm）。）。3用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含量可以计用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含量可以计算算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多
3、。酪氨酸越多。4.蛋白酶活力单位定义：在蛋白酶活力单位定义：在40 C，pH7.5的条件下，反应的条件下，反应10min，以每，以每min水解酪蛋白水解酪蛋白产生产生1 g酪氨酸为酪氨酸为1U。现在学习的是第3页，共9页三、器材仪器和主要试剂三、器材仪器和主要试剂 n可见光分光光度计可见光分光光度计 n水浴锅水浴锅nFolin 酚试剂酚试剂n 0.5%酪蛋白酪蛋白 n100 g/ml Tyr 溶液溶液n三三氯氯醋酸醋酸nNa2CO3n胰蛋白酶胰蛋白酶现在学习的是第4页，共9页四、实验操作四、实验操作1 1、酪氨酸标准曲线的制作、酪氨酸标准曲线的制作管号管号123456样品、对样品、对照滤液照滤
4、液（各（各2支试支试管）管）100 g/ml Tyr (ml)00.20.40.60.81.0每支管加每支管加1ml水（水（ml)1.00.80.60.40.20稀稀释释后后Tyr浓浓度度（g/ml）020406080100Na2CO3(ml)5555555Folin-酚酚试剂试剂(ml)1111111迅速混合，于迅速混合，于40放置放置15分分钟钟 A680nm调调0 A样、样、A对对照照以酪氨酸的浓度（以酪氨酸的浓度（g/ml）为横坐标，）为横坐标，A680nm为纵坐标，作出标准曲线。为纵坐标，作出标准曲线。管号管号酶酶液液（ml）酪蛋白酪蛋白（ml）三三氯氯醋酸醋酸（ml）40水水浴浴准
5、确准确保保温温10分分钟钟三三氯氯醋酸醋酸（ml）酪蛋白酪蛋白（ml）40水浴保温水浴保温10分分钟钟，过滤得滤过滤得滤液液 样样品管品管12-3-对对照管照管1-3-2现在学习的是第5页，共9页2、蛋白酶活力的测定、蛋白酶活力的测定n按下表操作，然后测定滤液中的酪氨酸含量。n滤液各取滤液各取1ml，进行显色反应，进行显色反应(加加Na2CO35ml+Folin-酚试剂酚试剂1ml，40 C保温保温15min)n以标准曲线中的1号管调0，测定A 样(样品液A680nm值)和A 对(对照液A680nm值)；管号管号酶酶液液（ml）酪蛋白酪蛋白（ml）三三氯氯醋酸醋酸（ml）40水水浴浴准确准确保
6、温保温10分分钟钟三三氯氯醋酸醋酸（ml）酪蛋白酪蛋白（ml）40水浴保温水浴保温10分分钟钟，过滤过滤得滤液。得滤液。1 1 号号(样样品品)12-3-2 号号(对对照照)1-3-2现在学习的是第6页，共9页3.酶活力计算酶活力计算n胰酶活力定义：胰酶活力定义：40 ，pH7.5，反应，反应10min，每分钟水解每分钟水解酪蛋白产生酪氨酸酪蛋白产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。微克为一个酶活力单位。计算：计算：1g 蛋白酶所具备的总活力单位为：蛋白酶所具备的总活力单位为：(A 样样-A 对对)K V/t N A 样样：样品液光吸收值；：样品液光吸收值；A 对对：对照液光吸收值；：对照液光
7、吸收值；K：标准曲线上标准曲线上A680nm为为 1 时的酪氨酸微克数；时的酪氨酸微克数；t：酶促反应的时间（酶促反应的时间（min），本实验），本实验 t=10min；V：酶促反应管的总体积（酶促反应管的总体积（ml数），本实验数），本实验 V=6；N：本次实验酶液的稀释倍数本次实验酶液的稀释倍数:6000现在学习的是第7页，共9页五、思考题五、思考题n酶的试验为何设对照又要设空白酶的试验为何设对照又要设空白?n稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原因。稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原因。n计算公式中的计算公式中的v=6该如何理解该如何理解n本实验用什么方法终止酶促反应本实验用什么方法终止酶促反应?还有其他方法还有其他方法可以终止反应吗可以终止反应吗?n如何保证本实验测定数据的准确性？如何保证本实验测定数据的准确性？n胰蛋白酶的比活力如何计算？胰蛋白酶的比活力如何计算？现在学习的是第8页，共9页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第9页，共9页