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1、化学微生物学第六章氨化学微生物学第六章氨基酸谷发酵基酸谷发酵现在学习的是第1页，共96页氨基酸发酵氨基酸发酵现在学习的是第2页，共96页氨基酸简介氨基酸简介n n氨基酸是构成蛋白成分氨基酸是构成蛋白成分 大约大约2020种种L-L-氨基酸构成了数目庞大的各种肽类和蛋白氨基酸构成了数目庞大的各种肽类和蛋白质，以及生命体。其中质，以及生命体。其中8 8种氨基酸是人体所必需，它们分别是种氨基酸是人体所必需，它们分别是L-L-赖氨酸、赖氨酸、L-L-苏氨政、苏氨政、L-L-异亮氨酸、异亮氨酸、L-L-蛋氨酸、蛋氨酸、L-L-苯丙氨酸、苯丙氨酸、L-L-色氨酸、色氨酸、L-L-亮氨酸和亮氨酸和L-L-缬
2、氨酸；另一方面，缬氨酸；另一方面，D-D-氨基酸也在细氨基酸也在细菌细胞壁、肤类抗生素和植物中发现。菌细胞壁、肤类抗生素和植物中发现。n n目前世界上可用发酵法生产氨基酸有目前世界上可用发酵法生产氨基酸有2020多种。多种。n n 现在学习的是第3页，共96页氨基酸氨基酸n n 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。同，氨基酸的性质不同。n n上述氨基酸结构通式具有两个特点：上述氨基酸结构通式具有两个特点：具有酸性的一具有酸性的一COOHCOOH和碱和碱性的一性的一NHNH2 2，为两性电解质；，为两性
3、电解质；如果如果R R HH，则具有不对称碳原，则具有不对称碳原子，因此是光学活性物质。甘氨酸子，因此是光学活性物质。甘氨酸(分子式中分子式中R RH)H)无不对称碳无不对称碳原子，因而无原子，因而无D-D-型及型及L-L-型之分，其余型之分，其余-氨氨基酸的基酸的-碳原子皆碳原子皆为不对称碳，故都有为不对称碳，故都有D-D-型及型及L-L-型型2 2种异构体。氨基酸的种异构体。氨基酸的DD则或则或L L别是以别是以L-L-甘油醛或甘油醛或L-L-乳酸为参考的。凡乳酸为参考的。凡-位上的构型与位上的构型与L-L-甘油醛甘油醛(或或L-L-乳酸乳酸)相同的氨基酸皆为相同的氨基酸皆为L-L-型，相
4、反者为型，相反者为D-D-型。型。现在学习的是第4页，共96页氨基酸的用途氨基酸的用途n n1.食品工业：n n强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中)n n增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸n n苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。现在学习的是第5页，共96页2.2.饲料工业：饲料工业：甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 3.3.医药工业：医药工业：多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯
5、丙氨酸氮芥子气对骨髓肿苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效瘤治疗有效,且副作用低。且副作用低。4.4.化学工业：谷氨基钠作洗涤剂化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。丙氨酸制造丙氨酸纤维。现在学习的是第6页，共96页氨基酸的生产方法氨基酸的生产方法n n发酵法：直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。添加前体法现在学习的是第7页，共96页n n酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。基酸。n n提取法
6、：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸胱氨酸和酪氨酸n n合成法：合成法：DL-DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。n n传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高本高,工艺复杂工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。难以达到工业化生产的目的。现在学习的是第8页，共96页n n生产氨基酸的大国为日本和德国。n n日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。n n日本在美国、法国等建
7、立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。现在学习的是第9页，共96页n n国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖湖北八峰氨基酸公司北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。难于与国外抗衡。n n在在8080年代中后期年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品产品,1991,1991年销售量为二千万瓶年销售量为二千万瓶,1996,1996年达六千万瓶年达六千万瓶,主主
8、要厂家有无锡华瑞要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯北京费森尤斯,昆明康普莱特昆明康普莱特,但生但生产原料都依赖进口。产原料都依赖进口。n n据专家估计据专家估计,到到20002000年年,世界氨基酸产值可达世界氨基酸产值可达4545亿美元亿美元,占生物技术市场的占生物技术市场的7%,7%,国内的氨基酸产值可达国内的氨基酸产值可达4040亿亿元元,占全国发酵产业总产值的占全国发酵产业总产值的12%12%。现在学习的是第10页，共96页氨基酸发酵生产发展的历史回顾氨基酸发酵生产发展的历史回顾n n所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养微生物,积累特定的氨基酸。n n这些方法成立的一个
9、重要原因是使用选育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。现在学习的是第11页，共96页菌株的育种菌株的育种n n从自然界中筛选有产酸能力的菌株从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件并建立其培养条件.n n在在确确立立突突变变技技术术和和阐阐明明氨氨基基酸酸生生物物合合成成系系统统调调节节机机制制的的基基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。n n随随着着重重组组DNADNA技技术术的的发发展展,接接合合、转转导导、转转染染、细细胞胞融融合合等等手手段段首首先先用用于于体体内内基基因因重重组组,是是早早期期用用基基因因重重组组方方法法构构建建
10、生生产菌株的尝试。产菌株的尝试。n n随随着着载载体体、受受体体系系统统的的构构建建及及体体外外基基因因重重组组技技术术的的日日益益完完善善,氨氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。n n苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。现在学习的是第12页，共96页2.1用野生株的方法用野生株的方法 n n这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。n n典型的例子就是谷氨酸发酵。n n改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵 现在学习的是第13页，共9
11、6页2.2用营养缺陷变异株的方法用营养缺陷变异株的方法n n这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起控制作用。n n这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。现在学习的是第14页，共96页2.3类似物抗性变异株的方法类似物抗性变异株的方法n n用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。n n利用此方法发酵的有:
12、苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。现在学习的是第15页，共96页2.4 体内及体外基因重组的方法体内及体外基因重组的方法n n基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。因重组方法。n n体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条DNADNA链之间引起链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象
13、。两次以上的交叉，是遗传性重组现象。n n细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。缘关系的微生物之间进行并较难成功。现在学习的是第16页，共96页n n代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上，应代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上，应用重组用重组DNADNA技术可以改变代谢途径分支点上的流量技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代谢网络。或引入新的代谢步骤与构建新的代谢网络。n n其主要步骤为其主要步骤为:n n鉴定目标代谢途径涉及的酶鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶特
14、别是限速酶););n n取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如定取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点(增强增强活性或稳定性、解除反馈抑制等活性或稳定性、解除反馈抑制等););n n将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物克隆进目标生物;n n使调节元件的作用及培育条件最优化。使调节元件的作用及培育条件最优化。现在学习的是第17页，共96页氨基酸发酵的代谢控制氨基酸发酵的代谢控制n n控制发酵的条件n n控制细胞渗透性n n控制旁路代谢n n降
15、低反馈作用物的浓度n n消除终产物的反馈抑制与阻遏作用n n促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成现在学习的是第18页，共96页控制发酵的条件控制发酵的条件n n专性需氧菌，控制环境条件可改变代谢途径和产物。现在学习的是第19页，共96页控制细胞渗透性控制细胞渗透性生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。现在学习的是第20页，共96页控制旁路代谢控制旁路代谢现在学习的是第21页，共96页降低反馈作用物的浓度降低反馈作用物的浓度n n利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。限制精氨酸的浓度可解除反馈
16、抑制，实现鸟氨酸的生物合成。现在学习的是第22页，共96页消除终产物的反馈抑制与阻遏作用消除终产物的反馈抑制与阻遏作用n n使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法。是一种与初级代谢产物结构类似但缺乏生理功能的化合物。n n例1：黄色短杆菌AHVr突变株可解除Thr的反馈抑制而积累苏氨酸现在学习的是第23页，共96页 Brevibacterium flavum(AK)现在学习的是第24页，共96页 Threonine AHV a-Amino-b-hydroxyvaleric acid a-氨基-b-羟戊酸现在学习的是第25页，共96页筛选突变株中常用的几种结构类似物筛选突变株中常用的几种结构类似物积
17、累的物质积累的物质积累的物质积累的物质 结构类似物结构类似物结构类似物结构类似物 Arg Arg 刀豆氨酸刀豆氨酸 Phe Phe 对对-氟苯丙氨酸、噻恩基丙氨酸氟苯丙氨酸、噻恩基丙氨酸 Trp 5-Trp 5-甲基色氨酸、甲基色氨酸、6-6-甲基色氨酸甲基色氨酸 Val Val a a-氨基丁酸盐氨基丁酸盐 Ile ValIle Val Met Met a a-氨基氨基-4-4-乙硫基丁酸乙硫基丁酸 腺嘌呤腺嘌呤 2,6-2,6-二氨基嘌呤二氨基嘌呤 尿嘧啶尿嘧啶 5-5-氟尿嘌呤氟尿嘌呤现在学习的是第26页，共96页促进促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成的积累，以利氨基酸的生物合成n
18、nATP的积累可促进氨基酸的生物合成现在学习的是第27页，共96页氨基酸发酵的工艺控制氨基酸发酵的工艺控制n n培养基n npHn n温度n n氧现在学习的是第28页，共96页培养基培养基n n1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃 碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类现在学习的是第29页，共96页2、氮源：铵盐、尿素、氨水；n n同时调整pH值。n n营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液。n n需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。n n尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。n n
19、氨水用pH自动控制连续流加现在学习的是第30页，共96页n n3、合适C/Nn n氮源用于调整pH。n n合成菌体n n生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的C/N高。现在学习的是第31页，共96页n n4、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。n n5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。n n6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。现在学习的是第32页，共96页n n7、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。n n8、锰：是许多酶的激活剂。n n9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，
20、可促进谷氨酸产生菌的生长。n n10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。现在学习的是第33页，共96页n n生长因子：生物素生长因子：生物素 作用：影响细胞膜透性和代谢途径。作用：影响细胞膜透性和代谢途径。浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。过浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢，发酵周期长。少菌体生长缓慢，发酵周期长。与其它培养条件的关系：氧供给不足，生物素过与其它培养条件的关系：氧供给不足，生物素过量时，发酵向其它途径转化。量时，发酵向其它途径转化。种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为来源。来源。现在学习的是第3
21、4页，共96页pH对氨基酸发酵的影响及其控制对氨基酸发酵的影响及其控制n n作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。n n控制pH方法：流加尿素和氨水n n流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。现在学习的是第35页，共96页n n控制：控制：n n（1 1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免免pHpH过高过高n n（2 2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。制菌体生长。n n（3 3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少
22、加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。尿素，以免造成氨基酸提取困难。n n（4 4）氨水对）氨水对pHpH影响大，应采取连续流加。影响大，应采取连续流加。现在学习的是第36页，共96页温度对氨基酸发酵的影响及其控制温度对氨基酸发酵的影响及其控制n n菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。n n菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。n n采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等，促进菌体生长。现在学习的是第37页，共96页氧对氨基酸发酵的影响及其控制氧对氨基酸发酵的影响及其控制n n要求供氧充足的谷氨
23、酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。n n适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最大。n n供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵现在学习的是第38页，共96页谷氨酸谷氨酸生产工艺生产工艺n n工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。制取。n n19571957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。大创举，使发酵工业进入调节代
24、谢的调控阶段。n n目前世界产谷氨酸钠目前世界产谷氨酸钠3030吨吨/年，占氨基酸总量的年，占氨基酸总量的2/32/3。n n我国现已有我国现已有200200余家生产，年产量达余家生产，年产量达1515万吨，居世界万吨，居世界首位。首位。现在学习的是第39页，共96页n n产生菌株特点：n n革兰氏阳性n n不形成芽胞n n没有鞭毛，不能运动n n需要生物素作为生长因子n n在通气条件下才能产生谷氨酸。现在学习的是第40页，共96页现在学习的是第41页，共96页谷氨酸生物合成机理及代谢控制谷氨酸生物合成机理及代谢控制n n谷氨酸生物合成机理：n n由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢
25、酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到。现在学习的是第42页，共96页三、谷氨酸的发酵现在学习的是第43页，共96页1.谷氨酸生产菌中存在2个糖酵解途径EMP/HMP生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变丙酮酸积累乳酸积累2.-酮戊二酸脱氢酶缺失TCA环阻断，-酮戊二酸积累现在学习的是第44页，共96页3.四碳二羧酸的来源在生产菌中检出CO2固定反应酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶 谷氨酸对糖的转化率达到81.7%DCA循环标志酶：异柠檬酸裂解酶在谷氨酸发酵中，DCA环一方面可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充 在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量
26、作用谷氨酸生成期中要封闭DCA环？通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为54.4%现在学习的是第45页，共96页TCA 的补充途径（DCA循环）I 乙醛酸循环（TCA 循环支路）（异柠檬酸裂合酶）（异柠檬酸裂合酶）（乙酰（乙酰-CoACoA合成酶）合成酶）（苹果酸合成酶）苹果酸合成酶）乙酰-CoA异柠檬酸琥珀酸 +乙醛酸乙酸苹果酸现在学习的是第46页，共96页4.异柠檬酸脱氢酶活力强提供NADPH,用于还原-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系5.氨的导入合成谷氨酸的反应有3种：-酮戊二酸+NH4+NADPH+谷氨酸H2ONADP+谷氨酸脱氢酶-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸
27、转氨酶谷氨酸-酮戊二酸+-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶现在学习的是第47页，共96页生产菌中谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重视谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶氨的导入时生物素缺乏，NH4+影响糖代谢速度：提高糖代谢速度高效合成谷氨酸生物素充足时，NH4+不影响糖代谢速度6.谷氨酸合成的调节机制谷aa比天冬aa优先合成谷aa脱氢酶谷aa对其反馈抑制和反馈阻遏柠檬酸合成酶TCA的关键酶，受能荷调节，谷aa反馈阻遏，乌头酸反馈抑制异柠檬酸脱氢酶-酮戊二酸反馈抑制-酮戊二酸脱氢酶先天丧失或微弱PEP受天冬aa反
28、馈抑制，受谷aa和天冬 aa反馈阻遏现在学习的是第48页，共96页7.细胞膜通透性控制现在学习的是第49页，共96页生物素阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成表面活性剂对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成现在学习的是第50页，共96页 谷氨酸积累的理想途径，应具备：谷氨酸积累的理想途径，应具备：（1 1）一定的糖酵解速度，不能走向乳酸等的发酵。）一定的糖酵解速度，不能走向乳酸等的发酵。（2 2）生成丙酮酸后，一部分氧化脱羧生成乙酰）生成丙酮酸后，一部分氧化
29、脱羧生成乙酰CoACoA，一部，一部分固定分固定COCO2 2生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰CoACoA在柠檬酸合成酶作催化作用下，缩合成柠檬酸，在柠檬酸合成酶作催化作用下，缩合成柠檬酸，再经下面的氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。再经下面的氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。（3 3）生成的乙酰）生成的乙酰CoACoA不向脂肪酸途径转化，全部趋于合不向脂肪酸途径转化，全部趋于合成柠檬酸。成柠檬酸。现在学习的是第51页，共96页（4）-酮戊二酸氧化能力微弱，即不转化为琥珀酸，而成为马蹄形不完整的三羧酸环。（5）异柠檬酸裂解酶活性弱，即不形成二羧酸环。
30、（6）异柠檬酸脱氢酶活性强。现在学习的是第52页，共96页（7）L-谷氨酸脱氢酶活性强，在NH3存在下，由-酮戊二酸转化为谷氨酸。（这点特别重要）（8）NADPH再氧化能力欠缺。谷氨酸菌有两种该类酶，即异柠檬酸脱氢酶和L-谷氨酸脱氢酶。（9）造成强的细胞膜透性，以便克服终产物反馈抑制和阻遏，使生产菌产生的谷氨酸不断地渗到细胞外进入培养基中。现在学习的是第53页，共96页谷氨酸发酵过程谷氨酸发酵过程n n一、淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解一、淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解n n1 1、调浆：干淀粉用水调成、调浆：干淀粉用水调成10-11Bx10-11Bx的淀粉乳，加盐酸的淀粉乳，加盐酸0.5
31、-0.80.5-0.8至至pH1.5pH1.5。n n2 2、糖化：蒸汽加热，加压糖化、糖化：蒸汽加热，加压糖化25min25min。冷却至。冷却至8080下中和。下中和。n n3 3、中和：烧碱中和，至、中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0pH4.0-5.0n n4 4、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.6-0.80.8，在，在7070度及酸性条件下搅拌后过滤。度及酸性条件下搅拌后过滤。现在学习的是第54页，共96页n n酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用n n大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化
32、，85 30min，加糖化酶60 糖化24h，过滤后可供配制培养基。现在学习的是第55页，共96页n n糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。n n 预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中青霉素。现在学习的是第56页，共96页 二、菌种扩大培养n n1 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。菌属、小杆菌属、节杆菌属。n n 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。棒
33、杆菌及各种诱变株。n n 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。生长因子。n n 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2pH7.0-7.2琼脂培养基，琼脂培养基，3232培养培养18-24h18-24h。现在学习的是第57页，共96页n n2 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8pH6.5-6.8。1000ml1000ml装装200-25
34、0ml200-250ml振荡，振荡，3232 培养培养12h12h。n n3 3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的料体积的1 1，用水解糖代替葡萄糖，于，用水解糖代替葡萄糖，于3232 进行通进行通气搅拌气搅拌7-10h7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为个或八字排列。活菌数为10108 8-10-109 9/ml/ml。现在学习的是第58页，共96页三、发酵三、发酵n n1 1、适应期
35、：尿素分解出氨使、适应期：尿素分解出氨使pHpH上升。糖不利用。上升。糖不利用。2-4h2-4h。n n 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。n n2 2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pHpH上升，上升，氨被利用氨被利用pHpH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。的八字形。不产酸。12h12h。n n 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH
36、pH，在，在pH7.5-8.0pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度时流加尿素；维持温度30-3230-32现在学习的是第59页，共96页n n3 3、菌体生长停止期：谷氨酸合成。、菌体生长停止期：谷氨酸合成。n n 措施：提供必须的氨及措施：提供必须的氨及pHpH维持在维持在7.2-7.47.2-7.4。大量通。大量通气，控制温度气，控制温度34-37 34-37。n n4 4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。n n 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。n n发酵周期一般为发酵周期一般为30h30h。现
37、在学习的是第60页，共96页谷氨酸发酵控制谷氨酸发酵控制n n（1 1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰酶乙酰CoACoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响磷酯的合成。响磷酯的合成。n n当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。n n生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显
38、增多。谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。现在学习的是第61页，共96页怎样克服生物素过量带来的问题怎样克服生物素过量带来的问题为了控制生物素的数量，除了选用的菌种必须是生物素缺陷型以外，所用的原料（主要是玉米浆）每批都要通过摇床实测后确定加入量。当前还有一些措施可以使用。现在学习的是第62页，共96页 1 1、选用油酸缺陷型：选用油酸缺陷型：在大量的研究工作中，发现了这样的现象，即培养基在大量的研究工作中，发现了这样的现象，即培养基中缺乏生物素时，只要加入油酸，就能起到和生物素相同中缺乏生物素时，只要加入油酸，就能起到和生物素相同的效果。如上所述，生物素的作用在于影响细胞膜中的脂的效果。
39、如上所述，生物素的作用在于影响细胞膜中的脂肪酸，而油酸的加入直接增加了合成磷脂所需的不饱和脂肪酸，而油酸的加入直接增加了合成磷脂所需的不饱和脂肪酸，所以选育油酸缺陷型就成为了重要的替代手段。当肪酸，所以选育油酸缺陷型就成为了重要的替代手段。当选用油酸缺陷型时，只要控制油酸的亚适量，就能控制细选用油酸缺陷型时，只要控制油酸的亚适量，就能控制细胞膜的透性，而与生物素的含量无关。胞膜的透性，而与生物素的含量无关。现在学习的是第63页，共96页 2 2、选用甘油缺陷型：、选用甘油缺陷型：试验证明，限量甘油（试验证明，限量甘油（0.02%0.02%）培养，细胞膜的磷）培养，细胞膜的磷脂含量只有非甘油缺陷
40、型菌株的脂含量只有非甘油缺陷型菌株的50%50%。只有甘油的加入。只有甘油的加入量起作用，而与生物素以及油酸的含量无关。量起作用，而与生物素以及油酸的含量无关。这些现象都可以解释一个问题，那就是因为磷这些现象都可以解释一个问题，那就是因为磷脂是由脂肪酸、甘油、磷酸和脂是由脂肪酸、甘油、磷酸和R R（胆碱、乙醇酸、丝（胆碱、乙醇酸、丝氨酸、肌醇）氨酸、肌醇）4 4部分组成，缺少其中的一个都不可能和成，部分组成，缺少其中的一个都不可能和成，控制其中之一，都可以控制磷脂的含量。控制其中之一，都可以控制磷脂的含量。图图6-46-4现在学习的是第64页，共96页现在学习的是第65页，共96页 3、温度敏
41、感性变异株：当细菌进行诱变处理后，可以获得温度敏感性变异株。例如在30C时生长旺盛，而在较高温度（37C）则不生长，或稍生长，而能大量生成谷氨酸。于是可用这样的变异株在富含生物素的培养基中，前期进行30C培养，当菌的生长达到最大时，提高温度至40C，使其大量积累谷氨酸。现在学习的是第66页，共96页 4 4、在生物素丰富的条件下，添加聚氧乙烯乙二醇的棕榈在生物素丰富的条件下，添加聚氧乙烯乙二醇的棕榈酸（酸（C18C18）、十七烷酸（）、十七烷酸（C17C17）、硬脂酸（）、硬脂酸（C16C16）等的饱）等的饱和脂肪酸酯类或饱和脂肪酸，都能使大量谷氨酸排出和脂肪酸酯类或饱和脂肪酸，都能使大量谷氨
42、酸排出于菌体外。表面活性剂、高级饱和脂肪酸的作用，不于菌体外。表面活性剂、高级饱和脂肪酸的作用，不在于它的表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成过程在于它的表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成过程中，作为抗代谢物具有抑制作用，对生物素或油酸又中，作为抗代谢物具有抑制作用，对生物素或油酸又拮抗作用，阻遏脂肪酸生物合成，于是磷脂形成减少，拮抗作用，阻遏脂肪酸生物合成，于是磷脂形成减少，膜透性加大，有利于谷氨酸向外渗漏。膜透性加大，有利于谷氨酸向外渗漏。现在学习的是第67页，共96页 5 5、在生物素丰富时，培养中途如果添加青霉素、头、在生物素丰富时，培养中途如果添加青霉素、头孢霉素孢霉素C C，可以使谷
43、氨酸生成。青霉素的作用机制，可以使谷氨酸生成。青霉素的作用机制与控制生物素、控制油酸或添加表面活性剂以及控与控制生物素、控制油酸或添加表面活性剂以及控制甘油的机制都不同。添加青霉素是抑制细菌细胞制甘油的机制都不同。添加青霉素是抑制细菌细胞壁的后期合成，对细胞壁糖肽生物合成系统起作用。壁的后期合成，对细胞壁糖肽生物合成系统起作用。这是因为青霉素取代合成糖肽的底物而和酶的活性这是因为青霉素取代合成糖肽的底物而和酶的活性中心结合，使网状结构连接不起来，结果形成不完中心结合，使网状结构连接不起来，结果形成不完全的细胞壁。没有细胞壁保护的细胞膜由于膜内外全的细胞壁。没有细胞壁保护的细胞膜由于膜内外的渗透
44、压差，是细胞膜受到机械损伤，失去了作为的渗透压差，是细胞膜受到机械损伤，失去了作为渗透障碍物的作用，从而使谷氨酸排出。另一种解渗透障碍物的作用，从而使谷氨酸排出。另一种解释是：青霉素虽不能抑制磷脂的合成，但能造成磷释是：青霉素虽不能抑制磷脂的合成，但能造成磷脂向胞外分泌。表脂向胞外分泌。表6-5 6-5 现在学习的是第68页，共96页现在学习的是第69页，共96页n n（2 2）种龄和种量的控制）种龄和种量的控制n n一级种子控制在一级种子控制在11-12h11-12h，二级控制在，二级控制在7-8h7-8h。n n种量为种量为1 1。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，。过多，菌体娇嫩，不
45、强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。后期产酸量不高。现在学习的是第70页，共96页n n（3）pH。n n发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵慢，长菌不长酸。n n谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2，转氨酶最适pH 7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。过高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。现在学习的是第71页，共96页 （4）温度：谷氨酸菌的最适生长温度与产物生成所需温度不同。发酵前期菌体生长繁殖所需温度为3032C 。前期温高，菌种容易衰老。后期是酶的作用温度，要比前期高。菌体增殖到稳定期，适当提高温度有利于产酸。因此，后期温度可在 C
46、现在学习的是第72页，共96页n n（5）通风：不同种龄、种量，培养基成分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。n n在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。n n在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积累a-酮戊二酸。现在学习的是第73页，共96页 （6 6）氨：谷氨酸生产菌除利用氨作为氨源合成菌体）氨：谷氨酸生产菌除利用氨作为氨源合成菌体蛋白脂外，大部分是生成谷氨酸所需。因此谷氨酸发蛋白脂外，大部分是生成谷氨酸所需。因此谷氨酸发酵中，加入的尿素等氨源比较大。根据测定结果，当酵中，加入的尿素等氨源比较大。根据测定结果，当：时，只合成菌体，几
47、乎：时，只合成菌体，几乎不积累谷氨酸；当：以上时，开不积累谷氨酸；当：以上时，开始积累谷氨酸。加入的氮量中，作为菌体固定的只有始积累谷氨酸。加入的氮量中，作为菌体固定的只有，而作为积累谷氨酸用。，而作为积累谷氨酸用。在生产上通过控制：，促进以生长为主的阶段向在生产上通过控制：，促进以生长为主的阶段向以发酵为主的阶段转化是必要的。在一定的时间里，以发酵为主的阶段转化是必要的。在一定的时间里，流加一定量氮源，不仅加速了糖的消耗，也加速了谷流加一定量氮源，不仅加速了糖的消耗，也加速了谷氨酸的积累。氨酸的积累。现在学习的是第74页，共96页 当缺乏时，积累酮戊二酸，适量时积累谷氨酸，如果太高，发酵液在
48、，谷氨酸会进一步生成谷酰胺。现在学习的是第75页，共96页 （7）磷酸盐：磷酸盐是谷氨酸发酵所必需的。但不能过高，否则转向氨酸发酵。现在学习的是第76页，共96页n n防止噬菌体和杂菌的污染n n从空气过滤、培养基、设备、环境等环节严格把关。现在学习的是第77页，共96页四、谷氨酸的提取四、谷氨酸的提取1、等电点法：操作简单，收率60。周期长，占地面积大。谷氨酸在水中的接力常数；，故等电点时的为：现在学习的是第78页，共96页现在学习的是第79页，共96页n n2、离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。n n用强酸性阳离子树脂（）氢型
49、吸附后，用C的洗脱。树脂再生用。现在学习的是第80页，共96页 三、双柱法：将发酵液先通过弱酸性阳离子交换树脂（氢型），以处去阳离子杂志（，等），不吸附谷氨酸。再通过磺酸性阳离子交换树脂，以吸附谷氨酸，用碱液洗脱谷氨酸（第二柱），因浓度集中，谷氨酸含量可达到。再分别用酸使第一柱和第二柱进行再生。现在学习的是第81页，共96页 四、盐酸盐法：发酵液中除含谷氨酸外，尚有一定量的谷氨酰胺以及焦谷氨酸，用等电点以及离子交换提取均无法回收，可用盐酸水解来提高收率。盐酸水解时也使菌体蛋白水解成氨基酸并可使碳水化合物破坏，生成腐殖质而被除去，提高水解液质量，利用谷氨酸盐在浓盐酸中溶解度低而将谷氨酸与其它杂质
50、分离。现在学习的是第82页，共96页 五、锌盐法：利用谷氨酸锌在水溶液中的溶解度低的原理，将发酵液中谷氨酸一次进行回收。现在学习的是第83页，共96页现在学习的是第84页，共96页 六、直接浓缩法：适用于醋酸为原料发酵生产谷氨酸。七、离子交换膜电渗法。现在学习的是第85页，共96页谷氨酸发酵研究新进展谷氨酸发酵研究新进展n n继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或可在富含生继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或可在富含生物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利用率，拓物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。宽原料来源或简化操作工艺。n n生物工程新技术