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1、药物分析第十六章抗药物分析第十六章抗生素类药物的分析生素类药物的分析1 1第1页，此课件共59页哦Contents概 述1-内酰胺类2氨基糖苷类3四环素类4高分子杂质检查52 2第2页，此课件共59页哦第一节第一节 概述概述在低微浓度下即可对某些生物（病在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称的化学物质的总称定义定义定义定义3 3第3页，此课件共59页哦4 4第4页，此课件共59页哦抗生素药物的分类抗生素药物的分类5 5第5页，此课件共59页哦6 6第6页，此课件共59页哦7 7第7页，此课件共59页哦抗菌药物的主要作用
2、部位抗菌药物的主要作用部位抗菌药物的主要作用部位抗菌药物的主要作用部位喹诺酮类喹诺酮类林可霉素类林可霉素类氨基糖苷类氨基糖苷类酮康唑酮康唑环丝氨酸环丝氨酸利福平利福平红霉素红霉素制霉菌素制霉菌素杆菌肽杆菌肽甲氧苄胺嘧啶甲氧苄胺嘧啶四环素类四环素类两性霉素两性霉素B万古霉素万古霉素磺胺药磺胺药氯霉素氯霉素多粘菌素类多粘菌素类-内酰胺类内酰胺类核酸合成核酸合成细胞蛋白合成细胞蛋白合成细胞膜渗透性细胞膜渗透性细胞壁细胞壁8 8第8页，此课件共59页哦细菌的耐药机制细菌的耐药机制9 9第9页，此课件共59页哦细菌的耐药机制细菌的耐药机制产生钝化酶使抗菌药物失效产生钝化酶使抗菌药物失效产生钝化酶使抗菌药
3、物失效产生钝化酶使抗菌药物失效药物作用靶位的结构和数量改变药物作用靶位的结构和数量改变药物作用靶位的结构和数量改变药物作用靶位的结构和数量改变抗菌药不易与细抗菌药不易与细抗菌药不易与细抗菌药不易与细菌结合菌结合菌结合菌结合主动外排机制主动外排机制主动外排机制主动外排机制药物被泵出菌体外药物被泵出菌体外药物被泵出菌体外药物被泵出菌体外1010第10页，此课件共59页哦产品稳定性差产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解后分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作疗效下降、失效或增加毒副作用用发酵过程不易控制易受污染发酵过程不易控制易受污染生产工艺复杂生产工艺复杂发酵液中杂质发酵液中杂质 无
4、机盐、脂肪、各种蛋白质、无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、各种降解产物、色素、热原、毒性物质毒性物质 抗生素质量的复杂性抗生素质量的复杂性 1111第11页，此课件共59页哦 鉴别：鉴别：理化方法理化方法(主要方法主要方法)、微生物法、微生物法官能团的显色反应，如：官能团的显色反应，如：-内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应；素的麦芽酚反应、坂口反应；光谱法：红外光谱及紫外吸收光谱的鉴别。光谱法：红外光谱及紫外吸收光谱的鉴别。色谱法：色谱法：HPLCHPLC和和TLCTLC法，采用标准品对照品对照法；法，采用标准品对照品对照法；生物
5、学法：比较抑菌能力，现已少用。生物学法：比较抑菌能力，现已少用。抗生素质量分析抗生素质量分析1212第12页，此课件共59页哦 检查：检查：影响产品稳定性的检查项目：结晶性、酸碱度、水分或者干燥影响产品稳定性的检查项目：结晶性、酸碱度、水分或者干燥失重等失重等控制有机和无机杂质的项目：溶液澄清度与颜色、有关物质、残控制有机和无机杂质的项目：溶液澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等；留溶剂、炽灼残渣、重金属等；与临床安全性有关的检查项目：异常毒性、热源或细菌与临床安全性有关的检查项目：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌等内毒素、降压物质、无菌等1313第13页，此课件共5
6、9页哦 效价：效价：效价：效价：每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。由单位（每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。由单位（每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。由单位（每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。由单位（u u u u）或微克（）或微克（）或微克（）或微克（gggg）表示。）表示。）表示。）表示。各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的。各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的。各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的。各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的。1mg1mg1mg1mg青霉素钠定为青霉素
7、钠定为青霉素钠定为青霉素钠定为1670167016701670单位；单位；单位；单位；1mg1mg1mg1mg庆大霉素定为庆大霉素定为庆大霉素定为庆大霉素定为590590590590单位。单位。单位。单位。相应的盐可以通过分子量与标准盐类进行换算。相应的盐可以通过分子量与标准盐类进行换算。相应的盐可以通过分子量与标准盐类进行换算。相应的盐可以通过分子量与标准盐类进行换算。抗生素活性表示方法抗生素活性表示方法1414第14页，此课件共59页哦含量/效价测定：微生物法：与临床疗效吻合与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大广；但操作复杂费时
8、，误差大 理化方法：准确度与专属性较高准确度与专属性较高,且操作简便；但与临且操作简便；但与临床疗效有偏差床疗效有偏差1515第15页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类6-aminopenicillanic acid简简称称6-APA青霉素类7-aminocephalosporanic acid,简称7-ACA头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻唑环氢化噻嗪环氢化噻嗪环1616第16页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类 青霉素青霉素(苄青霉素苄青霉素)(penicillins)氨苄西林氨苄西林阿莫西林阿莫西林1717第17页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类头孢
9、氨苄头孢氨苄头孢拉定头孢拉定头孢羟氨苄头孢羟氨苄头孢噻吩钠头孢噻吩钠1818第18页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类1.酸性（羧基）酸性（羧基）pKa 2.5-2.8，酸性，酸性较较强强。碱金属。碱金属盐盐水溶性好，有水溶性好，有机碱机碱盐难盐难溶于水。溶于水。2.手性手性C（旋光性）（旋光性）1919第19页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类3.UV青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构260nm2020第20页，此课件共59页哦4.内酰胺环内酰胺环(四元环张力+酰胺键)第二节第二节 内酰胺类内酰胺类干燥条件较稳定，溶液不稳定干燥条件较稳定，溶液不稳定某
10、些氧化剂、金属离子、温度某些氧化剂、金属离子、温度2121第21页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类(一一)色谱法色谱法HPLC(tR)TLC(Rf)(二)光谱法IR UVNMR2222第22页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类2323第23页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类(三)呈色反应1 1）羟肟酸铁反应）羟肟酸铁反应内酰胺环内酰胺环内酰胺类NH2OHHClNaOH羟肟酸 Fe3+H+显色（红、棕、褐）2 2）类似肽键（）类似肽键（-CONH-CONH-）a.a.茚三酮反应茚三酮反应-氨基氨基 2424第24页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰
11、胺类内酰胺类b.b.双缩脲反应双缩脲反应内酰胺类内酰胺类 碱性酒石酸铜紫色2525第25页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类3 3）其他呈色反应）其他呈色反应（偶合）青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)各种盐的反应焰色反应K+、Na+2626第26页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类(聚合物、有关物质、异构体等)1.聚合物头孢他啶中聚合物测定头孢他啶中聚合物测定分子排阻色谱分子排阻色谱凝胶色谱分子筛机制凝胶色谱分子筛机制 主成分自身主成分自身对对照法照法 面面积归积归一化法一化法 限量法限量法 自身自身对对照外照外标标法法 萄聚糖凝胶萄聚糖凝胶立体网状结构图立体网状结构
12、图2727第27页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类2.有关物质与异构体有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 取本品适量，精密称定，加流动相制成约含0.25mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成2.5 g/ml的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，其中E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)，3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1
13、.5%)，其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。(供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计)2828第28页，此课件共59页哦青霉素青霉素钠钠(钾钾)的吸光度的吸光度检查检查：本品加水制成每本品加水制成每1mL含有含有1.80mg的溶液，照的溶液，照UV-Vis法，法，在在280nm波波长处测长处测定吸光度，不得大于定吸光度，不得大于0.10；在；在264nm波波长处长处有最大吸收，吸光度有最大吸收，吸光度应为应为0.80-0.88.该该法法264nm处处吸收吸收值值用来控制青霉素用来控制青霉素钠钠(钾钾)的含量，的含量，280nm处处吸收吸收值值用来控制用
14、来控制杂质杂质的含量。的含量。3.UV第二节第二节 内酰胺类内酰胺类2929第29页，此课件共59页哦第二节第二节 内酰胺类内酰胺类4.有机溶剂：用GC法或者HPLC法5.结晶性第一法(偏光显微镜法)第二法(X射线粉末衍射法)3030第30页，此课件共59页哦u 碘量法u 汞量法u 酸碱滴定法u 羟肟酸比色法u HPLC法第二节第二节 内酰胺类内酰胺类3131第31页，此课件共59页哦阿莫西林克拉维酸钾片色色谱谱条条件件与与系系统统适适用用性性试试验验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.
15、40.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5 测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。第二节第二节 内酰胺类内酰胺类3232第32
16、页，此课件共59页哦第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类 碱性环己多元醇碱性环己多元醇+氨基糖氨基糖苷苷链霉素链霉素(Streptomycin)3333第33页，此课件共59页哦巴龙霉素巴龙霉素(paromomycin)D-D-葡萄糖胺脱氧链霉胺葡萄糖胺脱氧链霉胺巴龙胺巴龙胺D核糖巴龙霉糖核糖巴龙霉糖巴龙二糖胺巴龙二糖胺第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类3434第34页，此课件共59页哦庆大霉素庆大霉素(Gentamycin)3535第35页，此课件共59页哦1 1）溶解度（氨基、羟基）：水溶性）溶解度（氨基、羟基）：水溶性2 2）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐；溶于水，但不溶）碱性（氨基）：临
17、床应用其硫酸盐；溶于水，但不溶于有机溶剂；于有机溶剂；3 3）旋光性（糖）：多个手性碳）旋光性（糖）：多个手性碳4 4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解；临床）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解；临床使用时对使用时对pHpH值有很高的要求；值有很高的要求；5 5）紫外吸收光谱）紫外吸收光谱第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类3636第36页，此课件共59页哦1.1.茚三酮反应茚三酮反应羟基胺类羟基胺类,-,-氨基酸氨基酸第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类3737第37页，此课件共59页哦2.Molisch 试验 五碳糖或六碳糖结构红紫色羟甲基糠醛(含含六碳糖六碳糖结构氨基糖结构氨基糖苷类酸性水
18、解产物苷类酸性水解产物)a.a.a.a.-萘酚萘酚萘酚萘酚b.b.b.b.萘酮萘酮萘酮萘酮蓝紫色第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类3838第38页，此课件共59页哦3.N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类3939第39页，此课件共59页哦4.麦芽酚反应链霉糖特有反应H+第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类4040第40页，此课件共59页哦紫红紫红麦芽酚麦芽酚4141第41页，此课件共59页哦5.坂口反应链霉胍特有反应（或或-萘酚萘酚）4242第42页，此课件共59页哦坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖
19、胺反应第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类4343第43页，此课件共59页哦6.硫酸盐反应7.色谱法：TLC和HPLC法8.光谱法：IR、UV第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类4444第44页，此课件共59页哦1.链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查来源：发酵中产生方法：TLC中的对照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC)3.庆大霉素C组分的测定第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类4545第45页，此课件共59页哦微生物检定法微生物检定法平行反应，检测同等量下供试品和对照品对微生物的抑制作用；平行反应，检测同等量下供试品和对照品对微生物的抑制作用；管碟法：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作
20、用，比较标准品管碟法：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品和供试品对菌群产生的抑菌圈大小；和供试品对菌群产生的抑菌圈大小；浊度法：通过抗生素在液体培养基中对细菌生长的抑制作用，通浊度法：通过抗生素在液体培养基中对细菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品和供试品抑菌程度，过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品和供试品抑菌程度，测定供试品效价；测定供试品效价；-该法优点：灵敏度高、量少、直观；与临床要求一直；使该法优点：灵敏度高、量少、直观；与临床要求一直；使用范围广；是效价测定的最基本方法；目前分子结构复杂、用范围广；是效价测定的最基本方法；目前分子结构复杂、多
21、组分抗生素，首选该法测效价。多组分抗生素，首选该法测效价。-该法缺陷：操作步骤多，时间长，误差大。该法缺陷：操作步骤多，时间长，误差大。第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类4646第46页，此课件共59页哦HPLC法法有紫外吸收有紫外吸收紫外、紫外、荧荧光光检测检测器器无紫外吸收无紫外吸收衍生化；衍生化；电电化学化学检测检测器或蒸器或蒸发发光散射法光散射法第三节第三节 氨基糖苷类氨基糖苷类4747第47页，此课件共59页哦第四节第四节 四环素类四环素类ABCD123456789101112四个并苯或萘并萘四个并苯或萘并萘4848第48页，此课件共59页哦1）两性：）两性：-OH酸性酸性 N(CH
22、3)2碱性碱性 Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；生成不溶性盐；Fe3+形成红色配合物；形成红色配合物；Al3+形成黄色配合物形成黄色配合物；pH3 7.5 多价阳离子与酚二酮多价阳离子与酚二酮荧光荧光 与酸、碱均可成盐；临床多用盐酸盐；强酸或强碱中溶解度 2）旋光性）旋光性3）与金属离子络合）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基酚羟基、烯醇基)第四节第四节 四环素类四环素类4949第49页，此课件共59页哦4）UV和荧光和荧光 盐酸土霉素 经酸或碱降解，呈绿色荧光，加热转为蓝色；盐酸金霉素 经碱降解，呈蓝色荧光；盐酸四环素 经碱降解，呈黄色荧光。可区别不同四环素类抗生素5050第50页，此课件共59
23、页哦弱酸性（弱酸性（pH2-6）A环环C-4异构化异构化 差向四环素差向四环素酸性（酸性（pH 2）C环脱水环脱水 脱水四环素脱水四环素碱性碱性 C环开环，形成内酯环开环，形成内酯 异四环素异四环素5）不稳定性A.A.差向异构化差向异构化蓝色荧光淡黄黑第四节第四节 四环素类四环素类5151第51页，此课件共59页哦AApH2.06.0（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）第四节第四节 四环素类四环素类5252第52页，此课件共59页哦B.B.酸性酸性脱水脱水降解降解max=445nmmax=435nmDDDCBBCBC第四节第四节 四环素类四环素类5353第53页，此课件共59页哦C.C.碱
24、性碱性脱水脱水降解降解OH-第四节第四节 四环素类四环素类5454第54页，此课件共59页哦1、HPLC2、TLC(正相分配薄层色谱正相分配薄层色谱)薄层板中加入薄层板中加入EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象克服痕量金属造成的拖尾现象3、IR4、UV：最大吸收波长和制定浓度下的吸光度；：最大吸收波长和制定浓度下的吸光度；5、显色法、显色法浓硫酸浓硫酸三氯化铁三氯化铁第四节第四节 四环素类四环素类5555第55页，此课件共59页哦5656第56页，此课件共59页哦1.1.有关物质有关物质HPLC2.2.杂质吸光度杂质吸光度UV淡黄色淡黄色淡黄色淡黄色黑色黑色黑色黑色脱水四环素脱水四环素脱水四环素
25、脱水四环素 橙红色橙红色橙红色橙红色差向脱水四环素差向脱水四环素差向脱水四环素差向脱水四环素 砖红色砖红色砖红色砖红色第四节第四节 四环素类四环素类5757第57页，此课件共59页哦第五节第五节 高分子杂质的检查高分子杂质的检查高分子杂质：药物中分子量大于药物本身的杂质的总称，高分子杂质：药物中分子量大于药物本身的杂质的总称，高分子杂质：药物中分子量大于药物本身的杂质的总称，高分子杂质：药物中分子量大于药物本身的杂质的总称，10005000Da10005000Da。与过敏反应有关。与过敏反应有关。与过敏反应有关。与过敏反应有关。生产过程贮存过程使用不当高分子杂质内源性(药物自身聚合物)外源性(蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物)发酵过程控制重点来源来源5858第58页，此课件共59页哦1.1.基本结构基本结构青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核参于反应侧链参于反应头孢菌素族与母核有关的N型聚合反应侧链参与反应的L型聚合反应第五节第五节 高分子杂质的检查高分子杂质的检查5959第59页，此课件共59页哦