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1、分子生物学在微生物检验中的应用第1页，本讲稿共27页分子诊断学分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。第2页，本讲稿共27页分子诊断学三个阶段3 3个阶段：个阶段：（1 1）利用）利用DNADNA分子杂交技术进行遗传病的基因分子杂交技术进行遗传病的基因诊断
2、；诊断；（2 2）以）以PCRPCR技术为基础的技术为基础的DNADNA诊断，特别是定诊断，特别是定量量PCRPCR和实时和实时PCRPCR的应用，不仅可以检测存在的应用，不仅可以检测存在于宿主的多种于宿主的多种DNADNA和和RNARNA病原体载量，还可检病原体载量，还可检测多基因遗传病细胞中测多基因遗传病细胞中mRNAmRNA的表达量；的表达量；（3 3）以生物芯片（）以生物芯片（biochipbiochip）技术为代表的高）技术为代表的高通量密集型检测技术，生物芯片技术包括基通量密集型检测技术，生物芯片技术包括基因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等。因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等。第3页，本讲
3、稿共27页荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对对PCRPCR产物进行标产物进行标 记跟踪记跟踪,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进结合相应的软件可以对结果进行分析行分析,计算待测样品的初始模板量。计算待测样品的初始模板量。荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR仪仪仪仪 光定量光定量PCRPCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的的PCRPCR仪仪,通常配有电脑系统及相应
4、的分析软件。通常配有电脑系统及相应的分析软件。第4页，本讲稿共27页荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR标记方法标记方法标记方法标记方法 内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I 序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)Amplifluor(Intergen)第5页，本讲稿共27页5353SGSGSGSGSGExcitationEmissio
5、nSYBR-Green ISYBR-Green I 第6页，本讲稿共27页Oligo 1:FluoresceinOligo 2:LC Red 640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递（荧光共振能量传递（FRET Probe）第7页，本讲稿共27页RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation双标记探针（双标记探针（Taqman Probe）第8页，本讲稿共27页Taqman探针3端Q荧光分子能够吸收5端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5端荧光分子发出的荧光,只能检测到3端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产
6、物(模板)时,探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5外切酶活性,将探针5端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)第9页，本讲稿共27页RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标（Molecular Beacon Probe）第10页，本讲稿共27页引物特异性探针（引物特
7、异性探针（Amplisenor Probe）第11页，本讲稿共27页535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特异性探针（引物特异性探针（Amplifluor Probe）第12页，本讲稿共27页荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时PCRPCR与普通与普通与普通与普通PCRPCR的比较的比较的比较的比较 实时在线监控实时在线监控实时在线监控实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加能够实时地观察到产物的增加,直观直观地看到反应的对数期地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降
8、低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了提高了PCRPCR反应反应的特异性的特异性 增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性 全程监控全程监控,准确的算法进行定量准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便,无需跑胶无需跑胶无需跑胶无需跑胶 第13页，本讲稿共27页基因和蛋白质芯片原理基因芯片(gene chip)也称为DNA微距阵(DNAmicroarray)、DNA芯片(DNA chip)等。它是指将大量靶基因或寡
9、核苷酸片段有序地高密度地排列固定于玻片、硅片等固相载体上，然后与待测的标记样品的基因按碱基互补配对原理进行杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，再经计算机软件处理，从而获取大量的信息。第14页，本讲稿共27页基因微阵列技术优势 基因微阵列技术作为一种高通量的检测新技术,可以同时检测数以万计的生物分子，现在已经广泛应用于各个方面，其中包括病原生物的监控和诊断。发现未知病原体。例如确定SARS-CoV应用了基因微阵列技术。第15页，本讲稿共27页目前国内外蛋白质芯片或基因芯片产品的进展目前国内外蛋白质芯片或基因芯片产品的进展情况情况国外:赛弗吉生物系统公司（纳斯达克代码：CIPH）的蛋
10、白质芯片系统已经通过了中国国家食品药品监督管理局（SFDA）的医疗设备审批。这也是广谱仪器第一次在中国被批准作为一种医疗设备使用。affymetrix 公司开发出测P53基因是否有突变以判断患癌症可能性的P53芯片，能诊断药物代谢缺乏症的细胞色素P450芯片.在病原体的检测方面,成功的例子有HBV、丙型肝炎病毒HCV、甲型肝炎病毒（HAV）、庚型肝炎病毒（HGV）、巨细胞病毒（CMV）、梅毒、弓形虫、结核杆菌等多种病原体的诊断基因芯片.另外血液RD 等25 种红细胞抗体系统以及高血压病因,血管内皮细胞生长因子（VEGF）和人促黄体生成激素（hLH）等也都有了诊断基因芯片。在肿瘤方面,蛋白质芯片
11、已成功地应用于诊断白血病、乳腺癌、心力衰竭等疾病的诊断,诊断用的抗体芯片有霍乱毒素、葡萄球菌内毒素B、蓖麻蛋白和枯草杆菌球体的诊断.最近，siemens公司、fraunhofer硅工艺研究院和infineon公司正在开发电化学生物芯片诊断系统.第16页，本讲稿共27页国内:上海数康生物科技有限公司研制开发的“多肿瘤标志物蛋白质芯片诊断系统”于2001年12月获得国家卫生行政部门颁发的新药证书和试生产批文。本实验室采用该诊断系统对12种肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖原199(CA199)、糖原242(CA242)、糖原(CA125)、糖原153(CA153)、神经元特异性烯
12、醇化酶(NSE)、前列腺特异抗原(PSA)、游离前列腺特异抗原(f-PSA)、铁蛋白(FER)、-人绒毛膜促性腺激素(-HCG)，人生长激素(HGH)含量进行定量分析,测定9种肿瘤(如卵巢肿瘤,肝癌等).第17页，本讲稿共27页 由上海裕隆生物科技有限公司及曲阜裕隆生物科技有限公司研发丙型肝炎病毒分片段抗体检测试剂盒（蛋白芯片）能够同时检测血清或血浆中抗HCVCore、抗HCVNS3、抗HCVNS4、抗HCVNS5以及上述四种抗体的总抗体5项指标，突破了传统的丙型肝炎酶联免疫吸附（ELISA）法检测试剂盒一次只能检测初筛指标抗HCV总的局限，而采血量仅为ELISA法的1/5，具有丙型肝炎感染初
13、筛和确诊的双重功能，并能反映丙型肝炎感染、治疗和愈后状况。此外，该试剂盒还具有检测特异性强、灵敏度高、平行性好、成本低、操作简单快速、自动化程度高等优点。2004年6月24日获国家食品药品监管局颁发的新药证书。这标志着我国生物芯片技术向临床免疫检测领域的又一次成功突破。瑞芯生物科技有限公司已成功开发出乙型肝炎基因多态性检测芯片、丙型肝炎基因分型检测芯片、结核分支杆菌耐药性检测芯片、地中海贫血症检测芯片等产品.第18页，本讲稿共27页建立基因芯片技术平台探针设计探针制备探针点片样本处理杂交条件标记方法结果分析平行比较第19页，本讲稿共27页等温扩增技术 RCA(Rolling Circle Am
14、plification)LAMP(loop-mediated isothermalamplification)NASBA(Nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)第20页，本讲稿共27页未知病原体检测新技术 高通量测序 DNADNA再（重）测序芯片 多重PCRPCR和质谱联用第21页，本讲稿共27页未知病原体检测-高通量测序I IROCHE购买了454GS 2.0，GS FLX454生命科学公司在测序过程中采用了纳米材料，使测序速度提高了100倍。该生命科学公司利用皮升（picolitre）级反应器进行测序，虽然这种新的测序方法单个反应的读
15、取碱基数和准确率都不及毛细管电泳法，但是由于一次反应数量巨大，所以总体上取得了高速的突破。150-200bp(GS 2.0),0.1GB300-500bp(GS FLX)1GB每小时600Mbp(100600Mbp(100倍SangerSanger法)一个人一台机器100100天内轻松地完成3030亿bp(3G)bp(3G)第22页，本讲稿共27页ILLUMINA买了SOLEXA;Solexa技术:Illumina Genome Analyzer测序仪基本原理：可逆性末端终结反应四种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应颜色后，该
16、保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反复，得出碱基的精确序列1735bp的序列1GB第23页，本讲稿共27页ABI买了AGENCOURTSolid 系统寡核苷酸连接和检测原理60bp4GB第24页，本讲稿共27页未知病原体检测新技术-Affymetrix基因芯片技术Affymetrix基因芯片技术是基因芯片领域的国际行业标准,已经为国际生命科学和医学、植物及微生物等基础研究领域广泛认可,利用该基因芯片技术作为主要研究手段之一在国际科学杂志发表的论文近4000篇,仅在Nature,Science和Cell等影响因子非常高的杂志发表的论文就数百篇.第25页，本讲稿共27页再测序芯片技术用于分
17、子诊断举例：1）劳伦斯伯克利国家实验室和防御科学技术实验室利用AFFY基因芯片技术在9个小时内一次鉴定3200种(微)生物.可以快速分类和定量分析环境样品中的原核和真核(微)生物.2）美国CDC在利用AFFYMETRIX公司开发的天花病毒再测序芯片来鉴定和分类数以百计的天花病毒株系。通过对更多的分离物测序，科学家可以更容易地把病原体亚型和患者结果关连起来，并了解哪个亚型是毒力最强的等问题。3）Affymetrix和英国Health Protection Agency(HPA)共同开发了区分脑膜炎球菌不同株系的再测序芯片，芯片上代表了不同亚型脑膜炎球菌的基因组序列，可以成功分类以往方法可以分类的45个样品，及把以往方法不能分类的12个样品划分到现有的脑膜炎球菌种类里，分析时间仅需要一天。4）Affymetrix正在开发生物反恐芯片，该技术可以鉴定National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)圈定的最致命的26种细菌、10种病毒的数百个亚型/株系，还可以鉴定56种细菌毒素基因和62种抗生素耐药基因。第26页，本讲稿共27页甲流变异第27页，本讲稿共27页