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1、第一部分核酸的制备分离纯化本讲稿第一页，共二十三页核酸的制备（分离、纯化）一、总论二、以质粒DNA为例谈DNA的分离纯化三、以真核生物为代表介绍总RNA的纯化四、核酸的进一步纯化（聚乙二醇、氯化铯梯度离心本讲稿第二页，共二十三页问题：分离核酸的基本依据、方法？核酸分离主要需要注意的是什么？DNA和RNA分离时的主要差别？本讲稿第三页，共二十三页不同的生物体中，核酸所处的环境不尽相同：1、核酸与蛋白质结合紧密程度不同。2、DNA与RNA含量有差别。3、核酸分子量大小有差别。4、.由于核酸性质基本相同，生物体所组成的成分基本相同，因此，对于不同的生物体核酸的分离方法相差不大。本讲稿第四页，共二十三
2、页以上是常见核苷酸结构，中性PH下的离子状态的钠盐形式。结构决定性质，性质是分离的基础。本讲稿第五页，共二十三页核酸的结构特点：分子巨大，有共扼双键、氢键、苷键、和磷酸二酯键，自由氨基、磷酸基。核酸的二级结构：DNA双螺旋结构；RNA大多为单链，链的许多区域或自身发生回折，回折区内的多核苷酸段呈螺旋结构。本讲稿第六页，共二十三页核酸性质核酸性质与其结构和组分是密切相关的分子量大小：RNA和DNA的分子量都很大。RNA分子量104-106 或者更大。DNA分子量1.6106-2.2 109。性状和溶解度：DNA多为白色纤维状固体。RNA为白色粉末。都微溶于水，他们的钠盐在水中溶解度较大，都溶于2
3、-甲氧乙醇，但不溶于一般有机溶剂（如：乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等）。吸收光谱：具有共扼双键的嘌呤和嘧啶，故皆具有独特的紫外吸收光谱。核酸在240-260nm的紫外波段有强烈的吸收峰。最大吸收值在260nm附近。通过OD260/OD280 的比值可判断样品的纯度。纯DNA的OD260/OD280=1.8，纯RNA的OD260/OD280=2.0。核酸中若含杂蛋白或苯酚则比值明显降低。对于纯核酸样品只要读出260nm的OD值，即可算出含量，通常：1OD260=50ug/ml（双螺旋DNA）、1OD260=40ug/ml（单螺旋DNA或RNA）、1OD260=20ug/ml（寡核苷酸）。变性
4、：加热、强酸碱或射线及一切可破坏核酸分子氢键的处理。变性后的核酸理化性质、生物功能都会有显著变化，最重要表现为粘度下降。降解：酸、碱、核酸酶都可使核酸不同程度的降解。本讲稿第七页，共二十三页分离核酸共同要考虑的防止核酸变性与降解：低温操作。分离过程需加入必要的核酸解聚酶的抑制剂（如：乙二胺四乙酸（EDTA）、柠檬酸盐、皂土、8-羟基喹啉、SDS、苯酚等）脱蛋白：在生物体内核酸常与蛋白质结合以核蛋白形式存在，核酸所处的任何生物环境都含有蛋白质，所以在核酸纯化过程中需使用脱蛋白剂。（如：氯仿、苯酚、SDS、蛋白酶等使蛋白质降解或变性，达到与核酸分离的目的。DNA和RNA的分离：1、利用DNA和RN
5、A在不同盐浓度下，溶解度不同进行分离（DNA在1-2M时溶解度大，RNA溶解度小。相反，RNA在低盐浓度0.14M时溶解度大，DNA小。）2、通过使用DNA或RNA酶，达到DNA和RNA分离的目的。3、根据分子量不同，进行梯度离心，进行分离。核酸的收集：多用乙醇、异丙醇本讲稿第八页，共二十三页质粒DNA纯化细菌培养 从LB琼脂扳上挑取一个单菌落。接种到含有适当抗生素的20ml液体LB中。37摇床培养过夜（OD 0.6）。将上述培养液转入500ml含抗生素的液体LB培养基中。37 300rpm 约34hr（OD =0.4）。加入2.5ml 氯霉素（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170ug/
6、ml。300rpm 37 继续培养 1216hr。离心 4 4000rpm 15min。弃上清。将细菌沉淀重悬于100ml预冷的STE中。离心 4 4000rpm 15min。弃上清，收集细菌细胞。LB培养基 Trypone 10g Yeast extract 5g NaCl 10g 加水至1L STE：0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.CL（PH8）1mmol/L EDTA（PH8）本讲稿第九页，共二十三页1、酚提取法：将收获的细胞重悬在20ml含20蔗糖的TES中。加入新鲜配制的溶菌酶到终浓度为1mg/ml（枯草杆菌和大肠杆菌）或5mg/ml（苏芸金杆菌）。37保温3
7、090分钟，原生质游离出来。向 原 生 质 溶 液 中 加 8SDS20ml和5M NaCl 10ml。68保温5min。将溶液储于4冰箱，8hr以上或过夜。取出后，立即在4离心18000rpm,30min。取上清。向上清中加入等体积的重蒸酚（PH67），轻摇。置冰箱15min，离心取水相。重复一次。再用等体积的氯仿异戊醇（24：1）抽提12次。离心取水相。加入等体积的乙醚抽提12次。向水相加两倍体积95冷乙醇。20过夜或70半小时。离心15000rpm,20min,沉淀DNA。75的乙醇洗涤一次，室温或真空干燥。沉淀溶于PH8的TE缓冲液中。本讲稿第十页，共二十三页2、碱裂解法 将细菌沉淀重
8、悬于10ml Slution 1中。加入1ml新配制的溶菌酶。加入20ml新配制Slution 2，充分混匀。放置510min(0)。加入15ml预冷的Slution 3 混匀 置冰上10min 离心，4，10000rpm/min,15min 取上清并加入0.6倍体积的异丙醇充分混匀 室温放置10分钟 离心，室温5000rpm,15min 弃上清，用70乙醇洗涤弃乙醇，干燥。用3ml TE(PH8)溶解核酸沉淀可用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心或聚乙二醇沉淀继续纯化 Slution I 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L TrisCl(PH8)10mmol/L EDTA(PH8)Sluti
9、on20.2mol/L NaOH(用时用 10mol/L储存液稀释)1SDS Slution35mol/L乙酸钾60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml 本讲稿第十一页，共二十三页3、煮沸裂解法：将细菌沉淀物重悬于预冷的10ml STET中 加入1ml(10mg/ml,溶于10mmol/L Tris,PH8)新配制的溶菌酶 室温下放置10分钟明火加热至沸腾，并不停摇晃 立即将其浸入沸水中40秒 再将其浸入冰水中5分钟 离心，4 15000rpm,30min 取上清，用乙醇或异丙醇沉淀 可继续用氯化铯溴化乙锭梯度离心纯化 STET 0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(
10、PH8)1mmol/L EDTA(PH8)5TritonX100 本讲稿第十二页，共二十三页4、SDS裂解法：将细菌沉淀物重悬于10ml，预冷的10蔗糖，50mmol/L Tris.Cl(PH8)溶液中 加入新配制的溶菌酶溶液加入8ml 0.25mol/L EDTA(PH8)溶液，摇匀。置冰上10分钟加4ml 10%SDS,马上用玻璃棒迅速混匀内容物。立即加入6ml 5mol/L NaCl(使终浓度为1M混匀。置冰上 1hr离心 15000rpm,30min取上清 酚：氯仿和氯仿各抽提一次取水相，并加两倍体积乙醇，混匀。放置室温下12小时 离心，4 5000rpm 20min。弃上清，用70乙
11、醇洗涤离心，4 5000rpm 20min，取沉淀。用3ml TE(PH8)溶解DNA可用氯化铯溴化乙锭梯度离心继续纯化本讲稿第十三页，共二十三页DNA继续纯化聚乙二醇沉淀法纯化DNA：取3ml 溶于TE中的核酸溶液，加入3ml 预冷5mol/L LiCl溶液，充分混匀。离心，4 10000rpm 10min 取上清并加入等体积的异丙醇，混匀。离心，室温，10000rpm 10min弃上清，用70乙醇洗涤沉淀保 留 沉 淀 并 用500ul含 胰RNA酶（20ug/ml）的TE（PH8溶解沉淀。室温放置半小时 加入500ul含13（W/V）聚乙二醇的1.6mol/LNaCl，充分混匀。离心，4
12、 12000rpm 5min去上清，保留沉加入400ul TE(PH8)溶解沉淀 用酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次 取水相并加入100ul 10ml/L乙酸铵 混匀，并加入两倍体积乙醇室温放置10min离心，4 12000rpm 5min回收沉淀加入200ul 4的70乙醇，混匀。弃上清，等乙醇蒸发殆尽500ul TE（PH8溶解沉淀储存DNA于20或70本讲稿第十四页，共二十三页DNA继续纯化1、氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA（连续梯度离心法精确测量DNA溶液的体积按1g/ml的用量加入固体CsCl加热至30并温和混匀。每10ml DNA溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/m
13、l溶于水立即将其于DNA氯化铯溶液混匀离心，室温8000rpm 5min将下层清亮红色溶液转移到适当的离心管中用轻石蜡油加满，并封口。离心，20 45000rpm 16hr结果本讲稿第十五页，共二十三页DNA继续纯化收集闭环DNA从DNA中除去溴化乙锭2、不连续梯度离心：此方法是将不同浓度的CsCl溶液分层加到离心管中，这样可加速CsCl梯度的形成，使离心时间减少到6hr。本讲稿第十六页，共二十三页从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭方法1：有机溶剂抽提 将DNA溶液放入试管中加等体积的饱和1丁醇或异戊醇振荡混匀两相离心，室温 1500rpm 3min取水相反复抽提46次直到粉红色从水相中和有
14、机相中消失。本讲稿第十七页，共二十三页从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭方法2：离子交换层析如图所示，用吸管装一支Dowex AG50树脂的柱子（装柱前需将树脂进行平衡）。平衡方法如下：1、适量Dowex AG50树脂溶于100ml 1mol/L NaOH中，搅拌5分钟，待树脂沉淀后，吸出上清弃去。2、加100ml 1mol/L HCl，继续搅拌5分钟，树脂沉淀后，吸出上清弃去。3、用水重复步骤两次（每次100ml），然后用TEN缓冲液（100ml）重复步骤2一次。TEN缓冲液：（0.1mol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.01mol/L EDTA(pH8.0)，1 mol/L Na
15、Cl）4、于4将树脂储存于含0.2%叠氮钠的TEN缓冲液中。吸去树脂上的缓冲液，用2倍体积的TE（Ph8.0）洗柱，将含有溴化乙锭和氯化铯的DNA直接加到树脂上。收集流出物，当所有DNA溶液进入柱子后，用1.2倍柱体积洗脱，同时继续收集流出物。柱子流干后，将收集的流出物用2倍体积的水稀释。用6倍体积的乙醇，于4下，沉淀DNA15分钟。4，1200转/分离心15分钟，收集DNA沉淀。用4的70%乙醇洗沉淀，按上步重新离心，取沉淀。用适量TE（pH8.0）溶解DNA。本讲稿第十八页，共二十三页RNA纯化中很重要的一个任务是：严格控制RNA酶的活性！因为，所有的组织、人的手指、试剂、容器等中均存在或
16、被污染RNA酶，所以，在对RNA纯化前，需做大量的准备工作。常使用的RNA酶的抑制剂：（1）焦碳酸二乙酯（DEPC）：它是RNA酶的化学修饰试剂。它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活。（2）异硫氰酸胍（GITC）：目前认为是制备RNA最有效的抑制剂。它除了对RNA酶有强烈的变性作用外，还具有使细胞结构破坏，核酸从核蛋白中解离的作用。（3）钒氧核苷酸复合物：是氧化钒离子和任何核苷形成的复合物。可与RNA酶结合，而 抑制酶活。（4）RNA酶抑制蛋白：是一种对RNA酶有抑制作用的蛋白质。其它如肝素、DTT、SDS等都是RNA酶的抑制剂，在RNA提纯中经常使用本讲稿第十九页，共二十三页动
17、物组织总RNA的制备 一、试剂：变性液（储存于棕色瓶中）：配制体积：52.8ml 终浓度 储存液 异硫氰酸胍 4M 25g 柠檬酸钠 25mM 0.75M(pH7.0)1.76ml 十二烷基氨酸钠 0.5%10%(warm to 65)2.64ml DEPC-ddH2O 29.3ml 以上混合液可放置室温下3个月。用前加入0.36ml巯基乙醇。加入巯基乙醇后，室温下可使用1个月。其于常规试剂配制不列举。本讲稿第二十页，共二十三页方法：杀死小鼠，放血。迅速取出所需组织（按所需而定）用DEPC-ddH2O清洗一下，立即仍到液氮中。取4-5ml变性液入一洗净的研钵中备用从液氮中取出冻好的组织放入一不
18、锈钢研钵中，倒入一些液氮，将其碾碎。（在此过程中，需保证组织不解冻）也可在有变性液存在下用组织匀浆机进行破碎。将已碾成粉末的组织转移至放有变性液的研钵中，迅速研磨并不断加入液氮，反复如此，直至组织完全碾碎。取数个已灭菌的新EP管中，各加入0.5ml 变性液和组织匀浆每EP管中加入50ul 3.0M NaAc(pH4.7)混匀（轻弹）。每EP管中加入500ul 水饱和酚，加氯仿-异戊醇（49：1），100ul。旋涡混合器振动1分钟。冰浴 15分钟。12000转/分，4 20分钟。转移上层水相至另一EP管中。加等体积预冷的异丙醇 0/N（-20）。离心，12000转/分，20分钟。弃上清，沉淀溶于
19、200ul 变性液中。加入10.8ul 3M NaAc(pH4.5)加等体积水饱和酚及1/5体积的氯仿-异戊醇混合物旋涡混合1分钟，冰浴20分钟。离心 12000转/分，4 20分钟。转移水相至另一EP管中，加等体积异丙醇。-20 1小时。离心12000转/分，4 20分钟弃上清，沉淀加120ul变性液Vortex 溶解加等体积冷异丙醇，-20 1小时。离心12000转/分，4 20分钟弃上清，沉淀用75%乙醇悬浮离心12000转/分，4 10分钟弃上清，室温或真空干燥。用DEPC-ddH2O溶解RNA（检查RNA制备质量，测OD260/OD280用1-2ul样品电泳观察。）本讲稿第二十一页，
20、共二十三页在含有甲醛的凝胶中，进行RNA电泳是目前常用的方法。甲醛凝胶电泳缓冲液：20*硼酸缓冲液（pH8.3）5*MOPS缓冲液(避光保存)0.4M 硼酸 0.1mol/L MOPS(pH7)10mM EDTA 40mmol/L 乙酸钠 5mmol/L EDTA(pH8)凝胶制备（for 40ml of 1.5%agarose gel）：0.6g agarose ，2ml 20*broate buffer，3.3ml 甲醛电泳样品制备（体积：20ul）加入体积 终浓度RNA 4.5ul 1-30ul甲酰胺 10ul 50%甲醛 3.5ul 2.2M硼酸钠（pH8.3）20mM加样缓冲液 2 ul（在以上混合液中加入2ul灭菌的，并经DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液。甲醛凝胶加样缓冲液：（50%甘油，1mmol/L EDTA，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF）EB（1mg/ml）1ul 本讲稿第二十二页，共二十三页本讲稿第二十三页，共二十三页