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1、第二章色谱法导论第二章色谱法导论本讲稿第一页，共七十八页第一节第一节 概述概述1、色谱法的概念、色谱法的概念概念概念色谱法又称色层法、层析法，是用于多组分有机混合物的一种高效分离技术。特点特点选择性好、分离效能高、灵敏度高、分析速度快等优点。先进性先进性 已逐步实现仪器化、自动化、高速化，并从分离手段发展到分析手段，应用范围不断扩大，分离的对象早已不限于有色物质，但“色谱法”这一名称一直被沿用。范围范围色谱法与现代新检测技术和计算机技术相结合，已广泛食品质量与安全等的有关工作，如样品中农药残留量的测定、农副产品分析、食品质量检验、生物制品的分离制备等。本讲稿第二页，共七十八页2、色谱法的起源、
2、色谱法的起源1906年，俄国植物学家茨维特首创了这种分离技术，他把植物叶绿体色素的石油醚浸渍液倒入一根装有碳酸钙吸附剂的细直玻璃柱中，再加入纯石油醚，任其自由流下，原混合物开始被分离成不同颜色的谱带(色素的分离)，且以不同速度通过子，然后按谱带颜色对混合物进行鉴定分析。茨维特把这种分离结果称为色谱图，把这种分离方法命名为色谱法（chromatography）。此后，出现了种类繁多的各种色谱法。本讲稿第三页，共七十八页3、色谱法的本质、色谱法的本质色谱法共同的基本特点是具备两个相：不不动动的的一一相相，称称为为固固定定相相；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相另一相是携带样品流过固定相
3、的流动体，称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在在性性质质和和结结构构上上的的差差异异，与固定相相相互互作作用用的的类类型型、强强弱弱也也有有差差异异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞滞留留时时间间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。色谱法是基于混合物各组分在两相色谱法是基于混合物各组分在两相(固定相和流动相固定相和流动相)之间的不均之间的不均匀分配进行分离的一种方法。匀分配进行分离的一种方法。目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。本讲稿第四页，共七
4、十八页Temporal course色谱分离色谱分离淋洗液淋洗液慢慢中等中等快快本讲稿第五页，共七十八页4、色谱法的分类、色谱法的分类（1）按两相状态分类气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC），气固色谱（GSC）固定相是固体吸附剂；气液色谱（GLC）固定相是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体）。液体为流动相的色谱称液相色谱（LC），液固色谱（LSC）；液液色谱（LLC）。超临界流体超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。本讲稿第六页，共七十八页本讲稿第七页，
5、共七十八页（2）按分离机理分类l吸附色谱法：利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法。l分配色谱法：利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法。l离子交换色谱法：利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法。l凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法：利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法。l亲和色谱法：最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术，常用于蛋白质的分离。本讲稿第八页，共七十八页a.吸附色谱法原原理理:被分离物与吸附剂表面分子相互作用而被吸附，由于不同化合物结构及性质上的差异
6、，在吸附剂上的吸附性能是不同的，在色谱分离过程中，用一定的溶剂系统洗脱柱子时，由于溶剂(洗脱剂)与混合物里各组分争夺吸附剂的活性表面，解吸出来的组分与溶剂始终存在着对吸附剂的竞争吸附，洗脱剂对不同的物质的洗脱能力也是不同的。特特点点:因此吸附与解吸始终贯穿整个色谱过程，吸附与解吸是吸附色谱法的理论基础。吸附过程无选择性，吸附与解吸附过程可逆，但吸附强弱和先后顺序都基本遵循“相似相吸附”的经验规律。吸附力最弱的组分随溶剂首先流出。常用极性吸附剂常用极性吸附剂:硅胶、氧化铝、聚酰胺。本讲稿第九页，共七十八页本讲稿第十页，共七十八页b.分配色谱原理原理:将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等载体上作为固定相
7、，再用与固定相不相混溶的另一相溶剂作为流动相，物质可在两相溶剂相对做逆流移动过程中不断进行动态分配而得以分离。分类分类:正相色谱：固定相采用强极性溶剂，如水、缓冲溶液等，流动相则用氯仿等弱极性溶剂，称之为正相(normalphase)色谱；反相色谱：以弱极性成分如石蜡油为固定相，流动相则以水、乙腈、甲醇强极性溶剂，则两相可以颠倒，称之为反相(reversephase)色谱，更适合于水溶性成分的分离。液液分配色谱的分离条件可以基于相应的正相及反相分配薄层层析结果加以选定。本讲稿第十一页，共七十八页c.离子交换色谱原理原理:以离子交换树脂或表面涂有液体离子交换树脂的固体颗粒为固定相，装在柱中，以水
8、或含水溶剂为流动相，使样品溶液流过交换柱，溶液中的中性分子及具有与离子交换树脂可交换基团相反电荷的离子通过柱子从柱底流出，而具有相同电荷的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上。规律：规律：由于不同离子与同一树脂交换能力不同，移动速度也不同，在柱上形成色谱带，另选一适当的洗脱剂(含有比吸附物质更活泼的离子)进行洗脱交换，可将吸附物质按先后顺序从柱上洗脱下来，即可实现不同组分物质的分离。范围：范围：主要用于分离氨基酸，生物碱，糖类化合物。本讲稿第十二页，共七十八页d.凝胶色谱法原理原理:也叫分子筛过滤，利用分子筛分离物质的一种方法。所用载体，如葡聚糖凝胶，是不溶于水，但可在水中膨胀的
9、球形颗粒，具有三维空间的网状结构。当在水中充分膨胀后装入层析柱中。加入样品，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部(即被排阻在凝胶颗粒外部)，所以在颗粒间隙移动，并随溶剂一起从柱底先流出，小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通过层析柱时阻力增大、流速变缓，较晚流出。分类分类:(1)葡聚糖凝胶(2)羟丙基葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)。本讲稿第十三页，共七十八页过程过程:样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入至凝胶颗粒内部的程度也不尽相同，故在经历一段时间流动并达到动态平衡，即按分子由大到小次序先后流出并得到分离。本讲稿第十四页，共七十八页e.亲
10、和色谱本讲稿第十五页，共七十八页(3)按固定相的外形分类固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中。本讲稿第十六页，共七十八页本讲稿第十七页，共七十八页第二节第二节 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语1、色谱流出曲线和色谱峰样品各组分在色谱柱中得到分离后随流动相依次流出色谱柱，先后到达检测器。经检测器把各组分的浓度信号转变成电信号，然后用记录仪或工作站软件将组分的信号记录下来，这种组分响应信号大小随时间变化所记录下来的曲线称为色谱流出曲线，也叫做色谱图。本讲稿第十八页，共七十八
11、页色谱图中曲线突起的部分称为色谱峰，由于响应信号的大小或强度与物质的量或物质的浓度成正比，色谱流出曲线实际上是物质的量或浓度时间曲线。本讲稿第十九页，共七十八页l如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：l式中：C不同时间t时某物质在柱出口处的浓度，C0进样浓度，tr保留时间，标准偏差。本讲稿第二十页，共七十八页2、基线在实验操作条件下，柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图中O-t线。它应该是一条直线，若是斜线就称为基线漂移，如果基线出现上下波动则称为噪声。保持基线平稳，是进行色谱分析的最基本要求。3、峰高色谱峰顶点与基线
12、之间的垂直距离，以h表示，如图中BA。是色谱定量分析的依据之一。本讲稿第二十一页，共七十八页4、保留值(retentionvalue)（1）死时间tm不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如图中OA。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均线速时，可用往长L与tm的比值计算。本讲稿第二十二页，共七十八页（2）保留时间tR试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图中的OB它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间本讲稿第二十三页，共七十八页（3）调整保留时间tR
13、 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即tR=tR-tm由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR实际上是组份在固定相中停留的总时间。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定本讲稿第二十四页，共七十八页（4）死体积Vm指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（mLmin）计算：Vm=tmF0(5)保留体积VR
14、指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积的关系：VR=tRF0本讲稿第二十五页，共七十八页（6）调整保留体积VR某组分的保留体积扣除死体积后，为该组分的调整保留体积VR=VR-Vm(7)相对保留值r2.1某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值：由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据。必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比。本讲稿第二十六页，共七十八页
15、5、选择因子在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值。此时，ri/s可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号表示：式中，tr(i)为后出峰的调整保留时间，所以这时总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。本讲稿第二十七页，共七十八页6、区域宽度色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：a.a.标准偏差标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图中
16、EF距离的一半。b.b.半峰宽半峰宽WW1/21/2即峰高一半处对应的峰宽，如图中GH间的距离它与标准偏差的关系是：W1/2=2.354c.c.峰底宽度峰底宽度WW即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图中IJ的距离。它与标准偏差的关系是：W=4在相同的色谱操作条件下获得色谱峰的区域宽度值越小，说明色谱柱的分离效能越好，柱效越高。本讲稿第二十八页，共七十八页7.峰面积由色谱峰与基线之间所围成的面积称为峰面积，用“A”表示，是色谱定量分析的基本依据，对理想的对称峰，峰面积与峰高，半峰宽的关系为A=1.065hW1/2。本讲稿第二十九页，共七十八页一组分的色谱流出曲线对色谱分析十分重要，从色谱
17、图上可以获得以下信息：（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数。（2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析。(3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析。（4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。本讲稿第三十页，共七十八页第三节第三节 色谱法基本原理色谱法基本原理l色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离。l组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。组分在两相间的分配系数决定的，即与色
18、谱过程的热力学性质有关。两组分分配系数相差越大，两色谱峰间的距离就越大。l但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。l因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。色谱分析的基本理论有两个：一个是以热力学平衡为基础的塔板理论；另一个是以动力学为基础的速率理论，两个理论相辅相成，较为满意地揭示了色谱分析中的有关问题和现象。本讲稿第三十一页，共七十八页1、分配系数K和分配比k（1）分配系数K分配色谱的分离
19、是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即分配系数是由组分和两相的热力学性质决定的。本讲稿第三十二页，共七十八页例：逆流分配色谱l取一系列试管，向1号管加入互不相溶的两种溶剂，A溶剂为上相（动相），B溶剂为下相（静相），体积相等。l加入物质Y（K=1）和物质Z（K=1/3）的混合物，各组分物质将按自己的分配系数在上下相中进行分配。l平衡后，将上相转移到2号管内，其中含有相同体
20、积的新下相，从1号转移来的样品将在2号管的上下相中再分配。l与此同时，向1号管内加入新的上相，这里也将发生样品的再分配。本讲稿第三十三页，共七十八页本讲稿第三十四页，共七十八页本讲稿第三十五页，共七十八页分配系数小的物质Z沿一系列分溶管的“移动”速度比分配系数大的物质Y快。那么它流出色谱柱。每一种物质在一系列分溶管中是相当集中的，分溶曲线呈峰形，只要使用足够数目的分溶管，继续进行分配，就可以使两峰彼此分来。一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时，转移次数越多，即分溶管数越多，其分溶曲线越集中，即峰形窄而高，有利于各物质的完全分离。本讲稿第三十六页，共七十八页（2）分配比k分配比又称容量因子
21、，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。本讲稿第三十七页，共七十八页滞留因子Rs分配比k值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以usu此两速度之比称为滞留因子Rs。它反映了组分在流动相中的分配比例数。例如，某组分完全不被固定相滞留，即该组分100分配在流
22、动相中。本讲稿第三十八页，共七十八页(3)分配系数K与分配比k的关系其中称为相比率相比率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为635；对毛细管柱，其值为60600。Cs，Cm分别为组分在固定相和流动相中的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积；Vs为柱中固定相的体积。本讲稿第三十九页，共七十八页(4)分配系数K及分配比k与选择因子的关系对A、B两组分的选择因子，用下式表示：上式表明：通过选择因子通过选择因子 把实验测量值把实验测量值k k与热力学性质的分配系数与热力学性质的分配系数K K直接联系起来，直接联系起来，对固定相的选择具有实际意义。如果两组分对固定相
23、的选择具有实际意义。如果两组分的的K K或或k k值相等，则值相等，则=1=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。本讲稿第四十页，共七十八页2、踏板理论最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，柱内由许多想像的塔板组成,沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。本讲稿第四十一页，共七十八页该理论假定：（i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。（ii
24、）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。（iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。（iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。为简单起见，设色谱往由5块塔板（n=5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r=1，2，n-l；某组分的分配比k=1。本讲稿第四十二页，共七十八页根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1g）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ms=mm故mm=ms=0.5。当一个板体积（lV）的载气
25、以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有mm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ms部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0.5，其中气液（或气固）两相各为0.25，而1号板上所含总量同样为0.5，气液（或气固）相亦各为0.25。塔板号r0123进样mm0.5ms0.5进气1Vmm0.250.25ms0.250.25进气2Vmm0.1250.250.125ms0.1250.250.125进气3Vmm0.0630.1880.1880.063ms0.0630.1880.1880.063本讲稿第四十三页，共七十八页按上述分配过程，对于n
26、=5，k=1，m=1的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气液两相中的总质量）见表：本讲稿第四十四页，共七十八页经N次转移后，在各塔板上组分含量的分布符合（ms+mm）N的二项式展开式。如N=4、k=1时，展开式为：mms s4 4+4m+4ms s3 3mmmm+6m+6ms s2 2mmmm2 2+4m+4ms smmmm3 3+m+mmm4 4对于各塔板上组分分布计算得到：0.063，0.25，0.375，0.25，0.063，由二项式展开的值与上表相一致。如果色谱柱的塔板数n大于50，组分在柱内就可得到较多次的平衡分配，如果以组分流出色谱柱的浓度或量为
27、纵坐标对相应的流出时间，作图，所得到的色谱流出曲线趋于正态分布。此时，进入色谱柱的流动相塔板体积数N已足够大，二项式分布完全可以用正态分布来表示。本讲稿第四十五页，共七十八页由塔板理论的流出曲线方程可导出理论塔板数n与色谱峰底宽度的关系。根据流出曲线的正态分布方程，可有另一表达式：m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。当V=Vr时，C值最大，即本讲稿第四十六页，共七十八页l由流出曲线方程可推出n与保留时间tr、半峰宽W1/2、峰底宽W的关系：l从而求得理论塔板高度H，即：l lL为色谱柱的长度本讲稿第四十七页，共七十八页l从上两式可以看出，色谱峰W越窄，塔板数n就越多，而理论塔板高度H
28、就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。l通常填充色谱柱的n103，H1mm。而毛细管柱n=105-106，H0.5mm。由于死时tm包括在tr中,而实际的tm不参与柱内分配,所计算的n值尽管很大，H很小,但与实际柱效能相差甚远。所以，提出把tm扣除，采用有效理论塔板数有效理论塔板数n neffeff和有效塔板高有效塔板高H Heffeff评价柱效能。本讲稿第四十八页，共七十八页l塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。l但由于它的某些基本假设并不完全符
29、合柱内实际发生的分离过程，例如，纵向扩散是不能忽略的。l它也没有考虑各种动力学因素对色谱柱内传质过程的影响，因此它不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用。本讲稿第四十九页，共七十八页3、速率理论1956年荷兰学者vanDeemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程提出了色谱过程动力学理论动力学理论速率理论。速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。vanDeemter方程的数学简化式为：
30、式中u为流动相的线速度；A，B，C为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。本讲稿第五十页，共七十八页(1)涡流扩散项在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散，形象地如图所示。本讲稿第五十一页，共七十八页l由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱出口的时间并不一致，引起色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：A2dp上式表明，A与填充物的平均直径平均直径d dp p的大小和填充不规则因子填充不
31、规则因子 有关，与流动相的性质、线速变和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此A0。本讲稿第五十二页，共七十八页（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱人口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。如图所示。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。本讲稿第五十三页，共七十八页分子扩散项系数为B2Dg式中是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dg为组分在流动相中扩散系数
32、（cm2s-1）。另外，纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此，为降低纵向扩散影响，要加大流动相流速。对于液相色谱，组分在流动相中的纵向扩散可以忽略。本讲稿第五十四页，共七十八页（3）传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论。a.气相色谱对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即CCgCl本讲稿第五十五页，共七十八页气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入
33、两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。对于填充柱，气相传质阻力系数Cg为：式中k为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比。本讲稿第五十六页，共七十八页液相传质过程是指组分从固定相的气-液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回气-液界面的传质过程。此时气相中组分的其他分子仍随载气不断向柱出口运动，于是造成峰形扩张。液相传质阻力系数C1为：由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数D1大，则液相传质阻
34、力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使C1增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离。虽然提高柱温可增大Dl，但会使k值减小，为了保持适当的Cl值，应控制适宜的柱温。本讲稿第五十七页，共七十八页将上面式总结，即可得气液色谱速率板高方程这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。本讲稿第五十八页，共七十八页b.液相色谱对于液液分配色谱，传质阻力系数（C）包含流动
35、相传质阻力系数（Cm）和固定相传质系数（Cs），即:CCmCs其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即:式中右边第一项为流流流流动动动动的的的的流动相中的传质阻力。当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀。m是由柱和填充的性质决定的因子。本讲稿第五十九页，共七十八页本讲稿第六十页，共七十八页右边第二项为滞留的滞留的滞留的滞留的流动相中的传质阻力。这是由于固定相的多孔性，会造成某部分流动相滞留在一个局部，滞留在固定相微孔内的流动相一般是停滞不动的。流动相中的试样分子要与固定相进行质量交换，必须首先扩散
36、到滞留区。如果固定相的微孔既小又深，传质速率就慢，对峰的扩展影响就大。sm是一系数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。液液色谱中固定相传质阻力系数（Cs）可用下式表示：本讲稿第六十一页，共七十八页综上所述，对液液色谱的VanDeemter方程式可表达为：该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。本讲稿第六十二页，共七十八页（4）流动相线速率对板高的影响a.LC和GC的H-u图表明，对于一定长度的柱子，柱效越高，理论塔板数越大，板高越小。但究竟控制怎样的线速度，才能达到最小板高呢？根据vanDeemter公
37、式分别作LC和GC的H-u图，见图（a）和（b）。由图（a）和（b）不难看出：LC和GC的H-u图十分相似，对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点；LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得；LC的板高最低点相应流速比起GC的流速亦小一个数量级，说明对于LC来说，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。本讲稿第六十三页，共七十八页b.分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献本讲稿第六十四页，共七十八页（5）固定相粒度大小对板高的影响固定相粒度对板高的影响是至关重要的。实验表明不同粒度，H-u曲线也不同（如图）：粒度越细，板高越小，并且受线速度影响
38、亦小。这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作固定相的根据。当然，固定相颗粒愈细，柱流速愈慢。只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。本讲稿第六十五页，共七十八页4、分离度右图说明了柱效和选择性对分离的影响。图中（a）两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都很差。图中（b）虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低。图中（c）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。本讲稿第六十六页，共七十八页由此可见，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引人一个综合性指标分分离离度度R R。分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总总分分离离效效能能
39、指指标标。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R1时，两峰有部分重叠；当R1时，分离程度可达98；当R15时，分离程度可达997。通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。本讲稿第六十七页，共七十八页l下图表示了不同分离度时色谱峰分离的程度。本讲稿第六十八页，共七十八页5、基本色谱方程分离度R的定义并没有反映影响分离度的诸因素。实际上，分离度受柱效（n）、选择因子()和容量因子（k）三个参数的控制。对于难分离物质对，由于它们的分配系数差别小，可合理地假设k1k2=k，W1W2W。最后推导整理出
40、基本色谱方程式：本讲稿第六十九页，共七十八页l在实际应用中，往往用neff。代替n，处理上式可得：l随后推导出基本色谱分离方程式又一表达式。1，没有戏！R1.5,全分离。本讲稿第七十页，共七十八页（1）分离度与柱效的关系由分离方程式看出，具有一定相对保留值的物质对，分离度直接和有有效效塔塔板板数数有关，说明有效塔板数能正确地代表柱效能。而分离方程式表明分离度与理理论论塔塔板板数数的关系还受热力学性质的影响。当固定相确定，被分离物质对的确定后，分离度将取决于n。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即本讲稿第七十一页，共七十八页虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。因
41、此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。（2）分离度与选择因子的关系由基本色谱方程式判断，当=1时，R=0，这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，大，选择性好。研究证明，的微小变化，就能引起分离度的显著变化。一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大值。本讲稿第七十二页，共七十八页（3）分离度与容量因子的关系l如果设：l则基本色谱分离方程式写成l由R/Q-k的曲线图看出：当k10时，随容量因子k增大，分离度的增长是微乎其微的。一般取k为210最宜。对于GC，通过提高温度，可选择合适的k值，以改进分离度。本讲稿第七十三页，共七十八页
42、l而对于LC，只要改变流动相的组成，就能有效地控制k值。它对LC的分离能起到立竿见影的效果（见图）。本讲稿第七十四页，共七十八页（4）分离度与分析时间的关系分离度与分析时间的关系下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系。设：则可得：本讲稿第七十五页，共七十八页（5）基本色谱分离方程式的应用基本色谱分离方程式的应用 在实际中，基本色谱分离方程式是很有用的公式，它将柱效、选择因子、分离度三者的关系联系起来了，知道其中两个指标，就可计算出第三个指标。本讲稿第七十六页，共七十八页l例1-1有一根lm长的柱子，分离组分1和2得到如图所示的色谱图。图中横坐标l为记录笔走纸距离。若欲得到R=1.2的分离度
43、，有效塔板数应为多少？色谱往要加到多长？本讲稿第七十七页，共七十八页l例1-2已知某色谱柱的理论塔板数为3600，组分A和B在该柱上的保留时间为27mm和30mm，求两峰的峰半宽和分离度。例1-3已知一色谱柱在某温度下的速率方程的A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳线速度u和最小塔板高H。l例1-4已知物质A和B在一个30.0cm柱上的保留时间分别为16.40和17.63分钟。不被保留组分通过该柱的时间为1.30分钟。峰宽为1.11和1.21mm，计算:(1)柱分辨本领;(2)柱的平均塔板数目;(3)塔板高度;(4)达到1.5分离度所需的柱长度;(5)在较长柱上把物质B洗脱所需要的时间。本讲稿第七十八页，共七十八页