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1、酶的定向进化酶的定向进化本讲稿第一页，共十四页酶分子的定向进化酶分子的定向进化（directed evolution）：模）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外体外进行酶基因的人工进行酶基因的人工随机突变随机突变，建立突变基建立突变基因文库因文库，在人工控制条件的特殊环境下，在人工控制条件的特殊环境下，定向定向选择选择得到具有优良催化特性的酶的得到具有优良催化特性的酶的突变体突变体的技的技术过程。术过程。属于蛋白质的属于蛋白质的非合理设计非合理设计，它，它不需事先了解不需事先了解酶的空间酶的空间结构和催化机制。结构和催化机制。本讲稿第二页，共
2、十四页4.6.1 定向进化的特点定向进化的特点适应面广；适应面广；目的性强；目的性强；效果显著。效果显著。本讲稿第三页，共十四页4.6.2 定向进化的原理定向进化的原理以很低的比率向目的基因中以很低的比率向目的基因中随机引入突变随机引入突变，构建突，构建突变库，凭借变库，凭借定向的选择方法定向的选择方法，选出所需性质的优化，选出所需性质的优化酶酶(或蛋白质或蛋白质)，从而排除其他突变体。，从而排除其他突变体。定向进化的定向进化的基本规则基本规则是是“获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体”。定向进化定向进化=随机突变随机突变+定向选择定向选择。本讲稿第四页，共十四页本讲稿第五页，共十四页4.
3、6.3 酶基因的随机突变酶基因的随机突变1、易错、易错PCR技术为代表的无性进化技术为代表的无性进化 无性突变无性突变：向：向单一酶分子单一酶分子基因内随机引入突变，基因内随机引入突变，制造突变酶库以便筛选。制造突变酶库以便筛选。易错易错PCR：从酶的：从酶的单一基因单一基因出发，在出发，在改变反应条改变反应条件件的情况下进行的情况下进行聚合酶链反应聚合酶链反应，使扩增得到的基，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。过程。反应条件：提高反应条件：提高Mg2+浓度；添加浓度；添加Mn2+；改变四种底物；改变四种底物浓度比等。浓度比
4、等。本讲稿第六页，共十四页易错易错PCR技术技术特点：操作简便，随机突变丰富。特点：操作简便，随机突变丰富。缺点：正突变基因少，需多次缺点：正突变基因少，需多次PCR。注意：控制好基因突变频率。注意：控制好基因突变频率。适用：较小基因的定向进化。适用：较小基因的定向进化。本讲稿第七页，共十四页2、DNA重排技术为代表的有性进化重排技术为代表的有性进化 DNA重排技术：重排技术：又称又称DNA改组技术，有性改组技术，有性PCR（sexual PCR）。从正突变基因文库中分离得）。从正突变基因文库中分离得到的同源到的同源DNA，用酶切割成随机片段，经过不加引，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次
5、物的多次PCR循环，使循环，使DNA的碱基序列重新排布而的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。引起基因突变的技术过程。本讲稿第八页，共十四页DNA改组原理改组原理本讲稿第九页，共十四页DNA改组技术改组技术特点：正突变频率高，进化速度快。特点：正突变频率高，进化速度快。注意：需多次进行。注意：需多次进行。本讲稿第十页，共十四页3、基因家族之间的同源重组、基因家族之间的同源重组 从自然界中存在的基因家族出发，利用它从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。改组实现同源重组。如：如：Stemmer等从等从4种微生物种微生物中选择编码头
6、孢菌素酶中选择编码头孢菌素酶的的4个同源基因个同源基因，对它们进行单独进化或同源重组进，对它们进行单独进化或同源重组进化。结果对化。结果对单基因进化单基因进化得到的突变酶中，对头孢羟得到的突变酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的羧氧胺的抗性最高的增加了增加了8倍倍，而用，而用家族同源重组家族同源重组进化进化的方法使抗性比其中两种微生物来源的天然酶提的方法使抗性比其中两种微生物来源的天然酶提高高270倍倍，比另外两种酶提高了，比另外两种酶提高了540倍倍。本讲稿第十一页，共十四页1、突变基因文库的构建、突变基因文库的构建定义：将各种不同定义：将各种不同突变基因突变基因与与载体重组载体重组，再转入，再
7、转入适宜的细胞或包装成重组适宜的细胞或包装成重组噬菌体的技术过程。噬菌体的技术过程。质量要求：文库质量要求：文库包容性包容性和文库和文库完整性完整性过程：过程：l载体选择载体选择l基因重组基因重组l形成基因文库形成基因文库质粒质粒噬菌体噬菌体DNA黏粒载体黏粒载体噬菌粒载体噬菌粒载体转化转化转导转导本讲稿第十二页，共十四页2、突变基因的筛选、突变基因的筛选（1）定向选择环境条件的设定）定向选择环境条件的设定（2）高通量筛选技术）高通量筛选技术l平板筛选技术平板筛选技术l荧光筛选法荧光筛选法l噬菌体表面展示法噬菌体表面展示法l酵母细胞表面展示法酵母细胞表面展示法本讲稿第十三页，共十四页本讲稿第十四页，共十四页