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1、实验二细菌涂抹片的制备和革兰氏染色第1页，共12页，编辑于2022年，星期五目的要求：目的要求：1 1、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。22、认识革兰氏染色和抗酸性染色、认识革兰氏染色和抗酸性染色的反应特性。的反应特性。实验内容：实验内容：1 1、细菌抹片的制备：细菌抹片的制备：l玻片准备：透明、洁净、无油渍。玻片准备：透明、洁净、无油渍。l抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。l干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。干燥固定：火焰固定和化学固
2、定的示范。讲解其目的及注意事项。2 2、细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。3 3、细菌常用染色方法：细菌常用染色方法：革兰氏染色法革兰氏染色法细菌抹片细菌抹片 的制备的制备第2页，共12页，编辑于2022年，星期五革兰氏染色法：革兰氏染色法：1.1.制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、固定。固定。2.2.初染：滴加结晶紫，染色初染：滴加结晶紫，染色1-21-2分钟，水洗。分钟，水洗。3.3.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1
3、1分钟，水洗。分钟，水洗。4.4.脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加在白色背景下，用滴管流加95%95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（紫色时（20302030秒），立即水洗。秒），立即水洗。5.5.复染：用复红液复染约复染：用复红液复染约2 2分钟，水洗。分钟，水洗。6.6.镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。第3页，共12页，编辑于2022年，星期五革兰氏染色法原理：革兰氏染色法原理：革兰氏染色法原理：革兰氏染色法原理：革
4、兰氏染色法将细菌分为革兰氏染色法将细菌分为革兰氏染色法将细菌分为革兰氏染色法将细菌分为G G G G和和和和G-G-G-G-，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫合形成结晶紫合形成结晶紫
5、合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。类细菌的脱色效果是不同的。类细菌的脱色效果是不同的。类细菌的脱色效果是不同的。G G G G细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩
6、小，通透性降且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫低，使得结晶紫低，使得结晶紫低，使得结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。持初染剂的蓝紫色。持初染剂的蓝紫色。持初染剂的蓝紫色。G-G-G-G-细菌
7、则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫碘的复合物碘的复合物碘的复合物碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜
8、色。比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。第4页，共12页，编辑于2022年，星期五G+菌与菌与G-菌细胞壁的区别菌细胞壁的区别 细胞壁细胞壁 革兰阳性菌革兰阳性菌 革兰阴性菌革兰阴性菌 强强 度度 较坚韧较坚韧 较疏松较疏松 厚厚 度度 2180nm 1015nm 肽聚糖层肽聚糖层 可达可达50 层层 12层层 肽聚糖量肽聚糖量 50%80%5%80%糖类量糖类量 约约45%15%20%脂类量脂类量 1%4%1122%磷壁酸磷壁酸 外外 膜膜 第5页，共12页，编辑于2022年，星期五革兰氏染色法过程示意图革兰
9、氏染色法过程示意图革兰氏染革兰氏染 色法动画色法动画第6页，共12页，编辑于2022年，星期五革兰阳性菌革兰阳性菌 革兰阴性菌革兰阴性菌第7页，共12页，编辑于2022年，星期五第8页，共12页，编辑于2022年，星期五革兰氏革兰氏 染染 色法色法革兰氏染革兰氏染 色法动画色法动画实验报告：实验报告：1 1、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察结果。、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察结果。2 2、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。第9页，共12页，编辑于2022年，星期五涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色12min水洗、吸干镜检镜检细菌的单染色细菌的单染色第10页，共12页，编辑于2022年，星期五细菌抗酸染色细菌抗酸染色1.初染初染:用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。2.脱色脱色:3%盐酸酒精脱色30秒1分钟；用水冲洗。3.复染：复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。第11页，共12页，编辑于2022年，星期五第12页，共12页，编辑于2022年，星期五