《第六章荧光分光光度法PPT讲稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第六章荧光分光光度法PPT讲稿.ppt（21页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第六章 荧光分光光度法第1页，共21页，编辑于2022年，星期三l基本要求：了解荧光光谱法的基本原理和应用特点。了解荧光分光光度计的组成以及特点。掌握荧光光谱法的定量分析方法。了解影响荧光强度的因素。第2页，共21页，编辑于2022年，星期三第一节第一节 概论概论 回顾：四大类电化学分析法光学分析法色谱分析法其它分析方法 原子光谱法 分子光谱法 X射线光谱法 核磁波谱法 紫外-可见光分光光度法 荧光分光光度法红外吸收光谱法 拉曼光谱法 第3页，共21页，编辑于2022年，星期三一、应用：一、应用：1.定量分析 能产生荧光 或能形成荧光配合物的物质。2.简单定性 回答“是不是”。二、特点：二、特
2、点：灵敏度高，比吸收光谱法高10104倍。ppb选择性比吸收光谱法好。第4页，共21页，编辑于2022年，星期三第二节第二节 基本原理基本原理 一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生 物质吸收光辐射 价电子从基态跃到激发态，然后再回到基态 释放能量以热能的形式。以光辐射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这种现象称为光致发光。荧光磷光无辐射跃迁激发态亚稳态（三重态）基态第5页，共21页，编辑于2022年，星期三 最常见的光致发光：荧光和磷光。两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-910-6秒，磷光寿命10-310秒。荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的原子产生，本章介绍分子荧光。由
3、于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可见光区。第6页，共21页，编辑于2022年，星期三二、激发光谱和发射光谱二、激发光谱和发射光谱 激发光谱激发光谱 固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F)所作的光谱曲线。300350400(nm)F【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。第7页，共21页，编辑于2022年，星期三 发射光谱发射光谱 固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F所作的光谱曲线。300350400(nm)F【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。第8页，共21页，编辑于2022年，星期三三、分子荧光与分子结构的关系三、分子荧光与分子
4、结构的关系 分子要产生荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。能产生荧光的分子具有的结构特点：共轭双键刚性平面多环结构【例】芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。第9页，共21页，编辑于2022年，星期三四、荧光强度与浓度的关系四、荧光强度与浓度的关系：量子效率，发射光量子与吸收光量子之比。I0：入射光强度：摩尔吸光系数 b：光程 c：浓度F=2.303I0bc公式成立前提条件：bc=A0.05 即：当试样浓度较低时（c0.05/b），C与F方成线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生无辐射去激活，造成线性偏离。）第10页，共21页，编辑于2022年，星期三第三节第三节 荧光分光光度计荧光分光
5、光度计 一、基本结构示意图一、基本结构示意图 特点：1 光源方向与检测方向成直角；2 二个单色器。显示器检测器荧光单色器样品池激发光单色器光源第11页，共21页，编辑于2022年，星期三二、主要部件及功能二、主要部件及功能 1光源光源高压汞蒸气灯，氙灯。能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度计光源大得多。2激发光单色器激发光单色器作用：提供单波长的激发光。色散元件：棱镜或光栅。出射狭缝宽度可调。第12页，共21页，编辑于2022年，星期三3样品池样品池须用石英材料制成。4荧光单色器荧光单色器将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧光通过。出射狭缝宽度可调。5检测器检测器光
6、电转换元件，测定荧光的强度。检测方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的干扰。由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。第13页，共21页，编辑于2022年，星期三第四节第四节 定量分析定量分析 一、定量方法一、定量方法 一般采用工作直线法。作CF直线。FC第14页，共21页，编辑于2022年，星期三配制一系列待测成分的标准溶液 C1 C2 C3 C4 C5测出相应的荧光强度 F1 F2 F3 F4 F5建立工作直线（F C）作图法 回归法测量待测样品，得F样 从工作直线上找到待测成分的浓度C样 由回归方程计算出C样第15页，共21页，编辑于2022年，星期三二、影响荧光强度测定的因
7、素二、影响荧光强度测定的因素 1激发光照射激发光照射有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致F。所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸让激发光照射样品池。2温度温度温度，荧光效率下降，F。（因为，温度，增加分子间碰撞机会而使能量消耗掉。）第16页，共21页，编辑于2022年，星期三4溶剂溶剂 有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。苯胺pH712时，发兰色荧光。pH2或PH13时，无荧光。【例】所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。3pH值值 pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。第17页，共21页，编辑于2022年，星期三l
8、灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt级（10-12）。l选择性好，与能产生荧光的物质少有关。三、定量分析的特点及应用三、定量分析的特点及应用 第18页，共21页，编辑于2022年，星期三思考题一、概念l（荧光）激发光谱l（荧光）发射光谱第19页，共21页，编辑于2022年，星期三二、问答题l试述分子荧光产生的过程。l试述分子荧光强度与浓度的关系式，并说明公式成立的前提条件及原因。l分别说明荧光分光光度计两个单色器的作用，以及将光路设计成直角方向的原因。l为什么可见光分光光度计的光路是直线方向，而荧光分光光度计的光路是直角方向？第20页，共21页，编辑于2022年，星期三荧光分析的激发光谱和发射光谱分别提供了哪些定量分析信息？核黄素的激发光谱（实线）和发射光谱（虚线）如图所示，对核黄素进行荧光定量分析时，最佳的激发光波长和荧光波长各为多少？为什么？第21页，共21页，编辑于2022年，星期三