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1、关于高效液相色谱法原理及其应用第一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第一节第一节 高效液相色谱法基本原理高效液相色谱法基本原理w色色谱谱分分析析法法是是分分析析化化学学中中获获得得广广泛泛应应用用的的一一个个重重要要分分支支，是是一一个个具具有有强强大大生生命命力的分离分析技术。力的分离分析技术。w采采用用高高压压输输液液泵泵将将规规定定的的流流动动相相泵泵入入装装有有填填充充剂剂的的色色谱谱柱柱，对对供供试试品品进进行行分分离离测测定定的的色色谱谱方方法法。注注入入的的供供试试品品由由流流动动相相带带入入色色谱谱柱柱内内，各各组组分分在在柱柱内内被被分分离离，并并依依次次进进入入检检
2、测测器器，由由积积分分仪仪或或数数据据处处理理系系统统记记录录和和处处理理色色谱谱信信号号，最最终终得得到到各组分的色谱峰。各组分的色谱峰。第二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月（一）高效液相色谱法的特点（一）高效液相色谱法的特点w一、与经典液相色谱法比较一、与经典液相色谱法比较 现代液相色谱法是在经典色谱理论的基现代液相色谱法是在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。验技术建立的一种液相色谱分析法。第三张，PPT共七十一页，创作于2022年
3、6月w二、与气相色谱法比较二、与气相色谱法比较1分析对象的区别分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包：适于溶解后能制成溶液的样品（包 括有机介质溶液），不受样品挥发性括有机介质溶液），不受样品挥发性 和热稳定性的限制，对分子量大、难和热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样
4、品及高分气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的80%第四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月2 2流动相的区别流动相的区别GCGC：流流动动相相为为惰惰性性气气体体，组组分分与与流流动动相相无无亲亲合合作作 用用力，只与固定相有相互作用。力，只与固定相有相互作用。HPLCHPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作流动相为液体，流动相与组分间有亲合作 用用力力，能能提提高高柱柱的的选选择择性性、改改善善分分离离度度，对对 分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余 地
5、广，改变流动相极性和地广，改变流动相极性和pHpH值也对分离起到值也对分离起到 调控作用，当选用不同比例的两种或两种以调控作用，当选用不同比例的两种或两种以 上液体作为流动相也可以增大分离选择性。上液体作为流动相也可以增大分离选择性。第五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3 3操作条件区别操作条件区别GCGC：加加温温操操作作（对对气气相相色色谱谱分分离离效效率率最有影响的因素）最有影响的因素）HPLCHPLC：室温；高压：室温；高压第六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月三、高效液相色谱法的特点三、高效液相色谱法的特点w1 分离效能高分离效能高w2 2 选择性高选择性高w3 3
6、 检测灵敏度高检测灵敏度高w4 4 分析速度快分析速度快第七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月（二）高效液相色谱法的分类（二）高效液相色谱法的分类及分离机制及分离机制 按固定相的聚集状态分类：按固定相的聚集状态分类：液液色谱法、液固色谱法液液色谱法、液固色谱法 按分离机制分类：按分离机制分类：分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法及亲合色谱法谱法、空间排阻色谱法及亲合色谱法第八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 按流动相与固定相极性的相对强弱分按流动相与固定相极性的相对强弱分类：类：正相色谱法、反相色谱法正相色谱法、反相色谱法第
7、九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w一、一、液固吸附色谱法（液固吸附色谱法（LSCLSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂w分离机制：利用溶质分子占据固定分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异相表面吸附活性中心能力的差异 w调节溶剂极性，可以控制组分的保留调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间时间w出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱性组分先出柱第十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月二、二、液液分配色谱法（液液分配色谱法（LLCLLC）w分离机制：利用组分在两相中溶解度的差分离机制：利用
8、组分在两相中溶解度的差异异正相色谱正相色谱固定相极性固定相极性 流动相极性流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后柱，极性小的组分先出柱，极性大的组分后柱，适用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极适用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。质的分离。第十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月反相色谱反相色谱固定相极性固定相极性 固定相极性固定相极性第十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月按分离过程物理化学原理分类的各种液相色按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较谱法的比较吸附色谱吸附色谱分配色谱分
9、配色谱离子色谱离子色谱空间排阻空间排阻色谱色谱亲和色谱亲和色谱固定相固定相全多孔固全多孔固体吸附剂体吸附剂固定液载固定液载带在固相带在固相基体上基体上高效微粒高效微粒离子交换离子交换剂剂具有不同具有不同孔径的多孔径的多孔性凝胶孔性凝胶多种不同多种不同性能的配性能的配位体键联位体键联在固相基在固相基体上体上流动相流动相不同极性不同极性有机溶剂有机溶剂不同极性不同极性有机溶剂有机溶剂和水和水不同不同pH值值的缓冲溶的缓冲溶液液有机溶剂有机溶剂或一定或一定pH值的缓冲值的缓冲溶液溶液不同不同pH值值的缓冲溶的缓冲溶液，可加液，可加入改性剂入改性剂分离原理分离原理吸附与解吸附与解吸吸溶解与挥溶解与挥发
10、发可逆性的可逆性的离子交换离子交换多孔凝胶多孔凝胶的渗透或的渗透或过滤过滤具有锁匙具有锁匙结构络合结构络合物的可逆物的可逆性离解性离解第十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月（四）高效液相色谱法的定性定量分析方法（四）高效液相色谱法的定性定量分析方法w与气相色谱法的分析方法基本相同与气相色谱法的分析方法基本相同w定性分析方法：定性分析方法：色谱鉴定法色谱鉴定法 化学鉴定法化学鉴定法 两谱联用鉴定法两谱联用鉴定法w定量分析方法：定量分析方法：外标法外标法 内标法内标法 面积归一化法（要求每一个组分都面积归一化法（要求每一个组分都出峰）出峰）第十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月
11、第二节 高效液相色谱仪第十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 1 1贮液瓶（滤芯，可滤贮液瓶（滤芯，可滤 去颗粒状物质）去颗粒状物质）2 2高压泵（输液泵、梯高压泵（输液泵、梯 洗脱度）洗脱度）3 3进样装置进样装置4 4色谱柱色谱柱分离分离5 5检测器检测器分析分析6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置第二十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月（一）输液系统（一）输液系统 w一、储液装置：过滤器一、储液装置：过滤器w二、脱气装置：脱气机二、脱气装置：脱气机w流动相脱气：流动相脱气：w（1）吹氦脱气法）吹氦脱气法 w（2）加热回流法）加热回流法
12、w（3）抽真空脱气法）抽真空脱气法 w（4）超声波脱气法）超声波脱气法 w（5）在线真空脱气法）在线真空脱气法第二十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第二十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w流动相（淋洗剂、洗脱剂）是影响液流动相（淋洗剂、洗脱剂）是影响液相色谱分离的一个非常重要的实验因相色谱分离的一个非常重要的实验因素。改变流动相的性质和组成将改变素。改变流动相的性质和组成将改变溶质组分的溶质组分的保留值保留值、分离选择性分离选择性和和柱柱效效。在实际工作中，流动相的可选择范。在实际工作中，流动相的可选择范围较大是液相色谱的一个显著特点。围较大是液相色谱的一个显著特点。第
13、二十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w液相色谱中液相色谱中,组分的组分的保留值大小保留值大小决定于决定于组分与流动相和固定相组分与流动相和固定相分分子间作用力：比如吸附、分配、离子间作用力：比如吸附、分配、离子交换、亲和力等。子交换、亲和力等。第二十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月（二）高压输液泵及梯度洗脱装置（二）高压输液泵及梯度洗脱装置w一、高压输液泵的种类一、高压输液泵的种类 w高压输液泵可以分为以下两类：高压输液泵可以分为以下两类：w1恒流泵：可输出恒定体积流量的恒流泵：可输出恒定体积流量的流动相。流动相。w（1）注射式泵（又称螺杆注射泵）注射式泵（又称螺杆注射
14、泵）w（2）往复型泵往复型泵（又称往复柱塞泵）（又称往复柱塞泵）第二十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月往复柱塞泵，柱塞向前运动，液体往复柱塞泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，运动，保证将流动相以稳定的速度流保证将流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件。过色谱柱的部件。二、高压输液泵的原理二、高压输液泵的原理第二十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w2 2恒压泵：恒压泵又称气动放大恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力的泵。泵，是输出恒定压力的泵。第二十七张，
15、PPT共七十一页，创作于2022年6月第二十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混合物等。过滤用滤膜过滤或垂熔漏斗过滤脱气采用超声或过滤的方法注意注意流动相流动相使用前使用前冲洗冲洗使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！第二十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w二、高压输液泵的基本要求：二、高压输液泵的基本要求：w1.1.流量范围宽流量范围宽w2.2.重现性和准确度好重现性和准确度好w3.3.输出的流动相无脉冲影响输出的流动相无脉冲影响w4.4.输出压力高且耐压
16、输出压力高且耐压w5.5.密封性能好密封性能好w6.6.具备压力检测和保护功能具备压力检测和保护功能第三十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月三、高压输液泵的性能参数三、高压输液泵的性能参数w用于分析型输液泵的流量相对标准偏用于分析型输液泵的流量相对标准偏差在差在0.075%0.075%0.3%0.3%w流量范围是流量范围是0.0100.01010ml/min10ml/minw流动相流速是流动相流速是1 13ml/min3ml/minw最高工作压力可达最高工作压力可达34.4734.4741.36MPa(30041.36MPa(300500bar,5000500bar,50006000p
17、si)6000psi)第三十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月四、梯度洗脱装置四、梯度洗脱装置w梯度洗脱：又称为梯度淋洗或程序洗梯度洗脱：又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，梯度性地不断改变流动相的浓度配比，梯度性地改变洗脱液的组成。从而可以使一个复改变洗脱液的组成。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子自适宜的容量因子k k达到良好的分离目达到良好的分离目的。的。第三十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w梯度洗脱的原理：梯度洗脱的原
18、理：w流动相由几种不同极性的溶剂组成，流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子有合适的容量因子k k，并使样品中的所有并使样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。组分可在最短时间内实现最佳分离。第三十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w梯度洗脱的优点：梯度洗脱的优点：w1.1.缩短分析周期；缩短分析周期；w2.2.提高分离能力；提高分离能力；w3.3.峰型得到改善，减少拖尾；峰型得到改善，减少拖尾；w4.4.增加灵敏度。但有时引起基线漂增
19、加灵敏度。但有时引起基线漂移。移。第三十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月（三）进样装置（三）进样装置 w一、手动注射进样器一、手动注射进样器w二、六通阀进样装置二、六通阀进样装置 w三、自动进样器三、自动进样器 第三十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w进样阀的基本要求：进样阀的基本要求：w1.1.耐高压耐高压w2.2.进样量准确进样量准确w3.3.进样重复性好进样重复性好w4.4.无流量和压力波动影响无流量和压力波动影响第三十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w进样阀的保护措施：进样阀的保护措施：w1.1.在泵和进样阀之间安装在线过在泵和进样阀之间安装在线过滤
20、器，防止机械杂质进入进样阀。滤器，防止机械杂质进入进样阀。w2.2.以缓冲液作流动相时，定期用以缓冲液作流动相时，定期用水清洗进样阀，尤其是在色谱仪水清洗进样阀，尤其是在色谱仪关机前。关机前。第三十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w自动进样器的组成部分：自动进样器的组成部分：w1.1.进样阀进样阀w2.2.样品环管样品环管w3.3.进样针头进样针头w4.4.样品瓶样品瓶w5.5.支架支架第三十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月（四）（四）色谱柱色谱柱 w色谱柱是液相色谱系统进行分离的色谱柱是液相色谱系统进行分离的核心部分，试样中各组分在核心部分，试样中各组分在色谱柱色谱柱
21、中被分离。中被分离。第三十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w色谱柱的要求：色谱柱的要求：w柱效高：通过减小填料粒度来柱效高：通过减小填料粒度来提高柱效提高柱效w选择性好：可通过改变固定相选择性好：可通过改变固定相的种类和流动相的种类来改变色的种类和流动相的种类来改变色谱柱的选择性。谱柱的选择性。w分析速度快分析速度快第四十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w一、柱材料及规格一、柱材料及规格 1 1柱材料：色谱柱由柱管和固定柱材料：色谱柱由柱管和固定相组成，柱管用不锈钢制成。相组成，柱管用不锈钢制成。wHPLCHPLC柱的填料材料有硅胶、以硅胶柱的填料材料有硅胶、以硅胶为基质
22、的键合相、氧化铝和有机聚为基质的键合相、氧化铝和有机聚合物微球等。合物微球等。第四十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w2 2柱规格：粒度通常为柱规格：粒度通常为3m3m、5m5m、7m7m、10m10m，柱长柱长101030cm30cm，内径，内径2 26mm6mm，以，以4.6mm4.6mm的内的内径最常用。径最常用。目前以反相键合相色目前以反相键合相色谱柱应用最多，尤其是谱柱应用最多，尤其是C18C18、C8C8柱柱第四十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w二、色谱柱的性能评价二、色谱柱的性能评价w1.1.理论塔板数理论塔板数w2.2.不对称因子不对称因子w3.3.保
23、留值的重现性保留值的重现性第四十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w三、色谱柱的维护与保养三、色谱柱的维护与保养w1.1.加流路过滤器和保护预柱加流路过滤器和保护预柱w2.2.避免高压冲击避免高压冲击w3.3.采用适合柱的分离条件：采用适合柱的分离条件：PHPH、柱、柱温和流动相温和流动相w4.4.过滤流动相和样品过滤流动相和样品w5.5.用强溶剂定期冲洗柱用强溶剂定期冲洗柱第四十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月1.1.色谱柱的保养色谱柱的保养色谱柱使用与保存色谱柱使用与保存：所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积积20-3020-30倍的水冲
24、洗色谱柱倍的水冲洗色谱柱色谱柱色谱柱 柱体积柱体积 冲洗体积冲洗体积150 4.6mm 150 4.6mm 2.5ml 50ml2.5ml 50ml200 4.6mm 200 4.6mm 3.3ml 65ml3.3ml 65ml250 4.6mm 4.2ml 80ml250 4.6mm 4.2ml 80ml第四十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w（1 1）反相谱柱用后的保存：使用缓冲液）反相谱柱用后的保存：使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，每天实验结束后，或含盐溶液作为流动相，每天实验结束后，应用应用2020倍柱体积的甲醇倍柱体积的甲醇/乙腈水溶液乙腈水溶液（5%5%）冲洗，使色谱柱
25、内的盐完全溶解洗）冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出，再用高浓度的甲醇脱出，再用高浓度的甲醇/乙腈水溶液乙腈水溶液（80%80%100%100%）冲洗，使色谱柱中的强）冲洗，使色谱柱中的强吸附物质冲洗出来。吸附物质冲洗出来。第四十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w（2 2）反相色谱柱长期保存：反相色谱柱长期保存：反相柱可以储存于反相柱可以储存于甲醇或乙腈甲醇或乙腈中，正相中，正相柱可以储存于经脱水处理的正己烷中，柱可以储存于经脱水处理的正己烷中，离子交换柱可以贮存于离子交换柱可以贮存于5%5%甲醇水的溶甲醇水的溶液中，并将色谱柱两端的堵头拧紧，液中，并将色谱柱两端的堵头拧紧，以免干
26、枯，室温保存。以免干枯，室温保存。第四十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3.3.色谱柱的维修色谱柱的维修w（1 1）如果柱压实然增大，可将色谱柱）如果柱压实然增大，可将色谱柱出、入口端颠倒过来，用出、入口端颠倒过来，用10102020倍柱体倍柱体积的流动相冲洗。积的流动相冲洗。w（2 2）如果峰形变坏，表明柱入口柱床）如果峰形变坏，表明柱入口柱床可能有塌陷，可用同型号填料和乙醇配可能有塌陷，可用同型号填料和乙醇配成匀浆，将塌陷处填平，压紧。成匀浆，将塌陷处填平，压紧。第四十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月2.2.色谱柱的再生色谱柱的再生w（1 1）反相色谱柱的再生步骤：
27、甲）反相色谱柱的再生步骤：甲醇二氯甲烷正己烷二氯甲烷醇二氯甲烷正己烷二氯甲烷甲醇甲醇w（2 2）正相色谱柱的再生步骤：无）正相色谱柱的再生步骤：无苯正己烷二氯甲烷异丙醇二苯正己烷二氯甲烷异丙醇二氯甲烷无苯正己烷氯甲烷无苯正己烷第四十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w（3 3）离子交换柱的再生步骤：用）离子交换柱的再生步骤：用稀酸缓冲液冲洗可使阳离子交换柱稀酸缓冲液冲洗可使阳离子交换柱再生，用稀碱缓冲液冲洗可使阴离再生，用稀碱缓冲液冲洗可使阴离子柱再生。子柱再生。第五十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月（五）（五）检测器检测器 w一、定义一、定义w检测器是将色谱洗脱液中组分的
28、检测器是将色谱洗脱液中组分的量转变成电信号的传感器，并由量转变成电信号的传感器，并由数据处理系统记录，根据所得色数据处理系统记录，根据所得色谱图上峰的位置、形状和大小，谱图上峰的位置、形状和大小，进行定性、定量分析。进行定性、定量分析。第五十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月二、分类二、分类w通用型：示差折光检测器（通用型：示差折光检测器（DRIDDRID）、）、安培检测器（安培检测器（ADAD）、蒸发光散射检测器）、蒸发光散射检测器（ELSDELSD）w专属型：紫外检测器（专属型：紫外检测器（UVDUVD）、可变）、可变紫外可见光检测器（紫外可见光检测器（DADDAD）、荧光检测器
29、）、荧光检测器（FDFD）第五十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w三、检测器的性能指标三、检测器的性能指标 w（1 1）噪声）噪声 w（2 2）基线漂移）基线漂移 w（3 3）灵敏度）灵敏度 w（4 4）线性范围）线性范围 w（5 5）重复性）重复性第五十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w四、紫外检测器四、紫外检测器 w1 1固定波长紫外吸收检测器固定波长紫外吸收检测器 w2 2可变波长紫外吸收检测器可变波长紫外吸收检测器 w3 3光二极管阵列检测器光二极管阵列检测器 只能检测有紫外吸收的物质，工作原只能检测有紫外吸收的物质，工作原理基于理基于Lambert-BeerL
30、ambert-Beer定律。定律。第五十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w五、可变波长紫外检测器五、可变波长紫外检测器w是目前配置最多的检测器，可根是目前配置最多的检测器，可根据组分的最大吸收波长来设定检据组分的最大吸收波长来设定检测波长。测波长。第五十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月高效液相色谱仪的使用及维护高效液相色谱仪的使用及维护w使用使用HPLCHPLC级试剂和流动相级试剂和流动相w清洁的仪器、流动相和样品，如果清洁的仪器、流动相和样品，如果必要，进行过滤必要，进行过滤w保证溶剂的相溶性保证溶剂的相溶性w如果必要，冲洗整个系统，去掉如果必要，冲洗整个系统，去掉盐
31、，防止污染盐，防止污染w在规定的在规定的pHpH范围内选用流动相范围内选用流动相w对仪器的使用、维护和保养进行对仪器的使用、维护和保养进行记录记录第五十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月建立高效液相色谱分析方法的一般步骤建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 w通通常常在在确确定定被被分分析析的的样样品品以以后后，要要建建立立一一种种高高效效液液相相色色谱谱分分析析方方法法必必须须解解决决以以下问题：下问题：根根据据被被分分析析样样品品的的特特性性选选择择适适用用于于样样品品分析的一种高效液相色谱分析方法。分析的一种高效液相色谱分析方法。选选择择一一根根适适用用的的色色谱谱柱柱，确确定定
32、柱柱的的规规格格（柱柱内内径径及及柱柱长长）和和所所选选用用固固定定相相（粒粒径及孔径）。径及孔径）。第五十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月选选择择适适当当的的或或优优化化的的分分离离操操作作条条件件，确确定定流流动动相相的的组组成成、流流速速及及洗洗脱方式。脱方式。由获得的色谱图进行定性分析和由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。定量分析。第五十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第三节第三节 高效液相色谱法应用示例高效液相色谱法应用示例w盐酸左氧氟沙星滴眼液（盐酸左氧氟沙星滴眼液（5ml:15mg5ml:15mg）含量）含量测定测定w测定方法测定方法：色谱条件与系统适用
33、性试验色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以醋酸铵高氯酸钠溶液（取醋酸铵醋酸铵高氯酸钠溶液（取醋酸铵4.0g4.0g和高和高氯酸钠氯酸钠7.0g7.0g，加水，加水1300ml1300ml使溶解，用磷酸使溶解，用磷酸调节调节PHPH值至值至2.22.2）乙腈（乙腈（85:1585:15）为流动）为流动相；检测波长为相；检测波长为294nm294nm。第五十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w称取左氧氟沙星对照品、环丙沙星对照称取左氧氟沙星对照品、环丙沙星对照品和杂质品和杂质E E对照品各适量，加对照品各适量，加0.1mol/L0
34、.1mol/L盐酸盐酸溶液溶解并稀释制成每溶液溶解并稀释制成每1ml1ml中约含左氧氟沙中约含左氧氟沙星星0.12mg0.12mg、环丙沙星和杂质、环丙沙星和杂质E E各各6g6g的混合的混合溶液，取溶液，取10l10l注入液相色谱仪，记录色谱注入液相色谱仪，记录色谱图，左氧氟沙星峰的保留时间约为图，左氧氟沙星峰的保留时间约为1515分钟。分钟。左氧氟沙星峰与杂质左氧氟沙星峰与杂质E E峰和左氧氟沙星峰与峰和左氧氟沙星峰与环丙沙星峰的分离度应分别大于环丙沙星峰的分离度应分别大于2.02.0与与2.52.5。第六十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w供试品溶液的制备与测定供试品溶液的制备
35、与测定 精密量取本品精密量取本品1.0ml1.0ml，置，置25ml25ml量瓶中，加量瓶中，加0.1mol/L0.1mol/L盐酸溶液盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液供试品溶液。另精密。另精密称左氧氟沙星对照品适量，加称左氧氟沙星对照品适量，加0.1mol/L0.1mol/L盐酸盐酸溶液溶解并定量稀释成每溶液溶解并定量稀释成每1ml1ml中约含左氧氟沙中约含左氧氟沙星星0.12mg0.12mg的溶液，作为的溶液，作为对照品溶液对照品溶液。取供试。取供试品溶液与对照品溶液各品溶液与对照品溶液各10ul10ul，分别注入液相，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法
36、以峰面积计色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算出供试品中算出供试品中C C1818H H2020FNFN3 3O O4 4的含量，即得。本的含量，即得。本品含盐酸左氧氟沙星以左氧氟沙星品含盐酸左氧氟沙星以左氧氟沙星（C C1818H H2020FNFN3 3O O4 4）计，应为标示量的）计，应为标示量的92.0%92.0%108.0%108.0%。第六十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w（1 1）配制系统适用性溶液，通过图）配制系统适用性溶液，通过图谱得到相应峰之间的分离度。谱得到相应峰之间的分离度。左氧氟沙星峰的保留时间左氧氟沙星峰的保留时间 左氧氟沙星峰与杂质左氧氟沙星峰
37、与杂质E E峰的分离度峰的分离度左氧氟沙星峰与环丙沙星峰的分离度左氧氟沙星峰与环丙沙星峰的分离度 第六十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w（2 2）配制供试品溶液，进样，通过图）配制供试品溶液，进样，通过图谱得到主成分色谱图的峰面积，并计算谱得到主成分色谱图的峰面积，并计算平均值。平均值。供试品峰面积供试品峰面积A AX X 1 2第一针第一针第二针第二针供试品平均峰面积供试品平均峰面积第六十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w（3 3）配制对照品溶液，进样，通过图）配制对照品溶液，进样，通过图谱得到主成分色谱图的峰面积，并计算谱得到主成分色谱图的峰面积，并计算平均值。平
38、均值。对照品峰面积对照品峰面积A AX X 1 2第一针第一针第二针第二针对照品平均峰面积对照品平均峰面积第六十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w（4 4）根据外标法计算公式，将对照品）根据外标法计算公式，将对照品1 1的峰面积分别代入两份样品中求得的峰面积分别代入两份样品中求得样品含量。样品含量。公式：公式：供试品供试品1-11-1%=%=供试品供试品1-21-2%=%=第六十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w（5 5）根据外标法计算公式，将对照）根据外标法计算公式，将对照品品2 2的峰面积分别代入两份样品中求得的峰面积分别代入两份样品中求得样品含量。样品含量。公式：公式：供试品供试品2-12-1%=%=供试品供试品2-22-2%=%=第六十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月w（6 6）最后通过两份样品的平均结果得）最后通过两份样品的平均结果得到盐酸左氧氟沙星滴眼液的含量。到盐酸左氧氟沙星滴眼液的含量。第六十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第六十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第六十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第七十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看第七十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月