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1、高效液相色谱法1本讲稿第一页，共三十九页o高效液相色谱法的主要类型和原理高效液相色谱法的主要类型和原理o高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择o高效液相色谱仪高效液相色谱仪o高效液相色谱分析方法高效液相色谱分析方法Introduction2本讲稿第二页，共三十九页HPLC以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法发展而成的现代液相色谱分析方法3本讲稿第三页，共三十九页o应用颗粒细、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高o流速快，分析速度快o使用高灵敏度检测器，
2、大大提高了灵敏度与经典液相色谱法相比与经典液相色谱法相比与经典液相色谱法相比与经典液相色谱法相比4本讲稿第四页，共三十九页o不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广o可选用不同性质的各种溶剂作为流动相，分离选择性高o一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温与气相色谱法相比与气相色谱法相比与气相色谱法相比与气相色谱法相比5本讲稿第五页，共三十九页 70年代迅速发展年代迅速发展 不挥发有机物约占不挥发有机物约占70%80年代以来年代以来HPLC 文献量文献量 21%（89年）年）仪器销售量仪器销售量 25%（12 亿）（亿）（89年）年）应用领域应用领域 拓展（化工、环保、临床、药品、生命）拓展
3、（化工、环保、临床、药品、生命）超过超过 GCGC6本讲稿第六页，共三十九页7本讲稿第七页，共三十九页8本讲稿第八页，共三十九页9本讲稿第九页，共三十九页10本讲稿第十页，共三十九页11本讲稿第十一页，共三十九页一、高效液相色谱法的主要类型和原理一、高效液相色谱法的主要类型和原理12本讲稿第十二页，共三十九页1.高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型o按固定相的聚集状态分类按固定相的聚集状态分类n液液色谱法（LLC）n液固色谱法（LSC）o按分离机制分类按分离机制分类n分配色谱法（分配色谱法（partition chromatographypartition chromatograp
4、hy）n吸附色谱法（吸附色谱法（adsorption chromatographyadsorption chromatography）n离子交换色谱法（离子交换色谱法（ion exchange chromatography;IECion exchange chromatography;IEC）n分子排阻色谱（分子排阻色谱（molecular exclusion molecular exclusion chromatography;MECchromatography;MEC）13本讲稿第十三页，共三十九页o按分离机制分类（续）按分离机制分类（续）n亲和色谱法（affinity chromatog
5、raphy;AC）n手性色谱法（chiral chromatography;CC）n胶束色谱法（micellar chromatography;MC）n电色谱法（electro chromatography;EC）o最常见的最常见的HPLCn化学键合相色谱法（bonded phase chromatography;BPC）n离子抑制色谱法（ion supression chromatography;ISC）n离子对色谱法（paired ion chromatography;PIC or IPC）14本讲稿第十四页，共三十九页化学键合相色谱法：化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法。2.
6、化学键合相色谱法化学键合相色谱法bonded phase chromatography(BPC)化学键合相：化学键合相：化学键合相：化学键合相：通过化学反应将有机基团键合在载体表面构成的固定相。15本讲稿第十五页，共三十九页 固定相：氰基化学键合相：与硅胶相似 氨基化学键合相：分析糖类 流动相：非极性或弱极性溶剂。正己烷，氯仿等。极性：固定相极性：固定相流动相流动相(1)(1)正相键合相色谱法正相键合相色谱法normal phase-bonded phase chromatographynormal phase-bonded phase chromatography主要用于分离溶于有机溶剂的极
7、性至中等极性的分子型化合主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物物物物16本讲稿第十六页，共三十九页o 分离机制：分离机制：n 分配过程n 吸附过程（诱导、氢键和定向作用等）o 组分的出峰顺序：组分的出峰顺序：极性小的先出峰，极性大的后出峰。17本讲稿第十七页，共三十九页o流动相的极性与容量因子的关系：流动相的极性与容量因子的关系：流动相的极性增大，洗脱能力增大，溶质的k 减小，tR减小。18本讲稿第十八页，共三十九页 固定相：十八烷基键合相（C18或ODS）流动相：甲醇-水或
8、乙腈-水 极性：固定相极性：固定相流动相流动相(2)(2)反相键合相色谱法反相键合相色谱法 reversed phase-bonded phase chromatographyreversed phase-bonded phase chromatographyo 分离机制：分离机制：复杂o 组分的出峰顺序：组分的出峰顺序：极性大的先出峰，极性小的后出峰。19本讲稿第十九页，共三十九页a.a.疏溶剂理论疏溶剂理论 solvophobic theory当非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时，相互产生斥力，溶质分子中非极性部分的取向导致极性溶剂中形成一个“空腔”，即疏溶剂作用疏溶剂作
9、用。o 溶质分子的非极性部分与固定相上的烃基间产生疏溶剂溶质分子的非极性部分与固定相上的烃基间产生疏溶剂缔合缔合o 溶质的极性部分受到极性流动相的解缔合作用，使它离开烃基溶质的极性部分受到极性流动相的解缔合作用，使它离开烃基 20本讲稿第二十页，共三十九页b.b.保留行为的主要影响因素保留行为的主要影响因素o 溶质的分子结构溶质的分子结构溶质的极性越弱，其疏水性越强，k越大，tR也越大；同系物中，碳数越多，k越大o 流动相流动相n 流动相的极性增大，洗脱能力降低；有机溶剂含量增加，k值变小n 流动相的pH变化会改变溶质的离解程度，离解程度越高，k值越小n 流动相中加入中性盐，表面张力变大，使中
10、性溶质的k增大21本讲稿第二十一页，共三十九页例：固定相：C18 流动相：甲醇:水(20:80)某组分的tR=20min,如何 使tR减小？22本讲稿第二十二页，共三十九页离子抑制色谱法离子抑制色谱法（ion suppression chromatography;ISC）通过调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加它与固定相的疏水缔合作用，以达到分离的色谱法o 样品为弱酸，降低流动相的pH，k增大，tR增大；o 样品为弱碱，提高流动相的pH，k增大，tR增大；o 注意流动相的pH值不能超过键合相的允许范围23本讲稿第二十三页，共三十九页o 固定相固定相n 碳链越长，疏水性越强，k增大n
11、 链长一定时，硅胶表面键合烷基的浓度越大，k越大n 键合基团的链长和浓度还影响分离的选择性应用：应用：非极性及中等极性的分子型物质。非极性及中等极性的分子型物质。24本讲稿第二十四页，共三十九页定义：离子对试剂加入极性流动相中，样品离子与反离子生成中性离子对，使样品的K增加，改善分离效果。(3)(3)反相离子对色谱法反相离子对色谱法paired ion chromatography,PICpaired ion chromatography,PICion pair chromatography,IPCion pair chromatography,IPC25本讲稿第二十五页，共三十九页 阴离子分
12、离阴离子分离：酸类或带负电荷的物质，常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳阳离离子子分分离离：碱类或带正电荷的物质，常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；a.a.离子对试剂：离子对试剂：26本讲稿第二十六页，共三十九页b.b.分离机制：分离机制：27本讲稿第二十七页，共三十九页 c.c.影响保留因子的因素：影响保留因子的因素：o 离子对试剂的种类和浓度离子对试剂的种类和浓度离子对试剂碳链长度增加，组分的k增大，tR增大离子对试剂浓度较低时，试剂浓度升高，k增大，然后趋于稳定采用长链离子对试剂时，当离子对试剂浓度超过一定值时，试剂浓度升高，k减小o 流动相流动相
13、n 流动相极性增大，组分的k增大，tR增大n 试样组分与离子对试剂全部离子化时，组分的k值最大28本讲稿第二十八页，共三十九页优点：n 易实现：ODS柱，甲醇-水，离子对试剂。n 可避免缓冲液对流路的腐蚀（IEC）缺点：PIC试剂价格贵。用途：生物碱、有机酸、磺胺类药物等。d.d.优缺点与用途：优缺点与用途：29本讲稿第二十九页，共三十九页 3.其它高效液相色谱法其它高效液相色谱法(1)(1)离子色谱法离子色谱法 ion chromatographyion chromatography 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量
14、的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子阴离子的有效方法。抑制型（双柱型）离子色谱法抑制型（双柱型）离子色谱法非抑制型（单柱型）离子色谱法非抑制型（单柱型）离子色谱法30本讲稿第三十页，共三十九页方法原理方法原理分离柱，交换反应：洗脱反应：抑制柱：与组分反应：与洗脱剂反应：低交换容量的低交换容量的阴离子交换剂阴离子交换剂高交换容量的高交换容量的阳离阳离子交换剂子交换剂31本讲稿第三十一页，共三十九页手性固定相o 流动相中加入手性添加剂 用途：分离、分析立体异构体(2)(2)手性色谱法：手性色谱法：chiral chromatography,CCchiral
15、chromatography,CC32本讲稿第三十二页，共三十九页(3)(3)亲和色谱亲和色谱(AC)Affinity chromatography(AC)Affinity chromatography 原原理理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。33本讲稿第三十三页，共三十九页(4)(4)排阻色谱排阻色谱 size-exclusion chromatographysize-excl
16、usion chromatography 固定相固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原原理理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 34本讲稿第三十四页，共三十九页二、二、HPLC的固定相和流动相及其选择的固定相和流动相及其选择35本讲稿第三十五页，共三十九页目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐
17、有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN 1.化学键合固定相：化学键合固定相：36本讲稿第三十六页，共三十九页(1)(1)键合相的种类键合相的种类o非极性键合相非极性键合相n表面为非极性基团，C18，C8，C1，苯基等；n通常用于反相色谱o弱极性键合固定相弱极性键合固定相n醚基和二羟基键合相；n可作为正相或反相色谱固定相，应用较少o极性键合相极性键合相n氨基、氰基键合相n通常用于正相色谱37本讲稿第三十七页，共三十九页(2)(2)键合相的性质和特点键合相的性质和特点a.a.键合反应键合反应b.b.含碳量和覆盖度含碳量和覆盖度 存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；38本讲稿第三十八页，共三十九页c.c.化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；39本讲稿第三十九页，共三十九页