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1、酶的催化机制本讲稿第一页，共三十七页l酶酶的的高高效效率率、高高度度专专一一性性和和酶酶活活可可调调节节等等催催化化特特性性，都都与与酶酶蛋蛋白白本本身身的的结结构构直直接接相相关关，酶酶蛋蛋白白的的一一级级结结构构决决定定酶酶的的空空间间构构象象，而而酶酶的的特特定定空空间间构构象象是是其其生生物物功能的结构基础。功能的结构基础。l人人们们只只有有更更深深入入地地认认识识酶酶、才才能能更更好好地地控控制制酶酶和和应应用用酶酶，即即在在不不断断研研究究酶酶的的结结构构和和功功能能的的具具体体关关系系和和催催化化机机理理的的基基础础上上，才才能能研研制制新新的的酶酶类类，开开发发出出更更广广泛泛
2、的用途。的用途。本讲稿第二页，共三十七页第一节第一节 酶的活性部位（活性中心）酶的活性部位（活性中心）l酶酶的的活活性性部部位位是是指指酶酶分分子子中中结结合合底底物物并并催催化化底底物物转转化化成成产产物物的的区区域域。活活性性部部位位包包括括底底物物的的结结合合部部位位和和催催化化部部位位。参参与与底底物物结结合合的的氨氨基基酸酸残残基基称称为为结结合合基基团团，直直接接参参与与催催化化过过程程的的基基团团称称为为催催化化基基团团，这这些些氨氨基基酸酸残残基基在在一一级级结结构构可可能能相相距距很很远远，但但在在空空间间结结构构中中却却相相距距很很近近，处处于于酶酶分分子子的的表表面面并并
3、组组成成一一个个裂裂隙隙和和流流水水口口袋。袋。本讲稿第三页，共三十七页l一一、活活性性部部位位在在整整个个酶酶分分子子中中只只占占很很小小一一部分部分l酶酶与与其其他他蛋蛋白白质质一一样样，是是一一个个结结构构极极其其复复杂杂的的大大分分子子，而而参参与与底底物物结结合合和和催催化化的的基基团团，则则只只是是少少数数几几个个氨氨基基酸酸残残基基。作作为为活活性性部部位位的的裂裂隙隙只只占占酶酶分分子子中很小的一部分。中很小的一部分。本讲稿第四页，共三十七页l二、二、活性部位是具有三维结构的裂隙活性部位是具有三维结构的裂隙l l酶酶的的活活性性部部位位具具有有复复杂杂三三维维结结构构的的形形态
4、态，构构成成活活性性部部位位的的氨氨基基酸酸残残基基处处于于酶酶分分子子一一级级结结构构上上的的不不同同部部位位，有有的的残残基基相相距距很很远远，然然而而在在空空间间结结构构上上却却相相距距很很近近，可协同结合和催化底物。可协同结合和催化底物。l例例如如溶溶菌菌酶酶分分子子中中有有129个个氨氨基基酸酸残残基基，活活性性部部位位的的重重要要基基团团则则是是由由Glu35，Asp52，Trp62，Trp63和和Asp101残残基基提提供的。供的。本讲稿第五页，共三十七页l三、底物与酶活性部位是通过次级键结三、底物与酶活性部位是通过次级键结合的合的 l酶酶与与底底物物的的复复合合物物ES的的平平
5、衡衡常常数数在在10-210-8molL的的范范围围内内，其其相相互互作作用用的的自自由由能能变变化化相相当当于于-3-12kcalmol的的范范围围。我我们们知知道道，共共价价键键的的自自由由能能变变化化在在-50-110kcalmol的的范范围围内内，相相比比之之下下，底物与酶的结合力是很弱的。底物与酶的结合力是很弱的。本讲稿第六页，共三十七页l四、活性部位的裂隙具有高度疏水性四、活性部位的裂隙具有高度疏水性 l在在已已知知结结构构的的酶酶分分子子中中，与与底底物物分分子子结结合合的的活活性性部部位位裂裂隙隙，通通常常水水分分子子是是进进不不去去的的，除除非非水水分分子子本本身身是是底底物
6、物分分子子。裂裂隙隙中中也也含含有有几几个个对对结结合合和和催催化化来来说说是是必必需需的的极极性性残残基基，但但并并不不影影响响整整个个裂裂隙隙的的疏疏水水性性，因因此此有有人人将将活活性性部部位位形形象象地地称称之之为为“疏疏水水口口袋袋”，活活性性部部位位的的疏疏水水性性增增进进了了底底物物的的结结合合，是是酶酶具具有有高高效效率率的的原原因因之之一一。参参与与底底物物结结合合的的基基团团总总和和称称为为结结合合部部位位，参参与与催催化化过过程程的的基基团团总总和和称称为为催催化化部部位位。实实际际上上这这两两个个部部位位的的几几何何位位置置并并不不截截然然分分开开，采采用用这这两个名称
7、只是为了便于说明作用的机制。两个名称只是为了便于说明作用的机制。本讲稿第七页，共三十七页l五、五、活性部位构象上的柔性活性部位构象上的柔性 l酶酶催催化化的的专专一一性性取取决决于于酶酶分分子子活活性性部部位位必必需需基基团团各各原原子子的的空空间间排排布布以以及及酶酶与与底底物物之之间间的的多多点点结结合合。1890年年Fisher曾曾提提出出酶酶和和底底物物相相互互作作用用的的锁锁一一匙匙模模型型，然然而而后后来来研研究究结结果果表表明明，酶酶的的活活性性部部位位并并不不是是刚刚性性不不变变的的，在在结结合合底底物物时时酶酶分分子子的的活活性性部部位位构构象象发发生生了了改改变变，这这个个
8、过过程程是是个个动动态态的的过过程程，称称为为诱诱导导契契合合。近近年年来来，基基于于大大量量的的在在去去折折叠叠过过程程中中失失活活与与构构象象变变化化的的比比较较研研究究的的重重要要事事实实，我我国国科科学学家家邹邹承承鲁鲁提提出出了了酶酶分分子子的的活活性性部部位位柔柔性性的的理理论论，并并指指出出这这种种柔柔性性是是酶酶催催化化作作用用所所必必需需的的。也也就就是是说说，酶酶分分子子的的活活性性部部位位构构象象上上相相对对的的柔柔性性是是酶酶催化所必需的。催化所必需的。本讲稿第八页，共三十七页第二节第二节 酶的活性部位的研究方法酶的活性部位的研究方法l一、发现与证实一、发现与证实lCh
9、TChT（胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶）241241个个氨氨基基酸酸，分分子子量量2570025700。此此酶酶可可水水解解芳芳香香族族氨氨基基酸酸的的羧羧基基端端形形成成的的肽肽键键；可可水水解解芳芳香香族族氨氨基基酸酸的的羧羧基基端端形形成的成的酯酯键。键。l设设计计人人造造底底物物乙乙酰酰酪酪氨氨酸酸乙乙酯酯。由由于于底底物物很很小小，故故它它与与酶酶只只是是点点接接触触，而而酶酶又又能能使使其其水水解解，说说明明酶酶分分子子直直接接参参与与酶酶催催化化的的部部位位只不过是一小部分。只不过是一小部分。本讲稿第九页，共三十七页l溶溶菌菌酶酶129129个个氨氨基基酸酸，分分子子量量146001
10、4600。水水解解细细胞胞壁壁（多多糖糖）而而溶溶菌菌酶酶直直接接接接触触的的只只是是六六个个六六碳碳糖糖，也也说说明明酶酶分分子子只只有有小小部部分分参参与与作用。作用。本讲稿第十页，共三十七页lI（抑制剂）（抑制剂）二异丙基氟磷（二异丙基氟磷（DFP）lChT+DEP 活性丧失活性丧失l经经测测定定DEP与与ChT的的195位位Ser结结合合，而而ChT有有27个个Ser，只只与与195-Ser结结合合，可可见见此此Ser与与其其它它Ser性性质质不不同同，可可能能处处于于特殊部位。特殊部位。lChT酶原与酶原与ChT结构很相近，但结构很相近，但DEP+ChT酶原酶原不结合不结合l不不结结
11、合合者者无无酶酶活活，可可以以推推测测抑抑制制剂剂结结合合的的部部位位可可能能是是活活性性中心中心本讲稿第十一页，共三十七页l二、活性部位含义二、活性部位含义 l酶酶的的活活性性部部位位是是酶酶分分子子的的一一小小部部分分，是是酶酶分分子中与底物结合并催化反应的场所。子中与底物结合并催化反应的场所。l活活性性部部位位是是由由几几个个氨氨基基酸酸侧侧链链基基团团组组成成（包包括括辅辅酶酶、金金属属离离子子等等），它它们们在在一一级级结结构构中中位位置置可可能能很很远远，但但形形成成空空间间结结构构后后位位置置很很近近，活活性性部部位位实实质质上上是是某某一一空空间间区区域域而而不不是是一一个个点
12、或面。点或面。l酶的活性部位包括底物结合部位、催化部位。酶的活性部位包括底物结合部位、催化部位。l羧羧肽肽酶酶A（全全酶酶）活活性性部部位位：Tyr，Arg，Glu；Zn+。本讲稿第十二页，共三十七页l三、催化部位和结合部位三、催化部位和结合部位 l催催化化部部位位是是催催化化反反应应中中直直接接参参与与电电子子授授受受关关系系的的部部位位，经经研研究究ChT的的催催化化部部位位已已清清楚楚，其其电电荷荷传传递递系系统统为为Asp102 His57Ser195（*一一级级结结构构较较远远但但空空间间位位置较近）置较近）l而而T（胰蛋白酶）具有与（胰蛋白酶）具有与ChT相同的催化部位。相同的催化
13、部位。lChT Gly障障碍碍小小，故故芳芳香香族族氨氨基基酸酸易易进进入入，因因此此水水解解芳香族氨基酸羧基形成的肽键芳香族氨基酸羧基形成的肽键lT Asp-则则易易结结合合带带正正电电的的氨氨基基酸酸，故故水水解解碱碱性性氨氨基酸羧基形成的肽键基酸羧基形成的肽键l酶活性部位的氨基酸组成直接影响其特异性，即酶活性部位的氨基酸组成直接影响其特异性，即二者结合部位不同。二者结合部位不同。本讲稿第十三页，共三十七页本讲稿第十四页，共三十七页l四、酶活性部位的研究四、酶活性部位的研究 l主主要要方方法法是是化化学学修修饰饰法法，其其它它方方法法包包括括反反应应动动力力学学法法、光光谱谱法法、X光光衍
14、衍射射法法（结结果可靠，但必须是晶体）。果可靠，但必须是晶体）。本讲稿第十五页，共三十七页l化学修饰法化学修饰法：l蛋蛋白白质质+化化学学试试剂剂反反应应引引起起某某些些氨氨基基酸酸残残基基或或某某些些基基团团的的共共价价的的化化学学改改变变即即化化学学修修饰饰。此此化化学学试试剂剂叫叫化化学学修修饰饰剂。剂。本讲稿第十六页，共三十七页l如如何何确确定定修修饰饰试试剂剂是是结结合合在在活活性性部部位位的的基基团团上上，而而不不是是结结合合到到活活性性部部位位以以外外的的基基团团上上呢呢？首首先先要要求求加加入入修修饰饰试试剂剂后后，酶酶计计量量失失活活（平平行行失失活活），其其次次还还要要根根
15、据不同的情况作进一步确定。据不同的情况作进一步确定。l计计量量失失活活：加加入入几几摩摩尔尔修修饰饰剂剂就就有有几几摩摩尔的酶尔的酶100%失活。失活。本讲稿第十七页，共三十七页l特殊基团特殊基团非特异性试剂非特异性试剂 l使用此种试剂要求使用此种试剂要求:l Y只能在活性部位中有，其它部位没有。只能在活性部位中有，其它部位没有。l例：木瓜蛋白酶有例：木瓜蛋白酶有7个个Cys，其中，其中6个形成个形成-S-S-；1个个Cys。lCys+碘乙酸碘乙酸 计量失活计量失活 l故故Cys在活性部位上。在活性部位上。l活活性性部部位位Y，由由于于活活性性部部位位微微环环境境的的影影响响反反应应灵灵敏敏度
16、度极高，此时非活性中心的极高，此时非活性中心的Y不与不与R结合。结合。l例例：RNA酶酶活活性性部部位位Lys41的的-NH2活活性性特特强强，可可被被氟氟二硝基苯特异标记。二硝基苯特异标记。本讲稿第十八页，共三十七页l具有上述二条件的酶极少，而我们要使用非特异性具有上述二条件的酶极少，而我们要使用非特异性试剂就必须用差示标记法。试剂就必须用差示标记法。l差示标记法差示标记法（加入保护剂）（加入保护剂）l非特殊基团非特殊基团非特异性试剂非特异性试剂lR*连接的基团即活性部位。连接的基团即活性部位。l保护效果：在保护过程中要避免下述两点保护效果：在保护过程中要避免下述两点:lP要要过过量量，防防
17、止止剩剩余余未未被被保保护护的的Y；保保护护后后构构象象变变化化导导致致Y-R解解离离。上上述述两两点点可可导导致致实实验验误误差差。前前两两种种标标记记均为共价标记。均为共价标记。本讲稿第十九页，共三十七页l亲和标记法亲和标记法l非特殊基团非特殊基团亲和试剂亲和试剂l根根据据酶酶和和底底物物的的结结合合特特性性来来设设计计底底物物即即特特异性试剂。异性试剂。l底物底物+可与活性部位结合的活性基团可与活性部位结合的活性基团亲和亲和试剂（特异性较强）试剂（特异性较强）lChTChT：水水解解芳芳香香族族氨氨基基酸酸羧羧基基所所形形成成的的肽肽键键或或酯酯键键，故故亲亲和和试试剂剂为为甲甲苯苯磺磺
18、酰酰-L-L-苯苯丙丙氨氨酸为基本结构。酸为基本结构。本讲稿第二十页，共三十七页本讲稿第二十一页，共三十七页lChT酶原酶原+TPCK不结合不结合lChT+8M脲脲+TPCK不结合不结合lChT+TPCK结合结合lTPCK结合部位必定是活性中心结合部位必定是活性中心lChT：有两个：有两个His残基，一级结构的残基，一级结构的40，57位。位。lChT+TPCK 酶酶水水解解分分析析氨氨基基酸酸组组成成只有一个只有一个His 确定确定TPCK结合的是另一结合的是另一His。l14C-TPCK+ChT水水解解发发现现14C存存在在于于His-57上上，确定确定TPCK与第与第57位的位的His结
19、合（即活性部位）结合（即活性部位）本讲稿第二十二页，共三十七页lT（胰胰蛋蛋白白酶酶）也也有有His，但但不不与与TPCK结结合合，说说明明T与与ChT有有不不同同的的底底物物专专一一性性，T水水解解碱碱性性氨氨基基酸酸羧羧基基所所形形成成的的酰酰胺胺键键或或酯酯键键。它它的的底底物物是是甲甲苯苯磺磺酰酰-L-L-赖赖氨氨酰酰胺胺（酯）（酯）lTLCK+T，最最后后找找出出与与TLCK结结合合的的氨氨基基酸是酸是His-46即活性部位。即活性部位。本讲稿第二十三页，共三十七页l其它方法：其它方法：l动动力力学学分分析析法法：若若在在不不同同的的pH条条件件下下，酶酶活活力力变变化化较较大大，而
20、而某某个个基基团团的的解解离离程程度度也也有有较大程度的改变，则此基团是活性部位。较大程度的改变，则此基团是活性部位。l光光谱谱学学法法：最最常常用用的的紫紫外外吸吸收收光光谱谱和和荧荧光光光光谱。谱。l蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有生生色色基基团团，当当底底物物结结合合时时，位位于于结结合合部部位位的的生生色色基基团团必必然然会会发发生生某某种种变变化化，比比较较底底物物结结合合前前后后光光谱谱学学的的变变化化，可可推推断活性部位。断活性部位。lX光衍射光衍射：X光衍射可直接看出活性部位光衍射可直接看出活性部位（即底物结合部位），但必须是结晶。（即底物结合部位），但必须是结晶。本讲稿第二十
21、四页，共三十七页第三节第三节 酶的催化机制酶的催化机制l我我们们已已经经了了解解到到酶酶之之所所以以能能加加速速化化学学反反应应，主主要要是是酶酶能能通通过过与与底底物物形形成成中中间间产产物物来来降降低低反反应应的的活活化化能能。不不同同的的酶酶其其催催化化机机制制是是有有差差别别的的，下下面面讨讨论论酶酶的的催催化化机机制制和和对对酶酶高效催化有贡献的主要因素高效催化有贡献的主要因素。本讲稿第二十五页，共三十七页l1、底物与酶的接近与定向效应、底物与酶的接近与定向效应l底底物物的的反反应应基基团团与与酶酶活活性性中中心心的的催催化化基基团团相相互互严严格格的的定定向向，使使得得活活性性中中
22、心心的的底底物物浓浓度度特特别别高高从从而而使使反反应应速速度度增增高高。研研究究发发现现提提高高酶酶反反应应速速度度的的最最主主要要方方法法是是使使底底物物分分子子进进入入酶酶的的活活性性中中心心区区域域，亦亦即即大大大大提提高高活活性性中中心心区区域域的的底底物物有有效效浓浓度度。除除此此之之外外，还还需需要要使使反反应应的的基基团团在在反反应应中中彼彼此此相相互互严严格格地地“定定向向”，反反应应物物分分子子才才被被作作用用，迅迅速速形形成成过过渡渡态态。见见轨道定向假设示意图。轨道定向假设示意图。本讲稿第二十六页，共三十七页本讲稿第二十七页，共三十七页l2、底物分子的敏感键产生张力或变
23、形、底物分子的敏感键产生张力或变形l许许多多酶酶的的活活性性部部位位开开始始与与底底物物并并不不相相适适应应，但但为为了了结结合合底底物物，酶酶的的活活性性部部位位不不得得不不发发生生相相应应变变化化（前前面面所所提提的的诱诱导导契契合合），以以适适应应底底物物。一一旦旦与与底底物物结结合合，酶酶分分子子中中某某些些基基团团可可使使底底物物分分子子的的敏敏感感键键中中电电子子云云密密度度部部分分的的增增加加或或减减少少从从而而产产生生“电电磁磁张张力力”使使底底物物发发生生变变形形，使使底底物物敏敏感感键键更更敏敏感感，更更易易于于反反应应。下下图图用用一一个个示示意意图图说说明明酶酶与与底底
24、物物结结合合，使使底底物变形生成产物的过程。物变形生成产物的过程。本讲稿第二十八页，共三十七页本讲稿第二十九页，共三十七页l3、共价催化作用、共价催化作用 l某某些些酶酶能能与与底底物物形形成成一一个个反反应应活活性性很很高高的的共共价价中中间间复复合合物物。底底物物只只需需越越过过较较低低的的活活化化能能就可以形成产物。此既为共价催化作用。就可以形成产物。此既为共价催化作用。l共共价价催催化化的的最最一一般般的的形形式式是是催催化化剂剂的的亲亲核核基基团团对对底底物物中中亲亲电电子子的的碳碳原原子子进进行行攻攻击击，亲亲核核基基团团含含有有多多电电子子的的原原子子，可可以以提提供供电电子子，
25、它它是是十十分分有有效效的的催催化化剂剂。酶酶反反应应中中可可以以进进行行共共价价催催化化的的、强强有有力力的的亲亲核核基基团团很很多多，酶酶蛋蛋白白分分子子上上至至少少就就有有三三种种，图图中中所所指指出出的的丝丝氨氨酸酸羟羟基基、半半胱胱氨氨酸酸巯巯基基及及组组氨氨酸酸的的咪咪唑唑基基。此此外外对对具具辅辅酶酶的的双双成成分分酶酶（复复合合蛋蛋白白质质）来来讲讲，其辅酶中往往还含有另外一些亲核中心。其辅酶中往往还含有另外一些亲核中心。本讲稿第三十页，共三十七页本讲稿第三十一页，共三十七页l4、酸碱催化、酸碱催化l这这里里指指的的是是广广义义的的酸酸碱碱催催化化。它它是是一一种种质质子子供供
26、体体及及质质子子受受体体的的催催化化，发发生生在在细细胞胞内内许许多多类类型型的的有有机机反反应应都都是是受受广广义义的的酸酸碱碱催催化化的的，如如将将水水加加到到羰羰基基上上、酯酯的的水水解解，从从双双键键上上脱脱水、各种分子重排及许多取代反应等。水、各种分子重排及许多取代反应等。l酶酶活活性性中中心心的的一一些些基基团团（氨氨基基、羧羧基基、酚酚羟羟基基、巯巯基基、咪咪唑唑基基等等）可可作作为为质质子子供供体体或或受受体体对对底底物物进进行行催催化化，从从而而加加快快反反应应速速度度。蛋蛋白质中可作为广义酸碱的功能基。白质中可作为广义酸碱的功能基。本讲稿第三十二页，共三十七页l其其中中组组
27、氨氨酸酸的的咪咪唑唑基基值值得得特特别别注注意意，因因为为它它既既是是一一个个很很强强的的亲亲核核基基团团，又又是是一一个个最最有有效效、最最活活泼泼的的广广义义酸酸碱碱功功能能基基。这这是是因因为为组组氨氨酸酸的的咪咪唑唑基基的的解解离离常常数数约约为为6.0，接接近近生生物物体体的的生生理理pH条条件件，此此时时它它一一半半是是酸酸形形式式、另另一一半半是是碱碱形形式式，既既可可以以作作为为质质子子供供体体、也也可可作作为为质质子子受受体体，而而且且研研究究发发现现它它供供出出和和接接受受质质子子的的速速度度十十分分迅迅速速，在在酶酶的的酸酸碱碱催催化化中中显显得得特特别别活活跃跃，而而因
28、因其其广广义义碱碱的的形形式式咪咪唑唑环环中中N原原子子上上有有未未共共享享的的电电子子对对，所所以以也也是是亲亲核核基基团团，可可进进行行共共价价催催化化作作用用。鉴鉴于于咪咪唑唑基基有有如如此此的的优优点点，虽虽然然组组氨氨酸酸在在大大多多数数蛋蛋白白质质中中含量很少，却很重要。含量很少，却很重要。本讲稿第三十三页，共三十七页本讲稿第三十四页，共三十七页l5、活性中心部位的微环境效应、活性中心部位的微环境效应l酶酶活活性性中中心心多多半半靠靠近近位位于于疏疏水水微微环环境境的的凹凹陷陷中中，疏疏水水环环境境中中介介电电常常数数较较低低，故故在在疏疏水水环环境境中中两两个个带带电电物物（底底
29、物物、酶中心）之间的作用力显著增加，从而使反应速度加快。酶中心）之间的作用力显著增加，从而使反应速度加快。l处处于于低低介介电电环环境境中中的的基基团团之之间间的的反反应应之之所所以以会会得得到到加加强强，主主要要是是因因为为介介质质的的电电荷荷常常数数是是反反映映介介质质影影响响极极性性基基团团间间相相互互作作用用力力的的一一种种常常数数，此此值值高高则则会会减减弱弱，此此值值低低则则起起加加强强作作用用。如如水水的的极极性性和和形形成成氢氢键键能能力力使使它它表表现现出出较较高高的的介介电电常常数数，它它可可以以在在离离子子外外形形成成定定向向的的溶溶剂剂层层，产产生生自自身身的的电电场场
30、，结结果果就就大大大大减减弱弱了了它它所所包包围围的的离离子子间间的的静静电电相相互互作作用用或氢键作用。或氢键作用。本讲稿第三十五页，共三十七页l对对各各种种各各样样的的酶酶来来讲讲，上上面面所所列列的的与与酶酶高高效效有有关关的的因因素素并并不不是是单单一一起起作作用用或或全全部部起起作作用用。人人们们在在研研究究酶酶的的活活性性中中心心和和作作用用原原理理时时，发发现现：不不同同的的酶酶，起起主主要要影影响响的的因因素素可可能能是是不不同同的的，各各自自都都有有其其特点，可以受一种或几种因素的影响。特点，可以受一种或几种因素的影响。本讲稿第三十六页，共三十七页作 业l请解释酶催化反应具有高效性的原因请解释酶催化反应具有高效性的原因本讲稿第三十七页，共三十七页